Summary
Un semplice protocollo di sovraespressione e di purificazione della cis -preniltransferasi umana ottimizzata dal codone, in condizioni non denaturanti, da Escherichia Coli , è stato descritto, insieme ad un test enzimatico di attività. Questo protocollo può essere generalizzato per la produzione di altre proteine di cis- preniltransferasi in quantità e qualità adatte agli studi meccanici.
Abstract
Prenyltransferasi (PT) sono un gruppo di enzimi che catalizzano l'allungamento della catena del difosfato alilico utilizzando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple. DHDDS (dehydrodolichyl difosfate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica (che forma cis doppie legame della reazione di condensazione) che catalizza l'allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS è di importanza biomedica, in quanto una mutazione non conservatrice (K42E) nell'enzima provoca la retinite pigmentosa , portando alla fine alla cecità. Pertanto, questo protocollo è stato sviluppato per acquisire grandi quantità di DHDDS purificate, adatte a studi meccanici. Qui, l'uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e l'ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l'eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in
Introduction
Prenyltransferasi sono un gruppo di enzimi che catalizzano l'allungamento della catena del difosfato allilico usando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple 1 , 2 . Gli enzimi di tipo Z catalizzano la formazione di doppie legami cis dalla reazione di condensazione, mentre gli enzimi E-tipo catalizzano la formazione di doppio legame trans 3 . Cis -Prenyltransferases ( cis -PT, Z-type enzymes) sono classificati in modo classico in base alla loro lunghezza della catena di prodotti in catena a catena corta (C 15 ), catena media (C 50-55 ) e catena lunga (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica che catalizza l'allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosfato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP) 1, 5 , 6 . Ciò si traduce nella formazione di deidrodolicilidifosfato, un polifenilcarbossilico di C 55-100 che serve come precursore per il dolichilpirofosfato, la molecola vettore del glicosilico coinvolto nella glicosilazione della proteina N-collegata 1 . Tra gli ebrei di Ashkenazi, una mutazione non-conservativa missense (K42E) in DHDDS produce una retinite pigmentosa autosomica recessiva 7 , 8 . Pertanto, il presente protocollo è stato sviluppato per acquisire DHDDS purificati idonei per studi meccanistici.
Escherichia coli è considerato l'host più conveniente e conveniente per l'espressione di proteine ricombinanti, ed è pertanto anche l'host più utilizzato. Tuttavia, quando si tenta di esercitare eterosamente le proteine in E. coli , occorre fare considerazioni proteiche. Ottenere piegato correttamente, attivareE proteine ricombinanti da E. coli , non è una materia semplice a causa delle proprietà distinte di diverse proteine. Numerosi approcci sono stati sviluppati per superare questi ostacoli. Qui, l'uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l'eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in E. coli . Da notare, un precedente tentativo di sovraespressione del lievito cis -PT senza fusione di proteine non è riuscito a causa della completa insolubilità anche in presenza di detersivo 12 . Il protocollo descritto è semplice, conveniente, risparmio di tempo e consente di ottenere preparati DHDDS idonei per studi meccanici. Data l'omologia del cis- PT tra diverse specie, suggeriamo che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici.
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Protocol
1. Clonazione di cis -PT per sovraespressione in E. coli
- Ottenere pET-32b vettore di espressione, progettata per il clonaggio e di alto livello di espressione di sequenze di proteina fusa con la 109aa tioredossina (TRX) proteina 17, ed E. coli codone ottimizzato 18 sequenza codificante di intera lunghezza -PT cis.
- Aver cura di avere un TEV-proteasi (tabacco virus etch proteasi) cleavage site (ENLYFQ / G, dove "/" indica il punto di scissione) 9 seguito da una breve linker flessibile (SGSGSG, che permettono di migliorare sito di scissione accessibilità) a monte dei cis -PT sequenza ( Figura 1 A ). Inoltre, aggiungere siti di restrizione 5 'e 3' per la clonazione.
