Summary
Простой протокол для сверхэкспрессии и очистки оптимизированной кодоном, цис- пренилтрансферазы человека, в неденатурирующих условиях, от Escherichia Coli , а также анализ ферментативной активности. Этот протокол может быть обобщен для производства других цис- prenyltransferase белков в количестве и качестве пригодных для механистических исследований.
Abstract
Пренилтрансферазы (ПТ) представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) посредством многочисленных реакций конденсации. DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- PT (образующий цис- двойные связи из реакции конденсации), который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP). DHDDS имеет биомедицинское значение, поскольку неконсервативная мутация (K42E) в ферменте приводит к пигментной ретиниту , что в конечном итоге приводит к слепоте. Поэтому настоящий протокол был разработан для получения большого количества очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований. Здесь использовалось использование белкового синтеза, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в
Introduction
Пренилтрансферазы представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) с помощью многочисленных реакций конденсации 1 , 2 . Ферменты Z-типа катализируют образование цис- двойных связей из реакции конденсации, тогда как ферменты E-типа катализируют образование транс- двойной связи 3 . Цис- Пренилтрансферазы ( цис- PT, ферменты Z-типа) классифицируются классически по их длине цепи продукта в короткоцепочечные (C 15 ), среднецепочечные (C 50-55 ) и длинноцепочечные (C 70-120 ) 4 . DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- ПТ, который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP) 1, 5 , 6 . Это приводит к образованию дегидродолихилдифосфата, полифенилдифосфата C 55-100, служащего в качестве предшественника доличилпирофосфата, молекулы гликозильного носителя, участвующей в N-связанном гликозилировании белка 1 . Среди ашкеназских евреев миссенс-неконсервативная мутация (K42E) в DHDDS приводит к пигментной аутосомно-рецессивной ретинитации 7 , 8 . Поэтому настоящий протокол был разработан для получения очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований.
Escherichia coli считается наиболее удобным и экономически эффективным хозяином для экспрессии рекомбинантного белка и, следовательно, также является наиболее часто используемым хозяином. Однако, когда вы пытаетесь гетерологично сверхэкспрессировать белки в E.coli , необходимо учитывать специфичные для белка соображения. Получение правильно сложенных, активныхE рекомбинантных белков из E.coli , не является простым делом из-за различий в свойствах различных белков. Для преодоления этих препятствий были разработаны многочисленные подходы. Здесь использовалось использование белка, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в E. coli . Следует отметить, что предыдущая попытка сверхэкспрессировать дрожжи cis- PT без слияния белка оказалась неудачной из-за полной нерастворимости даже в присутствии детергента 12 . Описанный протокол прост, экономичен, экономит время и позволяет получать препараты DHDDS, подходящие для механистических исследований. Учитывая гомологию цис- ПТ среди разных видов, мы предлагаем, чтобы этот протокол можно было применять и для других эукариотических цис- ПТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клонирование цис- PT для сверхэкспрессии в E. coli
- Получение вектора экспрессии рЕТ-32b, предназначенный для экспрессии и клонирования высокого уровня белковых последовательностей , слитых с белком 17 109aa тиоредоксина (TRX) и E.coli , кодон-оптимизированным 18 последовательностью полной длиной цисом -pt кодирования.
- Позаботьтесь , чтобы иметь TEV-протеазы (табак вируса травление протеазы) сайт расщепления (ENLYFQ / G, где «/» указывает точку расщепления) 9 с последующим коротким гибким линкером (SGSGSG, чтобы улучшить сайт расщепления доступности) вверх по течению цис -PT ( рисунок 1 A ). Кроме того, добавьте подходящие 5 'и 3' сайты рестрикции для клонирования.
- Клонировать синтезированную ДНК-конструкцию в вектор pET-32b с использованием стандартных методов лигирования 10 .
2. OverexpreSsion DHDDS человека в E. coli
- Transform E. coli T7 экспрессирует компетентные клетки с TRX-гибридной конструкцией DHDDS в соответствии с инструкциями производителя.
- Платируйте трансформированные клетки в соответствии с инструкциями изготовителя на LB-агаре в условиях селективности ампициллина (200 мг / л).
- Инокулировать выбранные колонии в 100 мл среды LB в 250 мл колбах стартовых культур с 100 мг / л ампициллина и инкубировать в течение ночи при 37 ° С с постоянным встряхиванием при 200 об / мин.
- Инокулируют 80 мл культуры в две 5-литровые колбы (40 мл на колбу), каждая из которых содержит 1,5 л среды 2x YT (16 г / л триптона, 10 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl) со 100 мг / L ампициллин.
- Инкубируйте культуру при 37 ° C с постоянным встряхиванием при 180 об / мин до достижения OD 600 нм = 0,5.
- Снижают температуру до 16 ° C и индуцируют клетки путем добавления 0,5 мМ изопропил -D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). ПротивКолючую инкубацию при таком же условии в течение 16-20 ч для экспрессии белка.
- Убирают клетки центрифугированием (10 000 x g в течение 10 мин).
