Summary
Vi beskriver en metode for å kvantifisere aggregering av misfolded proteiner. Våre protokollen detaljer lentiviral indusert stabil linje generasjon, automatisert AC confocal imaging og bildeanalyse av protein aggregater. Som en illustrasjon program studerte vi effekten av små molekyler å fremme SOD1 samling i en tid - og doseavhengig måte.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en dødelig nevrodegenerative sykdommer som kan være forårsaket av arvede mutasjoner i genet koding kobber-sink superoxide dismutase 1 (SOD1). Strukturelle ustabilitet i SOD1 og gjenkjennelse av SOD1-positive Inneslutninger i familiær-ALS pasienter støtter en potensiell kausale rolle for misfolded og/eller samlede SOD1 i ALS patologi. I denne studien beskrive vi utviklingen av et cellebasert analysen designet å kvantifisere dynamikken i SOD1 samling i levende celler av høyt innhold screening tilnærminger. Bruker lentiviral vektorer, generert vi stabil cellelinjer uttrykker vill-type og mutant A4V SOD1 merket med gult fluorescerende protein og fant at begge proteiner ble uttrykt i stoffer uten noen tegn på aggregering. Interessant, bare SOD1 A4V uttrykt stabilt i HEK-293, men i U2OS eller SH-SY5Y cellelinjer, dannet ikke tilslag på proteasome hemmer behandling. Vi viser at det er mulig å kvantifisere aggregering basert på dose-respons analyse av ulike proteasome hemmere, og å spore samlet-formasjon kinetics ved time-lapse mikroskopi. Vår tilnærming introduserer muligheten for å kvantifisere effekten av ALS mutasjoner rollen av SOD1 i samlet formasjonen samt screening for små molekyler som hindrer SOD1 A4V aggregering.
Introduction
Protein samling er en biologisk prosess som misfolded proteiner gruppe opp og kan fungere som forårsaker agenter i nevrodegenerative sykdommer (amyloidose). Karakterisere protein samling er viktig i forståelsen av mengdefunksjoner i mobilnettet dysfunction så vel som lette oppdagelsen av nye faktorer som påvirker utbruddet av patologi. Visualisering av fluorescens-merket proteiner i levende celler er en kraftig metode som kan hjelpe til i utviklingen av analyser gjelder for høyt innhold screening (HCS)1,2,3,4.
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) regnes som en proteopathic sykdom forårsaket av tilstedeværelsen av misfolded proteiner med tilbøyelighet til å samle og akkumuleres i motoriske nerveceller i både familiær ALS (fALS) og sporadiske ALS (sALS)5,6 . Et delsett av ~ 20% av fALS tilfeller er forbundet med dominerende mutasjoner i genet koding cytosolic antioksidant enzymet kobber-sink superoxide dismutase type 1 (SOD1)7,8. Flere mulige årsaker til denne genetisk avledede dysfunksjon er foreslått, inkludert endringer i strukturen og funksjonen SOD1 varianter som avvikende stabilitet, økt unfolding rente og tilbøyelighet til samlet9, 10. Spesielt den eneste bekreftede og potensielt giftig egenskapen delt av begge ALS knyttet SOD1 varianter og vill-type (WT) SOD1 er en økt tilbøyelighet til compartmentalized protein tilslag eller proteinaceous Inneslutninger11,12 . Misfolded mutant SOD1, er vedvarende polyubiquitinated og ved ubiquitin-proteasome systemet. Som et resultat, fører et lavt nivå av hemming av proteasome aktivitet til opphopning av mutant SOD1 samler13,14, som skjemaet amorfe strukturer består av løselig komponenter som kan utveksle med løselig mutant SOD1 i stoffer15. I spesielt SOD1 mutant A4V (alanin på codon 4 endret til Valin) er den vanligste ALS-forårsaker mutasjonen, og fører til rask neurodegeneration med en gjennomsnittlig overlevelse tid på mindre enn 2 år etter sykdommen utbruddet16. Biokjemisk, har SOD1 A4V økt tendens til monomerize, samle og danne amyloid porene; sine pore-lignende aggregater er like amyloid porene i andre sykdom knyttet mutant skjemaer, for eksempel α-synuclein og β-amyloid protein17. For å studere dynamikken i SOD1-samlet akkumulering, gjenstår metoder for å kartlegge løselig og uløselig SOD1 samlet skjemaer å bli utviklet.
