Summary
Escherichiaからの非変性条件下でのコドン最適化されたヒトcis-プレニルトランスフェラーゼの過剰発現および精製のための簡単なプロトコール 大腸菌は 、酵素活性アッセイと一緒に、記載されています。このプロトコールは、機構的研究に適した量および質の他のシスプレニルトランスフェラーゼタンパク質の産生のために一般化することができる。
Abstract
プレニルトランスフェラーゼ（PT）は、複数の縮合反応によるイソペンテニル二リン酸（IPP） を用いたアリル二リン酸の鎖伸長を触媒する酵素群である。 DHDDS（デヒドロドキリチルジホスフェートシンターゼ）は、イソペンテニル二リン酸（IPP）との多重縮合を介してファルネシル二リン酸（FPP、アリル二リン酸）の鎖伸長を触媒する真核生物の長鎖シス -PT（縮合反応からのシス二重結合を形成する）である。 DHDDSは生物医学的に重要であり、酵素中の非保存的突然変異（K42E）が色素性網膜炎をもたらし、最終的には失明に至る。したがって、本プロトコールは、機構的研究に適した精製DHDDSを大量に取得するために開発されたものである。ここでは、機能的に活性なヒトDHDDSの過剰発現および精製を可能にするために、タンパク質融合、最適化培養条件およびコドン最適化の使用を使用した。
Introduction
プレニルトランスフェラーゼは、複数の縮合反応1 を介して、イソペンテニル二リン酸（IPP）を使用して、アリル二リン酸、2の鎖の伸長を触媒する酵素の一群です。 Z型酵素は、縮合反応からシス二重結合の形成を触媒するが、E型酵素はトランス二重結合形成を触媒する3 。 cis-プレニルトランスフェラーゼ（ シス -PT、Z型酵素）は、その鎖長に応じて、短鎖（C 15 ）、中鎖（C 50-55 ）、および長鎖（C 70-120 ） 4 。 DHDDS（dehydrodolichyl二リン酸シンターゼ）は、イソペンテニル二リン酸（IPP）1と、複数の縮合を介して、ファルネシル二リン酸（FPP、アリル二リン酸）の鎖伸長を触媒する真核生物の長鎖シス -PTあります、5、6。これはdehydrodolichylジホスフェート、dolichylpyrophosphateの前駆体、N結合型タンパク質のグリコシル化に関与する1グリコシル担体分子としてのC 55から100ポリプレニル二リン酸の形成をもたらします。アシュケナージ系ユダヤ人、常染色体劣性網膜色素変性症7,8におけるDHDDS結果におけるミスセンス非保存的変異（K42E）のうち。従って、本プロトコールは、機械的研究に適した精製DHDDSを得るために開発されたものである。
エシェリヒア・コリは、組換えタンパク質発現のための最も便利でコスト効率の良い宿主であると考えられ、従って、最も頻繁に使用される宿主でもある。しかし、 大腸菌でタンパク質を異種的に過剰発現しようとする場合、タンパク質特異的な検討が必要である。正しく折りたたまれた状態で取得する大腸菌由来の組換えタンパク質は、異なるタンパク質の異なる特性のために単純な問題ではない。これらのハードルを克服するための多くのアプローチが開発されている。ここでは、 大腸菌で機能的に活性なヒトDHDDSの過剰発現および精製を可能にするために、タンパク質融合、最適化培養条件およびコドン最適化の使用を使用した。注目すべきは、タンパク質融合なしで酵母cis -PTを過剰発現する以前の試みは、界面活性剤の存在下でさえ完全な不溶性のために成功しなかった12 。記載されたプロトコールは、単純で費用効果が高く、時間を節約し、機械学的研究に適したDHDDS調製物を得ることを可能にする。異なる種間のシス -PTの相同性を考慮すると、このプロトコールは他の真核生物シス -PTにも適用できることを示唆している。
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Protocol
1。 大腸菌におけるcis- PTの過剰発現のクローニング
- 109aaチオレドキシン（TRX）タンパク質17と融合したタンパク質配列および完全長cis -PTの大腸菌コドン最適化18コード配列のクローニングおよび高レベル発現のために設計されたpET-32b発現ベクターを得る。
- シスの上流にTEV-プロテアーゼ（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）切断部位（ENLYFQ / G、「/」は切断点を示す） 9、続いて短い柔軟性リンカー（切断部位接近性を高めるためのSGSGSG） -PT配列（ 図 1A ）。また、クローニングに適した5 'および3'制限部位を加える。
- 標準的なライゲーション技術を用いて、合成されたDNA構築物をpET-32bベクターにクローニングする10 。
2。過大評価大腸菌におけるヒトDHDDSのssion
- 形質転換大腸菌 T7は、TRX融合DHDDS構築物を有するコンピテント細胞を、製造者の指示に従って発現する。
- 形質転換細胞をアンピシリン選択条件（200mg / L）下のLB寒天上の製造者の指示に従ってプレートする。
- 200mg / Lのアンピシリンを含む250mLフラスコスターター培養物中の100mLのLB培地に選択されたコロニーを接種し、200rpmで一定に振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。
- 100mg / mLの濃度の2×YT培地（16g / Lトリプトン、10g / L酵母エキス、5g / L NaCl）1.5Lを含む2つの5Lフラスコ（フラスコ当たり40mL）に、80mLの培養物を接種する。 Lアンピシリン。