Примечание: протокол может быть приостановлен здесь; Гранулы клеток следует хранить при -80 ° С до очистки.
3. Очистка DHDDS человека
- Ресуспендируют клетки в буфере А (25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 мМ β-меркаптоэтанола), 1 мкг / мл ДНКазы I и смесь ингибиторов протеазы.
- Гомогенизируют клетки, используя стекло-тефлоновский гомогенизатор.
- Нарушать клетки с использованием микрофлюидизатора или эквивалента при 12000-15000 фунтов на квадратный дюйм 11 .
- Центрифугируют клеточный лизат при 40 000 мкг в течение 45 мин при 4 ° С. Восстановить супернатант, содержащий растворимую фракцию.
- Нагрузка супернатантов на 5 с - 10 мл кобальта иммобилизованным металлом аффинной хроматографии (Со 2+ -IMAC) 12 колонки с 10ММ имидазола с последующей тщательной промывкой буфером А и 10 мМ имидазолом для уменьшения неспецифического связывания белка.
- Элюируйте сверхэкспрессированные белки буфером А, дополненным 250 мМ имидазолом.
- Удалите имидазол, используя 53 мл препаративной колонны обессоливания, уравновешенной буфером А.
- Добавить 6xHis-tagged TEV-протеазу (протеин на 1 мг TEV на 50 мг белка) в элюированные белки для удаления их 6xHis-меченного слитого белка TRX при 4 ° C в течение ночи.
- Загрузите расщепленные белки на колонку Co 2+ -IMAC, уравновешенную буфером А, дополненным 5 мМ имидазолом, для удаления расщепленного 6x His-меченного слитого белка TRX и протеиназы TEV.
- Собирают поток и концентрируют до 3-4 мл, используя центробежный фильтр с молекулярной массой 30 кДа.
- Загрузите концентрированный белок в колонку с эксклюзионной хроматографией размера Superdex-200, уравновешенную буфером А для окончательной очистки. Белок элюируется как димер (~ 76 кДа). Выберите соответствующие фракции, сравнив профиль элюирования с кривой калибровки столбца.
- Оцените чистоту препарата с использованием SDS-PAGE.
- Определите концентрацию белка, необходимую для последующих экспериментов и флеш-замораживающих аликвот очищенных концентрированных белков в жидком азоте и хранить при -80 ° C до использования.
4. Аналитическая гамма-хроматография (SEC)
- Чтобы обеспечить способность белка выдержать циклы замораживания-оттаивания, оттереть аликвоту замороженных белков и центрифугировать при 21000 × g в течение 10 минут для удаления нерастворимых агрегатов. Соберите супернатант.
- Загрузите белки в аналитическую колонку Superdex-200, предварительно уравновешенную 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 мМ β-меркаптоэтанола, используя ультраэффективную жидкостную хроматографическую систему 13 , 14 .
- Монитор триптофанового гриппа(Λ ex = 280 нм, λ em = 350 нм) для выявления элюирующего профиля элюирования белков. Убедитесь, что у вас есть допустимая калибровочная кривая для оценки молекулярной массы - такие кривые доступны через производителей столбцов SEC.
5. Кинетика фермента - зависящая от времени активность 15 , 16 , 17
- Чтобы обеспечить активность очищенного белка, смешайте 5 мкМ очищенного DHDDS с 10 мкМ FPP и 50 мкМ 14 C-IPP, чтобы инициировать реакцию в буфере A с 0,5 мМ MgCl 2 при 22-30 ° C.
Примечание. Точные условия реакции могут варьироваться в зависимости от препаратов цис- ПТ, отличных от DHDDS. Более того, активность DHDDS также зависит от температуры и [Mg 2+ ].
Осторожно: 14 C-IPP является радиоактивным и должен использоваться в соответствии с местными правилами радиационной безопасности. Извлеките 15 мкл образцов из реакции в течение 0, 2, 4 и 6 часов после немедленного гашения реакции добавлением 15 мкл буфера А, дополненного 20 мМ ЭДТА (до конечной концентрации 10 мМ ЭДТА). - Добавьте 1 мл H 2 O-насыщенного 1-бутанола и вихря тщательно, чтобы получить продукты реакции.
Примечание. Протокол можно остановить здесь, и образцы можно сохранить для последующего чтения. - Добавить сцинтилляционный коктейль к образцам и, используя сцинтилляционный счетчик, количественно обработать продукты реакции в бутанольной фазе, охватывающей 14 С, вместе с радиоактивностью 15 мкл из реакционной смеси, представляющей полную радиоактивность.
- Вычтите отсчеты фона, измеренные с использованием отсчетов 0 h с каждой временной точки, и рассчитайте процент использования 14 C-IPP.