Vi har tidligere vist, med live-celle imaging og HEK-293 celler transfekterte transiently med fluorescerende protein-merket SOD1, at ALS-assosiert mutasjoner svekke SOD1 dimerization og aggregering11. Selv om forbigående uttrykk systemer kan gi nyttig informasjon om biologiske utfallet av kortsiktige genet overuttrykte, kan metoder gir stabil integrering av ønsket gener bli foretrukket for analysen utvikling. Slik tilbud lentiviral vektorer evnen å konferere langsiktig og regulert genuttrykk pattedyrceller 18. I denne studien vi fokusert på generering av stabil cellelinjer transduced med rekombinant lentivirus bærer WT og mutant SOD1 merket med gult fluorescerende protein (YFP). Bruke live-celle tenkelig mikroskopi og automatisert kvantifisering av SOD1 aggregering, vi utløses og kvantifisert SOD1 aggregering hendelser på hemming av proteasome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lentivirus produksjon
Merk: produksjon og manipulering av lentiviral vektorer ble gjennomført i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for forskning innvolvere rekombinant DNA. Plasmider kodingen av vill-type og A4V mutant SOD1 merket med forbedret YFP (SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP) er beskrevet i Kim et al. 11 begge genet fusion produktene ble forsterket bruker PCR primer paret 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ og 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ og settes inn i pTRIP-deltaet U3 CMV plasmider 19 bruker XhoI og BsrGI begrensning nettsteder. I tidligere eksperimenter, var HEK-293T cellene delt i forholdet 1:4 til 1:6 annenhver dag. Unngåelse av mer enn 20 passasjer og vedlikehold av cellene på mindre 60% confluency bidrar til å sikre god transfection effektivitet.
- På dag 1, delt HEK-293T cellene på 30-40% samløpet i en 10 cm diameter vev kultur plate (3 x 10 6 celler/parabolen) i 10 mL av celle kultur medium (høy-glukose DMEM med 10% FBS og 4 mM L-glutamin) for virus produksjon.
- Holde 10 cm diameter vev kultur plate i en CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO 2) over natten.
- På dag 2, forberede en DNA transfection løsning som inneholder 10 µg lentiviral vektorer (pTRIP-deltaet U3 CMV - SOD1WT-YFP eller -SOD1A4V-YFP) sammen med den lentiviral emballasje plasmider (5 µg av pVSVg, 10 µg av pCMV-dR8.71) ( figur 2A) 20. legge til 125 µL av 1 M CaCl 2 og juster volumet til 500 µL med destillert vann. Forsiktig legge til 500 µL av 0,05 M HEPES inn i blandingen og ruge i 10 min ved romtemperatur.
- Erstatte HEK-293T celler medium med 10 mL forvarmes frisk kultur medium antibiotika uten blandet med 1 mL DNA transfection løsning og ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO 2.
- På dag 3, erstatte cellen supernatant med ferske kultur medium.
- På dag 4, høste nedbryting 15 mL tube og sentrifuge for 5 min på 500 x g å fjerne døde celler og rusk. Videre rense nedbryting av passerer det gjennom en 0,45 µm ved hjelp av en stor 60 mL sprøyte. Umiddelbart dispensere til engangs dele (300 µL), og lagre på-80 ° C. For å opprettholde maksimal produktet aktivitet, unngå en fryse-Tin syklus.
2. Lentiviral signaltransduksjon
- dele celle linjen er infisert på 60% samløpet (HEK-293 celler og SH-SY5Y, 5 x 10 5 celler per brønn og U2OS, 1 x 10 5 celler per brønn) i en 6-og vev kultur plate i 2 mL DMEM media med 10% FBS.
- Holde 6-og vev kultur plate i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2 natten.
- Fjern den frosne lentivirus fra-80 ° C fryseren og tine en aliquot på is før bruk, ikke refreeze.
- Mens viruset er tining, varme celle kultur mediet som inneholder serum kompatibel med cellen linje av interesse. Når viruset er fullt tint, forbereder en rekke fortynninger (1:3, 1:10, 1:30 og 1: 100) i DMEM i en fersk 1,5 mL microfuge tube.
- Ta opp volumet i rør til 1 mL med redusert serum media.
- Legge 2 µL av Polybrene (på et lager av 4 µg/µL) til 1 mL av virus/media. Bland godt av pipettering og tilsett 1 mL av blandingen til cellene. Inkuber cellene med viruset for 24 h.
- Fjerne virus media og erstatte med vanlig DMEM media med 10% FBS. Opprettholde cellene på 37 ° C, 5% CO 2.
