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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

ओवेरेक्स्पेशन एंड हेरिंग ऑफ ह्यूमन Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56430
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1,3, 2, 2,4, 2
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

Overexpression और कोडोन अनुकूलित, मानव सिस -prenyltransferase की शुद्धि के लिए एक सरल प्रोटोकॉल, गैर denaturing शर्तों के तहत, Escherichia से कोली , एक एंजाइमेटिक गतिविधि परख के साथ, वर्णित है। इस प्रोटोकॉल को अन्य सीआईएस- पे्रेनिल्रांसफेरेज प्रोटीन के उत्पादन के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जो यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयुक्त मात्रा और गुणवत्ता में है।

Abstract

Prenyltransferases (पीटी) एंजाइमों का एक समूह है जो कई संक्षेपण प्रतिक्रियाओं के माध्यम से आईओपेंटेनिऑल डिफोस्फेट (आईपीपी) का उपयोग करते हुए एलिलिसीक डीफोसफेट की श्रृंखला बढ़ाव उत्प्रेरित करता है। डीएचडीडीएस (डीहाइड्रोडोलिचिल डीफोसफेट सिंथेस) एक यूकेरियोटिक लंबे-सीन सीआईएस -पीटी (संघनन प्रतिक्रिया से सीआईएस डबल बॉन्ड बनाने) है जो कि आईओपेंटेनिइल डिफोस्फेट (आईपीपी) के साथ कई संघनन के माध्यम से फेर्नसील डिफोफेट (एफपीपी, एक एलिलिसीक डीफोसफेट) की चेन बढ़ाव को उत्प्रेरित करता है। डीएचडीडीएस बायोमेडिकल महत्व का है, जैसे गैर-रूढ़िवादी उत्परिवर्तन (के 42 ई) में रेटिनाइटिस पगमेन्टोसा में एंजाइम के परिणाम, अंततः अंधापन हो जाता है। इसलिए, यांत्रिक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए विकसित किया गया था ताकि बड़े पैमाने पर शुद्ध डीएचडीडी प्राप्त हो सके, जो यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो। यहां, प्रोटीन संलयन, अनुकूलित संस्कृति परिस्थितियों और कोडोन-अनुकूलन के उपयोग को कार्यात्मक रूप से सक्रिय मानव डीएचडीडीएस में अत्यधिक विषमता और शुद्धि की अनुमति देने के लिए उपयोग किया गया था सीआईएस- पीटी के समरूपता से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल को अन्य यूकेरियोटिक सीआईएस- पीटी के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे प्राकृतिक रबर संश्लेषण में शामिल लोगों के रूप में।

Introduction

Prenyltransferases एंजाइमों का एक समूह है जो कई संक्षेपण प्रतिक्रियाओं 1 , 2 के माध्यम से आइसोपेंटेनिइल डिफोस्फेट (आईपीपी) का उपयोग करते हुए एलिलिसीक डीफोसफेट की श्रृंखला बढ़ाव उत्प्रेरित करता है। Z- प्रकार एंजाइम कंडेनसेशन प्रतिक्रिया से सीआईएस डबल बॉन्ड के गठन को उत्प्रेरित करते हैं, जबकि ई-टाइप एंजाइम ट्रांस डबल बांड गठन 3 उत्प्रेरित करते हैं। सीआईएस -पीनिल ट्रांस्फेरेसेस ( सीआईएस- पीटी, जेड-टाइप एंजाइम) को वर्गीकृत अपने उत्पाद श्रृंखला लंबाई के अनुसार शॉर्ट-चेन (सी 15 ), मध्यम-श्रृंखला (सी 50-55 ), और लंबी श्रृंखला (सी 70-120 4 ) डीएचडीडीएस (डीहाइड्रोडोलिचिल डिफोसफेट सिन्थेस) एक यूकेरियोटिक लंबे-सीन सीआईएस -पीटी है जो एनोपेंटेनिइल डिफोस्फेट (आईपीपी) 1 के साथ कई कंडेनसेज के माध्यम से फेर्नसील डिफोस्फेट (एफपीपी, एक एलिलिसीक डीफोहोसेट) की चेन बढ़ाव को उत्प्रेरित करता है, 5 , 6 इसका परिणाम डीहाइड्रोडोलिचिल डिफोसाइट के गठन में होता है, एक सी 55-100 पॉलीपेरेन डाइफोसाफेट, डोलिचिलप्रोफॉस्फेट के लिए अग्रदूत के रूप में सेवा कर रहा है, एन-लिंक्ड प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन 1 में शामिल ग्लाइकोसिल वाहक अणु। एश्केनाज़ी यहूदियों के बीच, डीएचडीडीएस के परिणाम में गैर-रूढ़िवादी उत्परिवर्तन (के 42 ई) के परिणामस्वरूप आटोसॉमल अपैसिव रेटिनिटिस पगमेंटोसा 7 , 8 में परिणाम होता है। इसलिए, यांत्रिक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए विकसित किया गया था ताकि उचित डीएचडीडी को यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयुक्त बनाया जा सके।