- Вычислить сетевое включение 14 C-IPP в каждый момент времени путем вычисления процента, используемого из общего количества 14 14 C-IPP со временем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий обзор используемой здесь конструкции и процесса очистки показан на рисунке 1 . Образцы, полученные на каждой стадии очистки, показаны на фиг. 2 . Этот анализ SDS-PAGE показывает ступенчатую очистку DHDDS, в результате чего получают высокоочищенный продукт. На рисунке 3 показаны результаты аналитической SEC очищенного фермента, показывающие, что этот белок наблюдается только как гомодимер. На рисунке 4 показан типичный анализ активности, зависящий от времени. 14 Включение C-IPP явно возрастает в течение 6 часов, подтверждая, что очищенный фермент является функциональным.
Рисунок 1: Клонирование и очистка человека DHDDS . ( B ) Краткое описание протокола очистки человека DHDDS, описанного здесь. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Очистка DHDDS человека . SDS-PAGE анализ стадий очистки аффинности человека DHDDS. Лейн 1, маркер молекулярной массы (кДа); Дорожка 2, сырой экстракт; Полоса 3, Co 2+ -IMAC. Стрелка указывает слитый белок TRX-DHDDS; Дорожка 4, Co 2+ -IMAC элюат; Полоса 5, протеин-протеин-TEV после инкубации в течение ночи; Полоса 6, Co 2+ -IMAC, протекающая после расщепления TEV; Полоса 7, Co 2+ -IMAC элюат после расщепления TEV; Дорожка 8, очищенный человеческий DHDDS (показательС помощью стрелки) после хроматографии с исключением размера. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Аналитическая SEC очищенных человеческих DHDDS. Контролировали флуоресценцию триптофана, как описано в протоколе. Согласно калибровочной кривой этой колонки, DHDDS образует гомодимер (77,4 кДа). Стрелка указывает объем пустоты. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : TiMe-зависимая активность очищенных человеческих DHDDS. Активность in vitro очищенного человеческого DHDDS в реакции с 10 мкМ FPP и 50 мкМ 14 C-IPP в качестве субстратов выражается как включение IPP на белок (моль / моль). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь для очистки функциональных человеческих DHDDS в клетках E. coli, прост и эффективен, что позволяет сверхэкспрессировать и очищать белок через 3-4 дня после того, как имеется подходящая конструкция. Такие протоколы для очистки белка имеют особое значение, учитывая прорывы в секвенировании генома, которые предоставляют множество информации о генетике многих заболеваний 18 , тем самым требуя разработки высокопроизводительных методов для характеристики патогенных механизмов на уровне белка 19 .
Для преодоления распространенных ловушек в сверхэкспрессии и очистке гетерологичных белков здесь были приняты несколько мер, которые имеют решающее значение для успешного получения растворимых и функциональных белков. Во-первых, DHDDS был сверхэкспрессирован как TRX-fusion. TRX облегчает складывание слитого белка и повышает растворимость белков слитого белка, предотвращая включение bФормирование оды 20. Затем, чтобы увеличить выход белка, конструкция ДНК была оптимизирована кодоном для экспрессии в E. coli 21 . Наконец, для дальнейшего снижения вероятности образования тела включения экспрессия белка была индуцирована при 16 ° С для замедления скорости синтеза белка, что, вероятно, способствовало сгибанию белка 22 .
Принимая во внимание гомологию цис- РТ среди разных видов, мы предлагаем, чтобы этот протокол можно было применять и для других эукариотических цис- РТ 1 . Используя текущий протокол в качестве отправной точки и учитывая общие рекомендации, важные для выражения DHDDS, этот метод может быть изменен для оптимального выражения разных cis -PT. Например, можно попробовать различные партнеры по слиянию (такие как мальтозосвязывающий белок) или еще более оптимизировать условия культивирования для конкретного исследуемого белка.
<С их биомедицинским и биотехнологическим значением 1 , 7 , 8 , будущее использование описанного протокола для получения больших количеств очищенных функциональных DHDDS вместе с другими цис- PT, позволяющими добиваться их структурной и функциональной характеристики , Например, дальнейшие молекулярные исследования DHDDS разрешат механизмы, лежащие в основе пигментной ретинита , связанные с DHDDS, потенциально приводящие к открытию и разработке новых терапевтических подходов. Кроме того, поскольку прокариотические цис- ПТ участвуют в синтезе бактериальной стенки, эта группа ферментов потенциально образует новые мишени для новых антибактериальных агентов. Действительно, тщательная характеристика исследований эукариотических и прокариотических ферментов может позволить рациональное развитие антимикробных препаратов, избирательных для прокариотического цис- ПТ. Наконец, когда синтезируется натуральный каучук bY членов семейства cis -PT, описанный здесь подход может найти будущее использование в промышленном синтезе натурального каучука.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Центром научно-исследовательского совершенства Израиля (I-CORE) в области структурной клеточной биологии (1775/12), а Научный фонд Израиля предоставил 1721/16 и 2338/16 (YH) и 825/14 (DK ). Поддержка Фонда Fields Estate DK высоко ценится. Эта работа была выполнена Иланом Эдри и Михалом Голденбергом в частичном выполнении требований МД на медицинском факультете Саклера Тель-Авивского университета.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).