- Clonare il DNA costruito sintetizzato nel vettore pET-32b utilizzando tecniche standard di legatura 10 .
2. OverexpreSsion di DHDDS umani in E. coli
- Trasformare le cellule competenti di E. coli T7 con il TRD-fusion DHDDS conforme alle istruzioni del produttore.
- Piattare le cellule trasformate secondo le istruzioni del produttore su LB-agar in condizioni selettive di ampicillina (200 mg / L).
- Inoculare le colonie selezionate in 100 ml di mezzo LB in colture di avviamento a fiale di 250 ml con ampicillina da 100 mg / L e incubare per una notte a 37 ° C con scossa costante a 200 giri / min.
- Inoculare 80 ml di coltura in due fiale da 5 L (40 ml per pallone), ognuno contenente 1,5 L di mezzo 2x YT (16 g / L di tryptone, 10 g / L di estratto di lievito, 5 g / L di NaCl) con 100 mg / L ampicillina.
- Incubare la coltura a 37 ° C con scossa costante a 180 giri / min fino a raggiungere OD 600 nm = 0,5.
- Abbassare la temperatura a 16 ° C e indurre le cellule aggiungendo 0.5 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). controIncubare in condizioni uniformi per 16-20 h per l'espressione proteica.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione (10.000 x g per 10 min).
Nota: il protocollo può essere interrotto qui; Le pellicole delle cellule devono essere mantenute a -80 ° C fino alla purificazione.
3. Purificazione di DHDDS umane
- Resuspendere le cellule nel tampone A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetanolo), 1 μg / ml DNasi I e una miscela di inibitori della proteasi.
- Homogenizzare le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro in teflon.
- Distruggere le cellule utilizzando un microfluidizzatore o un equivalente a 12.000 - 15.000 psi 11 .
- Centrifugare la lisi cellulare a 40.000 xg per 45 minuti a 4 ° C. Recuperare il surnatante, contenente la frazione solubile.
- Caricare il supernatante su una colonna di cromatografia con affinità metallica immobilizzata di cobalto da 5-10 ml (Co 2+ -IMAC) 12 colonna con 10MM imidazolo, seguito da un lavaggio approfondito con tampone A e 10 mM imidazolo per ridurre la legame delle proteine non specifiche.
- Eluire le proteine sovrapresse con tampone A integrato con 250 mM imidazolo.
- Rimuovere l'imidazolo usando una colonna di disintegrazione preparativa da 53 ml equilibrata con il tampone A.
- Aggiungere proteasi TEV a 6xHis (1 mg TEV proteasi per 50 mg proteina) alle proteine eluite per rimuovere la loro proteina di fusione TRX a 6xHis a 4 ° C per una notte.
- Caricare le proteine cedute su una colonna Co2 + -IMAC, equilibrata con un tampone A integrato con 5 mM imidazolo, per rimuovere la proteina fusione TRX tagliata a 6x His-contrassegnata e TEV proteasi.
- Raccogliere il flusso e concentrarlo a 3 - 4 ml utilizzando un filtro centrifugo di taglio di peso molecolare di 30 kDa.
- Caricare la proteina concentrata su una colonna di cromatografia di esclusione di dimensioni superdex-200 equilibrata con il tampone A per la purificazione finale. La proteina eluisce come dimero (~ 76 kDa). Selezionare le frazioni rilevanti confrontando il profilo di eluizione con una curva di calibrazione della colonna.
- Valutare la purezza del preparato usando SDS-PAGE.
- Determinare la concentrazione proteica necessaria per la sperimentazione a valle e le aliquote di flash-freeze di proteine purificate concentrate in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino all'uso.
4. Cromatografia analitica di esclusione di dimensioni (SEC)
- Per garantire la capacità della proteina di sopportare i cicli di congelamento e disgelo, scongelare una aliquota delle proteine congelate e centrifugare a 21.000 x g per 10 minuti per rimuovere gli aggregati insolubili. Raccogliere il surnatante.