Escherichia कोलाई पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सबसे सुविधाजनक और लागत प्रभावी मेजबान माना जाता है, और इसलिए यह सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया मेजबान है। हालांकि, जब ई। कोलाई में अतिरंजित रूप से अतिप्रभावी प्रोटीन का प्रयास करता है, प्रोटीन-विशिष्ट विचार किया जाना चाहिए। ठीक से मुड़ा हुआ, सक्रियई । कोलाई से पुनः संयोजक प्रोटीन, विभिन्न प्रोटीनों के विशिष्ट गुणों के कारण एक साधारण मामला नहीं है। इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं यहां, ई। कोलाई में कार्यात्मक रूप से सक्रिय मानव डीएचडीडीएस के अतिवृद्धि और शुद्धि की अनुमति देने के लिए प्रोटीन संलयन, अनुकूलित संस्कृति परिस्थितियों और कोडोन-अनुकूलन का उपयोग किया गया था। नोट, डिटर्जेंट 12 की उपस्थिति में भी अस्थिरता को पूरा करने के कारण प्रोटीन संलयन के बिना खमीर सीआईएस- पीटी के अति पिछड़ने की कोशिश में असफल रहा। वर्णित प्रोटोकॉल सरल, लागत प्रभावी, समय बख़्तरबंद है और एक को तंत्रिकी अध्ययन के लिए उपयुक्त DHDDS की तैयारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। विभिन्न प्रजातियों में सीआईएस- पीटी के अनुरूपता को देखते हुए, हम सुझाव देते हैं कि इस प्रोटोकॉल को अन्य यूकेरियोटिक सीआईएस- पीटी के लिए भी लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1 ई। कोलाई में ओवरेक्प्रेसियन के लिए सीआईएस- पीटी के क्लोनिंग

  1. पीएटी -32 बी एक्सप्रेशन वेक्टर को प्राप्त करें, जो क्लोनिंग और प्रोटीन अनुक्रमों की उच्च-स्तरीय अभिव्यक्ति के लिए तैयार की गई है जिसे 109aa थायरेडॉक्सिन (टीआरएक्स) प्रोटीन 17 और ई कोलाई कोडन-अनुकूलित 18 डिग्री कोड पूर्ण-लंबाई सीआईएस -पीटी के साथ जोड़ा गया है।
  2. टीआईवी-प्रोटीज़ (तंबाकू एंच वायरस प्रोटीज) क्लीवेज साइट (एनवाईआईएफक्यू / जी, जहां "/" क्लेविज प्वाइंट इंगित करता है) 9 के लिए सावधानी बरतें, उसके बाद एक छोटा लचीला लिंकर (एसजीएसजीएसजी, क्लेविज साइट पहुंच को बढ़ाने के लिए) सीआईएस की अपस्ट्रीम -पीटी अनुक्रम ( चित्रा 1 ए )। इसके अलावा, क्लोनिंग के लिए उपयुक्त 5 'और 3' प्रतिबंध साइटें जोड़ें।
  3. संश्लेषित डीएनए को क्लोन करें पीईटी -32 बी वेक्टर में मानक बंधन तकनीक का उपयोग करना 10 ।