- OD 600 nm = 0.5に達するまで180 rpmで一定に振とうしながら37℃で培養物をインキュベートする。
- 温度を16℃に下げ、0.5mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して細胞を誘導する。コン同じ条件下でタンパク質発現のために16〜20時間インキュベートする。
- 遠心分離（10,000× g 、10分間）により細胞を回収する。
注意：ここではプロトコルを一時停止することができます。細胞ペレットは精製するまで-80℃に保つ必要があります。
3。ヒトDHDDSの精製
- バッファーA（25mM Tris-HCl、pH 7.5,150mM NaCl、0.1％Triton X-100,10mMβ-メルカプトエタノール）、1μg/ mL DNase I、およびプロテアーゼ阻害剤混合物に細胞を再懸濁する。
- ガラステフロンホモジナイザーを用いて細胞をホモジナイズする。
- 15,000 PSI 11 - 12000でマイクロフルイダイザーまたは同等のものを使用して細胞を破壊。
- 4℃で45分間40,000 xgで細胞ライセートを遠心分離する。可溶性画分を含む上清を回収する。
- 上清を5~10mLのコバルト固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Co 2+ -IMAC） 12カラムに10続いて緩衝液Aおよび10mMイミダゾールで十分に洗浄して、非特異的タンパク質結合を減少させた。
- 250mMイミダゾールを補充した緩衝液Aで過剰発現したタンパク質を溶出する。
- バッファーAで平衡化した53mL分取脱塩カラムを用いてイミダゾールを除去する。
- 溶出されたタンパク質に6xHis標識TEVプロテアーゼ（タンパク質50mgあたり1mgのTEVプロテアーゼ）を添加して、6xHis標識TRX融合タンパク質を4℃で一晩除去する。
- 開裂したタンパク質を、5mMイミダゾールを補充した緩衝液Aで平衡化したCo 2+ -IMACカラムにロードし、切断された6xHis標識TRX融合タンパク質およびTEVプロテアーゼを除去する。
- 30kDa分子量カットオフ遠心フィルターを使用して、フロースルーを集め、3〜4mLに濃縮する。
- 最終精製のために緩衝液Aで平衡化されたsuperdex-200サイズ排除クロマトグラフィーカラムに濃縮タンパク質をロードする。タンパク質は二量体（約76kDa）として溶出する。 溶出プロファイルとカラム較正曲線を比較することにより、関連する画分を選択する。
- SDS-PAGEを用いて調製物の純度を評価する。
- 下流の実験に必要なタンパク質濃度を決定し、液体窒素中の精製され濃縮されたタンパク質のフラッシュ凍結アリコートを使用し、使用するまで-80℃で保存する。
4。分析サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
- 凍結融解サイクルに耐えるタンパク質の能力を確実にするために、凍結タンパク質のアリコートを解凍し、21,000× gで10分間遠心分離して不溶性凝集物を除去する。上清を集める。
- 超高性能液体クロマトグラフィーシステム13を用いて、25mM Tris-HCl、pH7.5,150mM NaCl、0.02％Triton X-100,10mMβ-メルカプトエタノールで予め平衡化したsuperdex-200分析カラムにタンパク質をロードする。 14 。
- トリプトファンフルオルをモニターするscenceタンパク質溶出溶出プロファイルを検出するために、（λのEX = 280nmで、λEMは、350nmでの=）。分子量評価のための有効な検量線があることを確認してください。このような曲線はSECカラム製造業者から入手できます。
5。酵素動力学-時間依存性活性15、16、17
- 精製されたタンパク質の活性を確実にするために、5μMの精製DHDDSを10μMのFPPおよび50μMの14 C-IPPと混合して、緩衝液A中で0.5mMのMgCl 2を用いて22〜30℃で反応を開始させる。
注：正確な反応条件は、DHDDSとは異なるシス -PTの調製によって変化し得る。さらに、DHDDSの活性はまた、温度および[Mg 2+ ]に依存する。
注意：14 C-IPPが放射性で、地域内の放射線安全規則に従って使用されるべきです。 0,2,4および6時間後に15μLのサンプルを0,2,4および6時間後に取り出し、緩衝液Aを補充した20mM EDTA（最終濃度10mM EDTA）を添加することにより反応を即座に停止させた。 - H 2 O飽和1-ブタノール1mLを添加し、完全にボルテックスして反応生成物を抽出する。
注：プロトコルはここで停止することができ、サンプルは後で読むために保管することができます。 - サンプルにシンチレーションカクテルを加え、シンチレーションカウンターを用いて、 14 Cを含むブタノール相の反応生成物を、反応混合物からの放射能（全放射能を表す）と共に定量する。
- 各時点からの0時間サンプルを用いて測定されたバックグラウンド測定値を差し引き、使用された14 C-IPPのパーセントを計算する。
- 合計時点14から利用率を計算することにより、各時点での正味14 C-IPP取り込みを計算する。 14 C-IPPの正味の組み込みの増加が予想される。
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Representative Results