- Overvåke veksten av celler og endre kultur media annenhver dag. Ved samløpet, utvide 6-vel rett til en 10 cm diameter vev kultur plate.
- Når cellene har blitt tilstrekkelig utvidet, frø 1,5 x 10 4 celler per brønn i 50 µL av DMEM media på 384-vel analysen platene du hvilket uttrykk i YFP merket protein av mikroskopi. Hvis YFP merket protein celle uttrykk viser signal-til-støy forholdet ≥ 3, forberede celle lager den tilsvarende cellen linjen.
3. Tid avhengig av effekten av proteasome hemmer på protein samlingen
Merk: utføre bildeopptak bruker en automatisert mikroskopet (se materialer).
- Dispensere 0,25 µL av DMSO eller proteasome hemmer oppløst i 100% DMSO (ALLN, 2 mM) på 384-vel flat bunnplater.
- Manuelt frø 1,5 x 10 4 celler per brønn i 50 µL av DMEM media på samme analysen plate. Proteasome hemmer (ALLN) endelig konsentrasjonen bør være 10 µM.
- Definere mikroskop miljøkontroll systemenheten 37 ° C og 5% CO 2. Et skjermbilde av eksperimentelle oppsett er vist i Figur 3.
- Opererer mikroskopet i bredt felt fluorescens modus, bruker programvaren med følgende innstillinger: LWD 20 X målet, ikke AC confocal modus, 4 felt/Vel, med en fange intervall av en time. På slutten av hvert løpe, bildene blir automatisk lastet opp til serveren.
4. Tid forfalle imaging YFP uttrykk i levende celler, og bildeanalyse (enkelt kanal)
Merk: trinnene nedenfor beskriver anvendelsen av programvaren (f.eks Columbus).
- Velg riktig algoritme til å segmentere de primære objektene (stoffer og aggregater). Eventuelt justere bakgrunn terskelen og kontrast parametere ( Figur 4).
- Telle celler ved hjelp ' finne celler ' med en individuell terskel 0,1 for YFP intensitet kanalen. Bestemme aggregater bruker en ' finne steder ' algoritmen med en relativ YFP spot intensitet > 0,2 og en splitting koeffisient 1,0.
5. Dosen svar effekten av proteasome hemmere på protein samling på levende celler farget for sine atomkjerner (to kanaler)
Merk: utføre bildeopptak bruker en automatisert mikroskop. Bestemmer konsentrasjon omfanget av proteasome hemmere (ALLN, Epoxomicin og MG132) basert på forventede IC 50 verdien til sikrer optimal kurve tilpasning.
- Forberede føljetong fortynninger av forbindelser på en 384-og lagring polypropylen plate av standard 1:3 fortynning serien. Sørg for å blande de sammensatte fortynninger også å sikre at de sammensatte konsentrasjonene er nøyaktig.
- Dispensere 0,25 µL av proteasome hemmere på tom flat bunn svart 384-vel analysen plater. Vi bruker en flytende hånd utstyrt med 384-kapillære hode dugelig av overfører volumer.
- Frø 1,5 x 10 4 celler per brønn i 50 µL av DMEM Media på analysen plater. Inkuber analysen platene på 37 ° C og 5% CO 2 for 24 h.
- Legge til 10 µL av DMEM Media (pre oppvarmet på 37 ° C) med flekk løsning (Hoechst 33342 på et lager av 10 mg/mL) og ruge ved romtemperatur for 10 min.
- Starte mikroertakle operativsystemprogramvare. Et skjermbilde av eksperimentelle oppsett er vist i figur 6. Velg den " konfigurasjon " Velg 20 X mål og hvilken riktig plate. Sikre " krage " er satt til den riktige verdien på målet slik at riktig fokus med forskjellige plate typer.
- Velg den " mikroskop " kategorien Definer eksponering 1 som YFP (488 laser) og eksponering 2 som Hoechst (405 laser). Aktivere filteret på begge eksponeringer og tilordne eksponering 1 til kamera 1 og eksponering 2 kameraet 2. Angi eksponering til ~ 800 ms for eksponering 1 og ~ 40 ms for eksponering 2.
- Velg eksponering 1. Sett fokus høyde til 0 µm. Velg " fokus ". Når fokusert, utsette kameraet 1. Justere fokus høyden å optimalisere eksponering flyet og klikk på " ta høyde ". Endre eksponeringstider og laser makt til å gi en maksimal pixel intensiteten av ~ 3000. Lagre eksponering. Gjenta for eksponering 2.
