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Immunology and Infection

인간의 과발현과 정제 Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56430
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1,3, 2, 2,4, 2
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.

Abstract

Prenyltransferases (PT)는 다중 응축 반응을 통한 isopentenyl diphosphate (IPP) 를 사용하여 알릴이 인산의 사슬 연신을 촉매하는 효소 군입니다. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 ispenetenyl diphosphate (IPP)와의 다중 축합을 통한 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 연신을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT (축합 반응으로부터 cis 이중 결합을 형성 함)이다. DHDDS는 효소의 비 보존 적 돌연변이 (K42E)가 망막염 색소 침착 으로 이어 지므로 궁극적으로 실명으로 이끄는 생물 의학적으로 중요합니다. 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 대량의 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 최적화의 사용은 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. cis -PT의 상 동성은이 프로토콜이 천연 고무 합성에 관여하는 것과 같은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있음을 시사한다.

Introduction

Prenyltransferases 다중 축합 반응 1을 통해 아이소 펜 테닐 다이 포스페이트 (IPP)를 사용하여 알릴 포스페이트, 2 쇄 신장을 촉매하는 효소 군이다. E 형 효소 트랜스 이중 결합의 형성을 촉진하는 반면 3 Z 형 효소, 축합 반응, 시스 이중 결합의 형성을 촉매. -Prenyltransferases 시스 (시스 -PT, Z 형 효소) 고전 단 체인 (C 15), 중쇄 (C 50-55)에 자신의 제품의 사슬 길이에 따라 분류되며, 장쇄 (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 이소 펜 테닐 디 포스페이트 (IPP) 1을 이용한 다중 응축을 통해 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 신장을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT입니다, 5 , 6 . 이것은 dehydrodolichyl 포스페이트의 형성을 초래하는 dolichylpyrophosphate 전구체 N - 결합 글리코 실화 단백질 1에 관련된 글리코 캐리어 분자로서의 C 55-100 polyprenyl 인산. Ashkenazi 유태인 중, DHDDS에있는 missense 비 보존 적 돌연변이 (K42E)는 염색체 열성 색소 성 망막염을 초래합니다 7 , 8 . 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다.

Escherichia coli 는 재조합 단백질 발현을위한 가장 편리하고 비용 효율적인 숙주로 여겨지며, 따라서 가장 빈번하게 사용되는 숙주이기도합니다. 그러나 대장균 에서 이종성으로 단백질을 과발현 시키려 할 때, 단백질 특유의 고려가 이루어져야한다. 적절하게 접힌 상태에서 얻음대장균 으로부터의 재조합 단백질은 상이한 단백질의 독특한 특성으로 인해 단순한 문제가 아니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 수많은 접근법이 개발되었습니다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 - 최적화의 사용은 대장균 에서 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. 참고로, 단백질 융합하지 않고 효모 시스의 -PT를 과발현하는 이전 시도조차 세제 (12)의 존재에 불용성을 완료 할 예정 실패했습니다. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효과적이며 시간을 절약 할 수 있으며 기계 론적 연구에 적합한 DHDDS 준비를 얻을 수 있습니다. 서로 다른 종에서 cis -PT의 상 동성을 고려할 때,이 프로토콜은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있다고 제안한다.

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Protocol

1 . E. coli 에서의 과발현을위한 cis -PT의 클로닝

  1. 109aa thioredoxin (TRX) 단백질 17 과 융합 된 단백질 서열의 클로닝 및 고수준 발현을 위해 설계된 pET-32b 발현 벡터 및 대장균 코돈 최적화 된 전장 cis -PT 18 코딩 서열을 수득한다.
  2. TEV 프로테아제 짧은가요 성 링커 하였다 (담배 식각 바이러스 단백질 분해 효소) 절단 부위 ( "/"는 절단 점을 나타내는 ENLYFQ / G) 9 갖도록주의 시스의 상류 (SGSGSG을 절단 부위의 접근성을 향상시키기) -PT 서열 ( 도 1A ). 또한, 복제에 적합한 5 '및 3'제한 사이트를 추가하십시오.
  3. 표준 ligation 기술을 사용하여 합성 DNA 구조를 pET-32b 벡터에 클로닝하십시오 10 .