2 Overexpreई। कोलाई में मानव डीएचडीडीएस के एसएसियन

  1. ट्रांसफ़ॉर्म ई। कोलाई टी 7 एक्सप्रेस के साथ सक्षम कोशिकाओं को टीआरएक्स-फ्यूजन डीएचडीडीएस निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया गया है।
  2. एम्बीसीलिन की चयनात्मक परिस्थितियों (200 मिलीग्राम / एल) के अंतर्गत एलबी-अगर पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार परिवर्तित कोशिकाओं को प्लेट।
  3. 100 एमजी / एल एम्पीसिलीन से 250 एमएल बोतल स्टार्टर संस्कृतियों में चयनित कॉलोनियों को 100 मिलीलीटर एलबी माध्यम में डालना और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस से लेकर 200 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए।
  4. संस्कृति के 80 एमएल दो 5 एल फ्लास्क (40 मिलीलीटर प्रति फ्लास्क) में डालना, प्रत्येक युक्त 1.5 एल 2x वाईटी माध्यम (16 ग्राम / एल ट्राप्टोन, 10 ग्राम / एल खमीर निकालने, 5 ग्राम / एल NaCl) 100 मिलीग्राम / एल एम्पीसिलीन
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को सेते हुए 180 डीआरएम में लगातार झटकों के साथ ओडी 600 एनएम = 0.5 तक पहुंचने तक।
  6. तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस तक कम करें और 0.5 एमएम isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (आईपीटीजी) जोड़कर कोशिकाओं को प्रेरित करें। चोरप्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 16-20 एच के लिए एक ही शर्त के तहत incubating टिन्यू।
  7. सेंटीफ्यूगेशन (10 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी ) से कोशिकाओं को फसल लगाएं।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है; शुद्धिकरण तक कोशिकाओं की गोली -80 डिग्री सेल्सियस तक रखा जाना चाहिए।

3 मानव डीएचडीडीएस की शुद्धि

  1. बफर ए (25 मिमी त्रि-एचसीएल, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 0.1% ट्राइटन एक्स -100, 10 एमएम β-मेर्केटोटोथानॉल), 1 माइक्रोग्राम / एमएल डीएनस आई, और प्रोटीज अवरोधक मिश्रण में कोशिकाओं को फिर से खोलें।
  2. एक ग्लास-टेफ्लोन होमोजिनेजर का उपयोग करके कोशिकाओं को होमोजेनइज़ करें।
  3. एक माइक्रोफ्लूइडिजर या समतुल्य 12,000 - 15,000 psi 11 का प्रयोग करके कोशिकाओं को बाधित करें
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 40,000 xg पर सेल लिसेडेट अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त करें, जिसमें घुलनशील अंश शामिल है
  5. सतह पर तैरनेवाला को 5-10 एमएल कोबाल्ट अबाधित-मेटल आइडिनिटि क्रोमैटोग्राफी (को 2 + -IMAC) 12 कॉलम 10 पर लोड करेंएमएम इमिजाजोल, बफर ए और 10 एमएम इमिडाजोल के साथ पूरी तरह से धुलाई के बाद गैर-विशिष्ट प्रोटीन बंधन को कम करने के लिए।
  6. 250 एमएम इमिडाजोल के साथ बफर ए के साथ ओवरएक्साइडेड प्रोटीन को हटा दें।
  7. बफर ए के साथ समेबलित 53 एमएल तैयार करने योग्य desalting स्तंभ का उपयोग कर imidazole निकालें
  8. 6xHis टैग किए गए TEV protease (1 मिलीग्राम TEV protease प्रति 50 मिलीग्राम प्रोटीन) eluted प्रोटीन को जोड़ने के लिए उनके 6xHis- टैग TRX संलयन प्रोटीन 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दूर।
  9. क्लीवाइड प्रोटीन को को 2 + -आईएमएसी कॉलम पर लोड करें, बफर ए के साथ समेकित करें, जो 5 मिमी एमआईडीज़ोल के साथ पूरक हो, cleaved 6x उसकी टैग युक्त TRX संलयन प्रोटीन और TEV protease को निकालने के लिए।
  10. 30 केडीए आणविक वजन कट ऑफ सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर का उपयोग करके प्रवाह-माध्यम को एकत्र करें और 3-4 एमएल तक ध्यान केंद्रित करें।
  11. अंतिम शुद्धि के लिए बफर ए के साथ समेकित एक सुपरडेक्स -200 आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर केंद्रित प्रोटीन लोड करें। एक डिमर (~ 76 केडीए) के रूप में प्रोटीन एलिट्स एलाउज प्रोफ़ाइल की तुलना एक स्तंभ अंशांकन वक्र के साथ प्रासंगिक भिन्नों का चयन करें।
  12. एसडीएस पृष्ठ का उपयोग करके तैयारी की शुद्धता का आकलन करें
  13. उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में शुद्ध, केंद्रित प्रोटीन के डाउनस्ट्रीम प्रयोग और फ्लैश फ्रीज अल्कोट के लिए आवश्यक प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।