- Velg " eksperiment definisjon " kategorien Opprett en layout og sublayout. Dra og slipp relevante oppsettet, eksponering, referanseavbildningen, skewcrop filen og sublayout. Lagre eksperimentet.
- Velg " automatisk eksperimentet " kategorien og hente bilder. På slutten av hvert løpe, bildene blir automatisk lastet opp til serveren.
6. Bildeanalyse to kanalen bilder
- Velg programvare algoritmen til å segmentere de primære objektene (kjerner, stoffer og aggregater) ( figur 7).
- Velg metoden segmenter kjerner nøyaktig ved by visuell inspeksjon av segmentert objektene. Hoechst-farget objekter i kanal 1 (Ch1) brukes til å bestemme antall celler. Den YFP flekker fra mutant SOD1-A4V på kanal 2 (Ch2) brukes til å bestemme mengden av aggregater.
- Antall celler ved hjelp av den ' finne kjerner ' algoritme som Hoechst flekker områder > 20 µm 2, med en delt faktoren av 7.0, en individuell terskelen 0.40 og kontrast > 0.10.
- Opprette tabellen og bestemme EF 50 for hver av forbindelser med den ' ikke-lineær regresjon ' ligningen i grafisk programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generere stabil celle linje med lentivirus: Den generelle strategien for overvåking SOD1 protein aggregater er illustrert i figur 1. I et første skritt genereres vi en lentiviral uttrykk vektor SOD1 stabile gen levering til linjer (trinn 1). To lentiviral vektorer koding YFP-merket SOD1 WT og SOD1 A4V (SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP, henholdsvis) med pakking og konvolutt plasmider var forberedt (figur 2A). På lentiviral signaltransduksjon (trinn 2) cellen forble linjer testet (HEK-293, U2OS og SH-SY5Y) friske, viste høy uttrykk nivåer (figur 2B), og langsiktig YFP merking uansett skjemaet SOD1. Interessant, WT verken mutant SOD1 uttrykt i de tre linjene som viste synlig aggregering, i motsetning til forbigående uttrykk mobilnettet modellen tidligere testet11.
Validating stabile cellen linjer for SOD1 aggregering og studere dens dynamiske: Vil utløse SOD1 samlet formasjon på mobilnettet akkumulering av misfolded SOD1 mutant, vi brukte proteasome hemmer ALLN (også kalt calpain jeg og II hemmer; KI = 190 og 220 nM henholdsvis), tidligere godkjente bruker en forbigående SOD1 uttrykk mobilnettet modellen11. SOD1 samling ble undersøkt med HEK-293 og U2OS SH-SY5Y linjer transduced med SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP. Behandling med proteasome hemmer ALLN (10 µM) for 24 timer sterkt promotert akkumulering av SOD1A4V-YFP-aggregater i HEK-293 celler (figur 2C). Men ble ingen samling funnet i SOD1WT-YFP transduced linjer og svært lave nivåer av aggregering ble funnet i U2OS og SH-SY5Y linjer SOD1A4V-YFP transduced SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP (figur 2C). Basert på disse observasjonene, brukte vi time-lapse mikroskopi undersøke dynamiske av SOD1A4V-YFP aggregering dannelsen av proteasome hemming (trinn 3, Figur 3) og kvantifisere SOD1A4V-YFP samling med en enkelt YFP fluorescens kanal for å oppdage uttrykke celler og aggregat i levende celler (trinn 4, Figur 4). Cellene ble sådd i tilstedeværelse og fravær av ALLN, og overvåkes for en periode på 50 timer (figur 5A). Under vår eksperimentelle forhold fant vi samlet dannelsen av ALLN nådd et platå i 24 timer og stabilt over de neste 12 timene. Vi viser at cellen tetthet betydelig redusert etter 28 timer som følge av cytotoksiske effekten av ALLN, mens økt celle nummer i DMSO-behandlet negative eksperimentet.