- Caricare le proteine su una colonna analitica superdex-200 pre-equilibrata con 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetanolo utilizzando un sistema di cromatografia liquida a ultrasuoni 13 , 14 .
- Monitor di triptofano fluoro(Λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) per rilevare il profilo eluente di eluizione delle proteine. Assicurarsi di avere una curva di calibrazione valida per la valutazione del peso molecolare - tali curve sono disponibili tramite i produttori di colonna SEC.
5. Kinetica enzimatica - Attività dipendente dal tempo 15 , 16 , 17
- Per garantire l'attività della proteina purificata, mescolare 5 uM di DHDDS purificati con 10 FPP pM e 50 pM 14 C-IPP per iniziare la reazione in tampone A con 0,5 mM MgCl 2 a 22 - 30 ° C.
Nota: le condizioni di reazione esatta possono variare con le preparazioni di cis -PTs diverse da DHDDS. Inoltre, l'attività di DHDDS dipende anche dalla temperatura e da [Mg 2+ ].
Attenzione: 14 C-IPP è radioattivo e deve essere utilizzato in conformità alle normative locali in materia di sicurezza delle radiazioni. Ritirare 15 μl di campioni dalla reazione a 0, 2, 4 e 6 h, dopo la tempra immediata della reazione mediante l'aggiunta di 15 μl di tampone A integrato da 20 mM di EDTA (a una concentrazione finale di 10 mM EDTA). - Aggiungere 1 ml di 1-butanolo saturo di H 2 O e vorticarsi accuratamente per estrarre i prodotti di reazione.
Nota: il protocollo può essere fermato qui e i campioni possono essere conservati per una lettura successiva. - Aggiungere un cocktail di scintillazione ai campioni e, utilizzando un contatore di scintillazione, quantitate i prodotti di reazione nella fase di butanolo che comprendono 14 C, insieme alla radioattività di 15 μL dalla miscela di reazione, rappresentando la radioattività totale.
- Sottrarre le letture di fondo misurate utilizzando i campioni di 0 h da ogni punto temporale e calcolare il percentuale di 14 C-IPP utilizzati.
- Calcola l'incorporazione netta 14 di C-IPP ad ogni punto temporale calcolando il percentuale utilizzato dal totale 14 14 C-IPP con il tempo.
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Representative Results
Panoramica generale del costrutto qui impiegato e del processo di purificazione sono mostrati in Figura 1 . I campioni ottenuti ad ogni passo di purificazione sono mostrati in Figura 2 . Questa analisi SDS-PAGE mostra la purificazione graduale di DHDDS, determinando un prodotto altamente purificato. La Figura 3 mostra i risultati della SEC analitica dell'enzima purificata, rivelando che la proteina è osservata solo come un omodimero. La figura 4 mostra un esemplare di attività dipendente dal tempo. 14 L' incorporazione di C-IPP sale chiaramente in 6 ore, verificando che l'enzima purificato sia funzionale.