4 विश्लेषणात्मक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)

  1. फ्रीज-पिघलना चक्र को सहन करने के लिए प्रोटीन की क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, जमे हुए प्रोटीन के एक विभाज्य को छूने और अघुलनशील समुच्चय हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 21,000 x ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा
  2. एक अति-निष्पादन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करके 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 150 एमएम नाओक्ल, 0.02% ट्राइटन एक्स-100, 10 एमएम β-मेर्कैटोटोथानॉल के साथ एक सुपरडेक्स -200 विश्लेषणात्मक स्तंभ पर प्री-प्रोटीन लोड करें 13 , 14
  3. मॉनिटर ट्रिप्टोफैन फ्लोररस्किन (λ पूर्व = 280 एनएम, λ एम = 350 एनएम) प्रोटीन का पता लगाने के लिए एल्यूटिंग एल्यूटिंग प्रोफाइल। आणविक भार मूल्यांकन के लिए एक वैध अंशांकन वक्र सुनिश्चित करना - ऐसे घटता एसईसी स्तंभ निर्माताओं के माध्यम से उपलब्ध हैं।

5 एंजाइम कैनेटीक्स - समय पर निर्भर गतिविधि 15 , 16 , 17

  1. शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए 10 माइक्रोन FPP और 50 माइक्रोन 14 सी-IPP साथ शुद्ध DHDDS के 5 माइक्रोन मिश्रण 22 में 0.5 मिमी 2 MgCl के साथ बफर एक में प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए - 30 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: डीएचडीडीएस से भिन्न सीआईएस- पीटी की तैयारी के साथ सटीक प्रतिक्रिया की स्थिति भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, डीएचडीडी की गतिविधि भी तापमान और [एमजी 2 + ] पर निर्भर करती है।
    सावधानी: 14 सी-आईपीपी रेडियोधर्मी है और स्थानीय विकिरण सुरक्षा नियमों के अनुसार उपयोग किया जाना चाहिए। 15 μL बफर ए पूरक 20 एमएम EDTA (10 एमएम EDTA के अंतिम एकाग्रता के साथ) की प्रतिक्रिया के तत्काल शमन के बाद, 0, 2, 4 और 6 घंटे पर प्रतिक्रिया से 15 μL नमूनों को वापस ले लें।
  2. प्रतिक्रिया उत्पादों को निकालने के लिए 1 एमएल एच 2 ओ-संतृप्त 1-ब्यूटेनोल और भंवर को जोड़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और नमूने को बाद में पढ़ने के लिए रखा जा सकता है।
  3. नमूनों के लिए जगमगाहट कॉकटेल जोड़ें और, एक छिद्र काउंटर का उपयोग करते हुए, ब्यूटेनोल चरण में प्रतिक्रियात्मक उत्पादों की मात्रा बढ़ाएं, जिसमें 14 सी को शामिल किया जाता है, साथ ही प्रतिक्रिया के मिश्रण से 15 μL की रेडियोधर्मिता के साथ, कुल रेडियोधर्मिता का प्रतिनिधित्व करता है।
  4. प्रत्येक समय बिंदु से 0 घंटे के नमूने का उपयोग करके पृष्ठभूमि रीडिंग घटाएं और उपयोग किए गए 14 सी-आईपीपी के प्रतिशत की गणना करें।
  5. प्रतिशत कुल 14 से उपयोग किया की गणना के द्वारा हर बार बिंदु पर शुद्ध 14 सी-IPP समावेश की गणना करें 14 सी-आईपीपी निगमन में वृद्धि की उम्मीद है।