Characterizing lite molekyl EC 50 for aggregering dannelse med SOD1 celle modell: Celler som uttrykker SOD1A4V-YFP ble behandlet på en doseavhengig måte med lite molekyl proteasome hemmere. Vi som en kjernefysisk markør merket SOD1A4V-YFP celle linjen, som er en fordel for samlet oppdagelsen i stoffer batterirommet. Siden hver celle inneholder en kjerne, segmentering kjerner og bruker dem som frø i vannskille segmentering av cellene, er faktisk cytoplasma segmentering forenklet21. Vi brukte Hoechst flekker, som er kjent for å ha ingen toksisitet når brukes for en kort sikt periode og lave konsentrasjoner22, forhold som ikke ble brukt i den tidligere tidsforløp imaging eksperiment. Etter 24 timer for cellen dyrking i nærvær av proteasome hemmere, var SOD1A4V-YFP celler farget med Hoechst løsning (10 µg/mL) for 10 min. Neste kjøpte vi fluorescens bilder for Hoechst og YFP ved hjelp av en 20 X 0,4 NA målsetting (trinn 5, figur 6). Bruker en algoritme for analyse av bildet som tar hensyn til celle kjerner og SOD1A4V-YFP distribusjon, ble celler analysert ved hjelp av image analyseprogramvare (trinn 6, figur 7). Hoechst-farget objekter viser riktig fluorescerende intensiteten ovenfor bakgrunn og morfologiske størrelse kjennetegner en kjerner (bredde, lengde og området) ble identifisert og klassifisert av bildesegmentering. Kjernefysisk masken fra Hoechst flekker ble brukt til å spore den proksimale SOD1A4V-YFP flekkfordeling innen celle cytosolic og bestemme tilstedeværelse eller fravær av aggregater. Basert på kjerner og flekker, ble forholdet aggregater oppdaget versus celler beregnet. For å bestemme følsomheten til analysen vår, vi neste kvantifisert samling av SOD1A4V-YFP HEK-293 cellene behandlet med tre ulike proteasome hemmere (ALLN, MG132 og epoxomicin) i en dose konsentrasjon måte som aktivert passende kvantifisert dataene og Vi beregnet EF50 verdiene i 6.53 ± 1.17, 0,17 ± 0,06 og 0,03 ± 0,03 µM for ALLN, MG132 og epoxomicin, henholdsvis (figur 8B). Relativ toksisitet for alle tre proteasome hemmere ble kvantifisert ved å måle antall tilhenger celler igjen i brønnen merket med Hoechst fargestoff. Vi fant at det totale celle nummeret tendens til å redusere svar på sammensatte effekter, som dokumentert av lignende EF50 verdiene i 6.58 ± 1.06, 0,19 ± 0,03 og 0,05 ± 0,01 µM for ALLN, MG132 og epoxomicin, henholdsvis.
Figur 1. Arbeidsflyt og tidslinjen for celle-line generasjon og høy innhold analyse (HCA) for protein aggregasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. SOD1 WT og A4V stabile linje generasjon.
(A) skjematisk diagram av lentiviral og emballasje vektorer (pakking og konvolutt plasmider) for wild type og mutant SOD1 A4V lentivirus generasjon. (B) valgte AC confocal bilder av tre celler (HEK-293, U2OS og SH-SY5Y) transduced med lentivirus wild type SOD1 (WT) og mutant SOD1 (A4V). (C) representant bilder av tre stabil celler behandlet for 24 timer med den proteasome inhibitor, ALLN (10µM). SOD1A4V-YFP-aggregater ble funnet for å være helt presentere (røde piler) i HEK-293, men tynt stede i U2OS eller SH-SY5Y celler. Bildene ble anskaffet ved hjelp av en 20 X-målet. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fire trinnene som kreves for bildeanalyser for aggregasjon bruker YFP kanalen for å oppdage celler og aggregat.
(1) importere bilder fra bilde lagring og analyse datasystemet. (2) velge "finne celler" for å telle celler. (3) Velg "Finn flekker" å bestemme aggregat. (4) Definer resultater basert på hver algoritme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Proteasome hemming fører til opphopning av SOD1A4V-YFP-aggregater i HEK-293 celler.
(A) valgt AC confocal bilder av SOD1A4V-YFP HEK-293-cellene behandlet med 10 µM av ALLN. (B) kvantitativ analyse av samlet formasjon indusert med ALLN (10µM) og celle teller i en tidsavhengige måte. Bildene ble anskaffet bruker et LWD 20 X mål hver 60 min. skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Skjermdump av eksperimentelle satt opp for to kanal oppkjøp (YFP og Hoechst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Fire trinnene som kreves for bildeanalyser av SOD1 aggregater og celler som er merket med YFP og Hoechst.
(1) input bilder fra bilde lagring og analyse datasystemet. (2) velge "Finn kjerner" for å telle celler. (3) Velg "Finn flekker" å bestemme aggregat. (4) Definer resultater basert på hver algoritme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Kvantitativ analyse av SOD1 A4V aggregering og doseavhengig proteasome hemmer konsentrasjon.