Figura 1: Clonazione e purificazione umana DHDDS . (
Figura 2: Purificazione di DHDDS umane . Analisi SDS-PAGE di passi di purificazione affinità DHDDS umani. Lane 1, marcatore a peso molecolare (kDa); Corsia 2, estratto grezzo; Corsia 3, flusso di passaggio Co2 + -IMAC. La freccia indica la proteina di fusione TRX-DHDDS; Corsia 4, eluato Co2 + -IMAC; Cella 5, proteina-proteina TEV dopo l'incubazione di una notte; Corsia 6, Co 2+ -IMAC flusso attraverso la scissione TEV; Corsia 7, eluato Co2 + -IMAC dopo la scissione TEV; Corsia 8, DHDDS umano purificato (indicSeguito da una freccia) a seguito della cromatografia di esclusione di dimensioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: SEC analitica di DHDDS umane purificate. La fluorescenza della triptofano è stata monitorata come descritto nel protocollo. Secondo la curva di taratura di questa colonna, DHDDS forma un homodimer (77,4 kDa). La freccia indica il volume void. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : TiAttività dipendente da me DHDDS umane purificate. L' attività in vitro di DHDDS umane purificate nella reazione con 10 μM FPP e 50 μM di 14 C-IPP come substrati viene espressa come incorporazione di IPP per proteina (mol / mol). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto per la purificazione di DHDDS umane funzionali nelle cellule E. coli è semplice ed efficace, permettendo uno di sovraespressione e purificazione della proteina in 3 - 4 giorni una volta che sia disponibile un opportuno costrutto. Tali protocolli per la purificazione della proteina sono di particolare importanza data le innovazioni nel sequenziamento genomico, che hanno fornito una grande quantità di informazioni riguardanti la genetica di molte malattie 18 , richiedendo dunque lo sviluppo di metodi ad alto rendimento per caratterizzare meccanismi patogeni a livello proteico 19 .
Per superare le insidie comuni nella sovraespressione e purificazione della proteina eterologa, sono state prese diverse misure, che sono fondamentali per ottenere con successo proteine solubili e funzionali. In primo luogo, DHDDS è stato sovraespresso come fusione TRX. TRX facilita la piegatura della proteina di fusione e aumenta la solubilità della proteina di fusione, impedendo l'inclusione bFormazione ody 20 . Successivamente, per aumentare la resa proteica, il DNA è stato codon ottimizzato per l'espressione in E. coli 21 . Infine, per ridurre ulteriormente la probabilità di formazione dell'organismo di inclusione, l'espressione della proteina è stata indotta a 16 ° C per rallentare il tasso di sintesi della proteina, probabilmente assistendo la piegatura di proteine 22 .
Tenendo in considerazione l'omologia del cis -PT tra diverse specie, suggeriamo che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici 1 . Utilizzando il protocollo corrente come punto di partenza e dato le linee guida generali critiche per l'espressione di DHDDS, questo metodo può essere modificato per un'espressione ottimale di differenti cis -PTs. Ad esempio, si possono tentare diversi partner di fusione (come la proteina legante di maltosio) o ottimizzare ulteriormente le condizioni di coltura per la proteina specifica da studiare.
<Con il loro significato biomedico e biotecnologico 1 , 7 , 8 , il futuro utilizzo del protocollo descritto per ottenere grandi quantità di DHDDS funzionali purificate, insieme ad altri cis -PT, permettendo di perseguire la loro caratterizzazione strutturale e funzionale . Ad esempio, ulteriori studi molecolari di DHDDS risolveranno i meccanismi alla base della pigmentosa della retinite correlata a DHDDS, potenzialmente che portano alla scoperta e allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Inoltre, poiché i cis -PT prokaryotici sono coinvolti nella sintesi della parete batterica, questo gruppo di enzimi potenzialmente forma nuovi obiettivi per nuovi agenti antibatterici. Infatti, una caratterizzazione approfondita degli studi sugli enzimi eucariotici e prokaryotici può consentire lo sviluppo razionale di farmaci antimicrobici selettivi per il cis -PT prokaryotico. Infine, come si sintetizza la gomma naturale bI membri della famiglia cis -PT, l'approccio qui descritto può trovare un uso futuro nella sintesi industriale di gomma naturale.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Centro per la Ricerca Eccellenza (I-CORE) della Fondazione Israel Science in Biologia Cellulare Strutturale (1775/12) e dalle sovvenzioni della Fondazione Israelica Science 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). Il supporto della Fondazione Fields Estate a DK è altamente apprezzato. Questo lavoro è stato eseguito da Ilan Edri e Michal Goldenberg in parziale adempimento dei requisiti di tesi MD della Facoltà di Medicina Sackler, Università di Tel Aviv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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