2. 지나치게 높은E. coli 에서의 인간 DHDDS의 절단

  1. 제조사의 지시에 따라 TRX- 융합 DHDDS 구조체로 대장균 T7을 형질 전환시킨다.
  2. 암피실린 선택 조건 (200 MG / L)하에 LB - 한천에 대한 제조 업체의 지침에 따라 형질 전환 세포를 플레이트.
  3. 100 밀리그램 / L의 암피실린과 250 ML 플라스크 스타터 문화의 LB 매체 100 ML에 선택한 식민지를 접종하고 200 rpm으로 일정한 흔들림과 37 ° C에서 하룻밤 incubate.
  4. 이 배양액 80 mL를 2 x YT 배지 (16 g / L 트립 톤, 10 g / L 효모 추출물, 5 g / L NaCl) 1.5 L가 각각 함유 된 2 개의 5 L 플라스크 (플라스크 당 40 mL) L 암피실린.
  5. OD 600 nm = 0.5에 도달 할 때까지 180 rpm으로 일정하게 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양합니다.
  6. 온도를 16 ° C로 낮추고 0.5 mM 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 세포를 유도하십시오. 범죄자단백질 발현을 위해 동일한 조건 하에서 16-20 시간 항온 처리한다.
  7. 원심 분리 (10,000 x g 10 분)에 의해 세포를 수확.
    참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. 세포 펠릿은 정화 때까지 -80 ° C에서 보관해야합니다.

삼 . 인간 DHDDS의 정제

  1. 버퍼 A (25 MM 트리스 - HCL, 산도 7.5, 150 MM NaCl, 0.1 % 트리톤 X - 100, 10 MM β - mercaptoethanol), 1 μg / ML DNase I, 그리고 프로 테아 제 억제제 혼합물에있는 세포를 Resuspend.
  2. 유리 - 테플론 균질기를 사용하여 세포를 균질화하십시오.
  3. 15,000 PSI 11 - 12,000 마이크로 플루 또는 상응하여 세포를 방해.
  4. 4 ° C에서 45 분 동안 40,000 xg에서 세포 용 해물을 원심 분리하십시오. 가용성 분획을 포함하는 상청액을 회수한다.
  5. 상층 액을 5 - 10 mL 코발트 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (Co 2+ -IMAC) 12 컬럼에 넣고 10이후에 완충액 A 및 10 mM 이미 다졸로 철저히 세척하여 비특이적 단백질 결합을 감소시켰다.
  6. 과잉 발현 된 단백질을 완충액 A로 250 mM 이미 다졸로 보충하십시오.
  7. 완충액 A로 평형화 된 53 mL 예비 탈염 칼럼을 사용하여 이미 다졸을 제거한다.
  8. 하룻밤 4 ° C에서 6xHis - 태그 TRX 융합 단백질을 제거하기 위해 용출 단백질에 6xHis 태그 TEV 프로 테아 제 (50mg 단백질 당 1mg TEV 프로 테아 제)를 첨가하십시오.
  9. cleaved 6x His - 태그 TRX 융합 단백질과 TEV 프로 테아 제를 제거하기 위해 5 MM 이미 다졸로 보충 버퍼 A와 함께 평형 Co 2 + -IMAC 컬럼에 절단 단백질을로드합니다.
  10. 30 kDa 분자량 차단 원심 분리 필터를 사용하여 3 ~ 4 mL로 유출액과 농축 물을 수집합니다.
  11. 최종 정제를 위해 버퍼 A로 평형화 된 superdex-200 크기 - 배제 크로마토 그래피 컬럼 상에 농축 된 단백질을 로딩한다. 단백질은 이량 체 (~ 76 kDa)로 용리됩니다. 컬럼 분석 곡선과 용출 프로파일을 비교하여 관련 분율을 선택하십시오.
  12. SDS-PAGE를 사용하여 준비의 순도를 평가하십시오.
  13. 다운 스트림 실험에 필요한 단백질 농도를 결정하고 사용하기 전까지 액체 질소에서 정화되고 농축 된 단백질의 플래시 동결 분취 량을 측정하고 -80 ° C에서 보관하십시오.