(A) presenterer her vi bildet og kvantifisering analysemetode for flekker og teller ved hjelp av Columbus bildet analyse systemet. Bilder tilsvarer to fluorescerende kanaler gjelder Hoechst (Ch1) og YFP (Ch2) anskaffet sekvensielt. Hoechst-farget objekter (venstre) ble identifisert av bildesegmentering. Kjernefysisk masken (midten) fra "finne kjerner" algoritmen ble brukt til å telle antall celler, etterfulgt av spot maske (høyre) "Finn flekker" algoritmen brukes til å oppdage aggregat. (B) Dose respons studiet av proteasome hemmere effekt på samlingen av mutant SOD1 A4V, som viser en variabel EF50 rangering fra 6.53 µM, ALLN, 0,17 µM for MG132 og 0,03 µM for Expoxomicin. Valgt AC confocal bilder av muterte SOD1 A4V behandlet proteasome på EF50 konsentrasjon. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to hovedfremgangsmåter for å generere stabil linjer. Først tar flere uker og krever forbigående transfection og motstand utvalg av genomisk integrert plasmider DNA vektorer. Andre tar noen timer ved hjelp av lentivirus, gjør denne protokollen mottakelig for effektiv uttrykket målet protein i flere linjer med begrenset innsats. TUR-CMV vektor19 var en vedvarende vektor å bruke, med bevarte signaltransduksjon effektivitet og stabil transgene uttrykk. Til vår overraskelse viste de tre linjene genereres ingen synlige aggregering av muterte SOD1, i motsetning til eksperimentelle protokollen basert på forbigående uttrykk beskrevet tidligere11. Det er sannsynlig at forbigående uttrykk favoriserer protein aggregering som den produserer høyere protein uttrykk i en relativt kort tidsperiode. Ved forbigående transfection når ubiquitin-proteasome systemet, som forringer et flertall av proteiner, et metningspunkt der kapasiteten å nedverdige samlet utsatt proteiner er fullt utnyttet. Men vi hevder at stabil linjer er mer sannsynlig å reprodusere fysiologiske situasjonen der proteiner uttrykkes på en relativt konstant nivå som svarer eliminering av misfolded protein via proteasome, autophagosome-lysosome, og exocytosis. Selv om primære hendelser som førte til ALS er fortsatt ukjent, er aldring i forbindelse med redusert aktivitet i ubiquitin proteasome system, en betydelig risikofaktor23. Som illustrert av våre mobilnettet analysen, fremmer proteasome hemming aggregering av misfolded protein (SOD1 A4V). Som skaper denne analysen ny opportunities å skjermen for små molekyl aktivator av autophagy signalering sti eller Anstandsdame nettverket. Faktisk denne avenue for Anstandsdame induksjon virker lovende, som illustrert i rapporten fra Kieran et al. viser at behandling med en co induser av varme sjokk respons ble funnet for å ha terapeutiske fordelene ved å utvide levetiden til SODG93A mus24.
Det er viktig å nevne at det er noen fallgruver å vurdere før du bruker denne analysen. Som med analysen optimalisering protokollen, fant vi at konsentrasjoner av DMSO på 1% eller over øker mener intensiteten av de målte YFP i analysen vår. Det er derfor viktig å redusere konsentrasjonen av DMSO til 0,5% å unngå alle slike gjenstanden. Videre linsen forstørrelsen og celle tetthet i analysen platen er viktig å vurdere for å optimalisere robustheten av analysen.
I vår studie, har vi vist at bruker et lentiviral system, SOD1A4V-YFP HEK-293 celle linjen er godt egnet for overvåking mutant SOD1 A4V samlet formasjon på induksjon av proteasome hemmere. Studiet av misfolded protein og samling er viktig for å forstå mekanismene av proteinopathies. Men forskningsverktøy for å analysere protein aggregering har blitt utvidet i de siste tiårene, kreves effektiv tilnærminger til å oppdage og kvantifisere aggregering skjermen molekyler som forbyr samlet formasjon. Dette arbeidet gir en detaljert protokoll for analysen utvikling og studier av protein aggregering. Forhåpentligvis, med støtte fra HCS, HCA og bruk av kjemiske eller CRISPR/siRNA biblioteker, dette arbeidet bør åpne nye veier for therapeutics eller roman målet oppdagelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning finansiert av koreanske regjeringen (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) og National Research Foundation av Korea (NRF) personlige forsker støtteprogrammet (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