ここで使用したコンストラクトの概要と精製プロセスを図1に示します 。各精製工程で得られた試料を図2に示す。このSDS-PAGE分析は、DHDDSの段階的精製を示し、高度に精製された生成物をもたらす。 図3は、精製酵素の分析SECの結果を示し、タンパク質がホモ二量体としてのみ観察されることを示している。 図4は、代表的な時間依存性活性アッセイを示す。 14 C-IPPの取り込みは、精製された酵素が機能的であることを確認して、6時間にわたって明らかに上昇する。
図1： ヒトDHDDSクローニングおよび精製 。 （
図2： ヒトDHDDSの精製 。ヒトDHDDS親和性精製工程のSDS-PAGE分析。レーン1、分子量マーカー（kDa）。レーン2、粗抽出物;レーン3、Co 2+ -IMACフロースルー。矢印はTRX-DHDDS融合タンパク質を示し、レーン4、Co 2+ -IMAC溶出液;レーン5、一晩のインキュベーション後のタンパク質-TEVプロテアーゼ混合物;レーン6、TEV切断後のCo 2+ -IMACフロースルー;レーン7、TEV切断後のCo 2+ -IMAC溶出液;レーン8、精製ヒトDHDDS（indicサイズ排除クロマトグラフィーに付した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3： 精製ヒトDHDDSの分析SEC。プロトコールに記載されているように、トリプトファンの蛍光をモニターした。このカラムの検量線によれば、DHDDSはホモ二量体（77.4kDa）を形成する。矢印は空隙量を示します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ：Ti精製されたヒトDHDDSのI依存性活性。 10μMのFPPとの反応および50μM14 C-IPPで精製ヒトDHDDSのin vitro活性基板は、タンパク質あたりIPP取り込み（モル/モル）として表現されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
大腸菌細胞内で機能的ヒトDHDDSを精製するために本明細書に記載されたプロトコールは、簡便かつ効率的であり、適切な構築物が入手できれば3〜4日でタンパク質を過剰発現および精製することができる。タンパク質精製のためのそのようなプロトコールは、多くの疾患18の遺伝学に関する情報の過多を提供するゲノムシーケンシングのブレークスルーを考慮すると特に重要であり、それによってタンパク質レベルで病原機構を特徴付けるハイスループット法の開発が必要となる19 。
異種タンパク質の過剰発現および精製における共通の落とし穴を克服するために、可溶性タンパク質および機能性タンパク質を首尾よく得るために重要ないくつかの手段がここでとられた。第1に、DHDDSはTRX融合体として過剰発現していた。 TRXは、融合タンパク質の折りたたみを容易にし、融合タンパク質の溶解性を増加させ、包接b卵形成20 。次に、タンパク質収量を増加させるために、DNA構築物を大腸菌 21での発現のためにコドン最適化した。最後に、封入体形成の可能性をさらに低減するために、タンパク質の発現を16℃で誘導して、タンパク質合成速度を遅くし、たぶんタンパク質の折りたたみを助長した22 。
異なる種間のシス -PTの相同性を考慮して、このプロトコールは他の真核生物シス -PTにも適用できることを示唆している1 。現在のプロトコールを出発点として使用し、DHDDS発現に重要な一般的なガイドラインが与えられている場合、この方法は異なるシス -PTの最適発現のために改変することができる。例えば、異なる融合パートナー（マルトース結合タンパク質など）を試みることができ、または研究される特定のタンパク質の培養条件をさらに最適化することができる。
<Pクラス=「jove_content」>それらの生物医学およびバイオテクノロジー意義1、 図7、 図8では、説明されたプロトコルの将来の使用量は、一緒に他のシス -PTと、精製された機能DHDDSを大量に得るそれらの構造的および機能的特徴の追跡を可能にします。例えば、DHDDSのさらなる分子研究は、潜在的に新規な治療アプローチの発見および開発を導く、DHDDS関連色素性網膜炎の根底にある機構を解決するであろう。加えて、原核生物のシス -PTが細菌壁合成に関与するので、この群の酵素は潜在的に新しい抗菌剤の新規標的を形成する。実際に、真核生物および原核生物の酵素研究の徹底的な特徴づけは、原核生物のシス -PTに選択的な抗菌薬の合理的な開発を可能にする可能性がある。最後に、天然ゴムが合成されるにつれて、bシス -PTファミリーのメンバーであるが、ここに記載されているアプローチは、天然ゴム工業の合成における将来の使用を見出すかもしれない。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究はイスラエル科学財団の構造細胞生物学（I-CORE）のためのセンター（1775/12）およびイスラエル科学財団のグラント1721/16および2338/16（YH）および825/14（DK ）。 DKへのFields Estate Foundationのサポートは高く評価されています。この研究は、テルアビブ大学サックラー医学部のMD卒業要件の部分的な履行においてIlan EdriとMichal Goldenbergが行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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