4. 분석적인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)

  1. 동결 융해 사이클을 견딜 수있는 단백질의 능력을 보장하기 위해 동결 단백질의 분량을 해동하고 21,000 x g 에서 10 분간 원심 분리하여 불용성 응집체를 제거합니다. 뜨는을 수집합니다.
  2. 상 단백질 넣 캅토-200 분석 컬럼 25 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 150 mM의 NaCl로 미리 평형, 0.02 % 트리톤 X-100, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 초 고성능 액체 크로마토 그래피 시스템 (13)을 사용하여, 14 .
  3. 트립토판 플루 오레 모니터scence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm)를 사용하여 단백질의 용출 프로필을 검출합니다. 분자량 평가를위한 올바른 보정 곡선을 가져야합니다. 이러한 곡선은 SEC 컬럼 제조업체 를 통해 구할 수 있습니다.

5. 효소 반응 속도론 - 시간 의존적 활동 15 , 16 , 17

  1. 정제 단백질의 활동을 보장하기 위해 10 μM FPP와 50 μM 14 C - IPP와 정제 DHDDS 5 μM을 섞어 22 - 30 ° C에서 0.5 MM MgCl 2 와 버퍼 A의 반응을 시작합니다.
    참고 : 정확한 반응 조건은 DHDDS와는 다른 cis -PT의 준비에 따라 다를 수 있습니다. 또한, DHDDS의 활성도는 온도와 [Mg 2+ ]에 따라 달라집니다.
    주의 : 14 C-IPP는 방사성 물질이므로 해당 지역의 방사선 안전 규정에 따라 사용해야합니다. 0, 2, 4 및 6 시간에 반응에서 15 μL 샘플을 철회 후, 15 밀리 버퍼 A 보충 20 MM EDTA (10 MM EDTA의 최종 농도)의 추가로 반응의 즉각적인 급냉 다음.
  2. H 2 O가 포화 된 1- 부탄올 1 mL를 넣고 충분히 소용돌이 칠하여 반응 생성물을 추출한다.
    참고 : 여기서 프로토콜을 중지하고 샘플을 나중에 읽을 수 있도록 보관할 수 있습니다.
  3. 샘플에 신틸레이션 칵테일을 넣고 신틸레이션 카운터를 사용하여 총 방사능을 나타내는 15 μL의 방사능과 함께 14 C를 포함하는 부탄올 단계의 반응 생성물을 정량하십시오.
  4. 각 시점에서 0 시간 샘플을 사용하여 측정 된 배경 판독 값을 뺀 후 14 C-IPP의 백분율을 계산합니다.
  5. 14 개의 이용 비율을 계산하여 각 시점에서의 네트 (14) C-IPP 혼입 계산 14 C-IPP 통합의 증가가 예상된다.

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Representative Results

여기에 사용 된 구조 및 정제 과정에 대한 일반적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 각 정제 단계에서 얻은 샘플을 그림 2 에 나타냈다 . 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여줌으로써 매우 정제 된 제품을 생성합니다. 도 3 은 정제 된 효소의 SEC 분석 결과로서, 단백질이 동종이 량체로만 ​​관찰된다는 것을 나타낸다. 그림 4 는 대표적인 시간 의존 활성 분석을 보여줍니다. 14 C-IPP 혼입은 6 시간 이상 명확하게 상승하여 정제 된 효소가 기능적임을 입증한다.

그림 1
그림 1 : 인간 DHDDS 클로닝 및 정제 . ( B ) 여기에 설명 된 인간 DHDDS 정화 프로토콜의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 인간 DHDDS의 정제 . 인간 DHDDS 친 화성 정제 단계의 SDS-PAGE 분석. 레인 1, 분자량 마커 (kDa); 레인 2, 조 추출물; 레인 3, Co2 + -IMAC 플로우 스루. 화살표는 TRX-DHDDS 융합 단백질을 나타내고; 레인 4, Co2 + -IMAC 용출액; 레인 5, 밤새 배양 후 단백질 -TEV 프로테아제 혼합물; 레인 6, TEV 절단 후 Co2 + -IMAC 플로우 스루; 레인 7, TEV 절단 후 Co2 + -IMAC 용출액; 레인 8, 정제 된 인간 DHDDS (indic화살표로 표시) 크기 배제 크로마토 그래피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 정제 된 인간 DHDDS의 분석 SEC. 트립토판 형광을 프로토콜에 기술 된대로 모니터링 하였다. 이 칼럼의 보정 곡선에 따르면, DHDDS는 호모 다이머 (homodimer) (77.4 kDa)를 형성합니다. 화살표는 보이드 볼륨을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : Ti나에게 의존적 인 인간 DHDDS의 활동. 10 μM FPP 및 50 μM 14 C-IPP를 기질로하는 반응에서 정화 된 인간 DHDDS의 시험 관내 활성은 단백질 당 IPP 혼입 (mol / mol)으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