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Representative Results

यहां इस्तेमाल किए गए निर्माण का सामान्य अवलोकन और शुद्धि प्रक्रिया चित्रा 1 में दिखाया गया है। प्रत्येक शुद्धि चरण में प्राप्त नमूने चित्रा 2 में दिखाए गए हैं। यह एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण डीएचडीडीएस के चरण-निस्तार शुद्धि को दर्शाता है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक शुद्ध उत्पाद का उत्पादन होता है। चित्रा 3 शुद्ध एंजाइम के विश्लेषणात्मक एसईसी के परिणामों को दर्शाता है, यह खुलासा करता है कि प्रोटीन केवल एक होमोडीमर के रूप में मनाया जाता है। चित्रा 4 एक प्रतिनिधि समय-निर्भर गतिविधि परख से पता चलता है। 14 सी-आईपीपी निगमन स्पष्ट रूप से 6 घंटे से अधिक हो जाती है, इसकी पुष्टि करते हुए कि शुद्ध एंजाइम कार्यात्मक है।

आकृति 1
चित्रा 1: मानव डीएचडीडीएस क्लोनिंग और शुद्धि ( बी ) मानव डीएचडीडीएस शुद्धि प्रोटोकॉल की रूपरेखा यहाँ वर्णित है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: मानव डीएचडीडीएस की शुद्धि मानव डीएचडीडीएस आत्मीयता शुद्धि चरण के एसडीएस पेज विश्लेषण लेन 1, आणविक वजन चिह्नक (केडीए); लेन 2, क्रूड निकालने; लेन 3, को 2+ -आईएमएसी प्रवाह-माध्यम तीर TRX-DHDDS संलयन प्रोटीन को इंगित करता है; लेन 4, को 2+ -आईएमएसी ईएलयूएट; लेन 5, रातोंरात ऊष्मायन के बाद प्रोटीन-टीईवी प्रोटीज मिश्रण; लेन 6, सीओ 2 + -एमएमएसी प्रवाह-माध्यम से निम्नलिखित टीईवी दरार; लेन 7, सीओ 2+ - आईएमएसी ईएलयूईएट निम्नलिखित टीईवी दरार; लेन 8, शुद्ध मानव डीएचडीडीएस (संकेतएक तीर द्वारा लगाया गया) निम्न आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: शुद्ध मानव डीएचडीडीएस के विश्लेषणात्मक एसईसी प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति की निगरानी की गई थी। इस कॉलम की अंशांकन वक्र के अनुसार, डीएचडीडीए एक होमोडाइमर (77.4 केडीए) बनाती है। तीर शून्य मात्रा इंगित करता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : तिवारीशुद्ध मानव DHDDS की मुझे निर्भर कार्य 10 माइक्रोन एफपीपी और 50 माइक्रोन 14 सी-आईपीपी के प्रोटीन (एमओएल / एमओएल) के अनुसार आईपीपी में निगमन के रूप में शुद्ध मानव डीएचडीडीएस के इन विट्रो गतिविधि में व्यक्त की जाती है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

ई। कोलाई कोशिकाओं में कार्यात्मक मानव डीएचडीडी के शुद्धिकरण के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल सरल और कुशल है, एक को एक अतिरंजित करने और 3-4 दिनों में प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए उपयुक्त निर्माण उपलब्ध होने के बाद की अनुमति देता है। प्रोटीन शुद्धि के लिए ऐसे प्रोटोकॉल जीनोम अनुक्रमण, जो कई बीमारियों 18 की आनुवंशिकी के बारे में जानकारी की अधिकता प्रदान की है, जिससे प्रोटीन के स्तर 19 पर रोगजनक तंत्र चिह्नित करने के लिए उच्च throughput विधियों के विकास की आवश्यकता होती है में सफलताओं को देखते हुए विशेष महत्व का है।

हेटरोलॉजस प्रोटीन ओवरक्प्रेसशन और शुद्धि में आम नुकसान से उबरने के लिए, यहां कई उपायों को लिया गया है, जो सफलतापूर्वक घुलनशील और कार्यात्मक प्रोटीन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, डीएचडीडीएस को एक टीएआरएक्स-फ्यूजन के रूप में अति व्यस्त किया गया था। TRX संलयन प्रोटीन तह की सुविधा देता है और संलयन प्रोटीन विलेयता को बढ़ाता है, इसमें शामिल को रोकने के लिएओडी गठन 20 इसके बाद, प्रोटीन उपज बढ़ाने के लिए, डीएनए का निर्माण ई। कोलाई 21 में अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया था। अंत में, शामिल किए जाने के शरीर के गठन की संभावना को और कम करने के लिए, प्रोटीन की अभिव्यक्ति 16 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन संश्लेषण दर को धीमा करने के लिए प्रेरित की गई थी, संभावना प्रोटीन तह 22 की सहायता कर रहा था।

विभिन्न प्रजातियों में सीआईएस- पीटी के समरूपता को ध्यान में रखते हुए, हम सुझाव देते हैं कि इस प्रोटोकॉल को अन्य यूकेरियोटिक सीआईएस- पीटी के लिए 1 के रूप में भी लागू किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रयोग करना, और डीएचडीडीएस अभिव्यक्ति के लिए सामान्य दिशानिर्देश दिए गए हैं, इस विधि को अलग-अलग सीआईएस- पीटीएस की इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कोई अलग संलयन भागीदारों (जैसे कि माल्टोस बाध्यकारी प्रोटीन) का प्रयास कर सकता है या फिर विशिष्ट प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन कर सकता है।

<पी। क्लास = "jove_content"> अपने बायोमेडिकल और जैव-तकनीकी महत्व 1 , 7 , 8 के अनुसार , वर्णित प्रोटोकॉल के भविष्य के उपयोग को बड़े पैमाने पर कार्यात्मक डीएचडीडीएस प्राप्त करने के लिए, अन्य सीआईएस- पीटी के साथ, उनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन । उदाहरण के लिए, डीएचडीडीएस के आगे आणविक अध्ययन डीएचडीडीएस से संबंधित रेटिनैटाइटिस पिगमेंटोसा के अंतराल तंत्रों को हल करेंगे, जो संभावित रूप से उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की खोज और विकास के लिए अग्रणी होगा। इसके अलावा, प्रोकार्यियोटिक सीआईएस- पीटीज़ बैक्टीरिया की दीवार संश्लेषण में शामिल होते हैं, एंजाइमों के इस समूह में संभावित रूप से नए जीवाणुरोधी एजेंटों के लिए उपन्यास लक्ष्य होते हैं। दरअसल, यूकेरियोटिक और प्रोकोरायोटिक एंजाइम के अध्ययन का संपूर्ण लक्षण वर्णन, प्रोक्रोरीोटिक सीआईएस- पीटी के लिए चयनात्मक रोगाणुरोधी दवाओं के तर्कसंगत विकास की अनुमति दे सकता है। अंत में, प्राकृतिक रबड़ के रूप में बी का संश्लेषित किया जाता हैसीआईएस- पीटी परिवार के वाई सदस्य, यहां वर्णित दृष्टिकोण प्राकृतिक रबर औद्योगिक संश्लेषण में भविष्य में उपयोग हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को इजरायल साइंस फाउंडेशन के सेंटर फॉर रिसर्च एक्सलेंस (आई-कोर) स्ट्रक्चरल सेल बायोलॉजी (1775/12) में और ईसाई साइंस फाउंडेशन ने 1721/16 और 2338/16 (वाईएच), और 825/14 (डीके) को अनुदान दिया था। )। फील्ड्स एस्टेट फाउंडेशन डीके की सहायता की अत्यधिक सराहना की गई है। यह काम इलान एडीरी ​​और माइकल गोल्डनबर्ग द्वारा किया गया था जिसमें मेकडीन के स्केकलर फैकल्टी ऑफ़ तेल अवीव विश्वविद्यालय की एमडी थीसिस आवश्यकताओं की आंशिक पूर्ति हुई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

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References

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Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

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