E. coli 세포에서 기능성 인간 DHDDS를 정제하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 간단하고 효율적이어서 적절한 구조가 사용 가능 해지면 3-4 일 내에 단백질을 과발현하고 정제 할 수 있습니다. 단백질 정제를위한 그러한 프로토콜은 많은 질병 18 의 유전학에 관한 정보의 과다한 정보를 제공하는 게놈 시퀀싱의 돌파구를 고려할 때 특별한 의미가 있습니다. 따라서 단백질 수준 19 에서 병원성 메커니즘을 특성화하기위한 높은 처리량 방법의 개발이 필요합니다.

이종 단백질의 과발현과 정제에서 흔히 나타나는 함정을 극복하기 위해 여기에 몇 가지 조치가 취해졌으며, 이는 수용성 단백질과 기능성 단백질을 성공적으로 얻는 데 중요합니다. 첫째, DHDDS는 TRX 융합체로서 과발현되었다. TRX는 융합 단백질 폴딩을 촉진하고 융합 단백질 용해도를 증가 시켜서 포유 동물 b조형물 20 . 다음으로, 단백질 수율을 증가시키기 위해, DNA 작 제물은 대장균 21 에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 마지막으로, 상기 봉입체 형성의 가능성을 줄이기 위해, 단백질의 발현 가능성 22 단백질 폴딩을 돕는 단백질 합성 속도를 천천히 16 ℃로 유도 하였다.

고려 다른 종 사이 시스 -PT의 상 동성을 가지고 가서, 우리는이 프로토콜은 다른 진핵 시스에 적용 할 수 있음을 -PT뿐만 아니라 1 건의한다. 현재의 프로토콜을 출발점으로 사용하고 DHDDS 발현에 중요한 일반 지침이 주어지면,이 방법은 다른 cis -PT의 최적 발현을 위해 변형 될 수 있습니다. 예를 들어, 다른 융합 파트너 (예 : 말 토스 결합 단백질)를 시도하거나 연구 할 특정 단백질에 대한 배양 조건을 최적화 할 수 있습니다.

<생물학적 및 생물 공학적 중요성 1 , 7 , 8을 사용하여 다량의 정제 된 기능성 DHDDS를 다른 cis -PT와 함께 사용하여 구조적 및 기능적 특성 분석을 가능하게하는 설명 된 프로토콜의 향후 사용법 . 예를 들어, DHDDS에 대한 분자 연구를 통해 DHDDS 관련 망막염 의 기전을 해결할 수 있으며 잠재적으로 새로운 치료법을 개발하고 개발할 수 있습니다. 또한, 원핵 생물 cis -PT가 세균 벽 합성에 관여하므로,이 효소 군은 잠재적으로 새로운 항균제의 새로운 표적을 형성한다. 실제로, 진핵 및 원핵 효소 연구의 철저한 특성 분석은 원핵 세포 cis- PT에 대해 선택적 인 항균제의 합리적인 개발을 가능하게 할 수있다. 마지막으로 천연 고무가 합성됨에 따라 by의 cis -PT 제품군에 속하는 경우, 여기에 기술 된 접근 방식은 천연 고무 산업 합성에서 미래의 용도를 발견 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 이스라엘 과학 재단 재단 연구 센터 (I-CORE)의 구조 세포 생물학 (1775/12)과 이스라엘 과학 재단 보조금 (1721/16과 2338/16) (YH)과 825/14 (DK ). DK에 대한 Fields Estate Foundation의 지원은 높이 평가됩니다. 이 연구는 Ilan Edri와 Michal Goldenberg가 Tel Aviv University의 Sackler 의학부의 MD 논문 요구 사항을 부분적으로 이행함으로써 수행되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

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References

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