Summary
Ein einfaches Protokoll zur Überexpression und Reinigung von codonoptimierter, menschlicher cis- Prenyltransferase unter nicht-denaturierenden Bedingungen aus Escherichia Coli , wird zusammen mit einem enzymatischen Aktivitäts-Assay beschrieben. Dieses Protokoll kann für die Produktion von anderen cis- Prenyltransferase- Proteinen in Quantität und Qualität geeignet für mechanistische Studien verallgemeinert werden.
Abstract
Prenyltransferasen (PT) sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyldiphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen katalysieren. DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT (bildende cis -Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion), das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) katalysiert. DHDDS ist von biomedizinischer Bedeutung, da eine nicht-konservative Mutation (K42E) im Enzym zu Retinitis pigmentosa führt , was letztlich zur Blindheit führt. Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um große Mengen an gereinigtem DHDDS zu erwerben, die für mechanistische Studien geeignet sind. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in zu ermöglichen
Introduction
Prenyltransferasen sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyl-Diphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen 1 , 2 katalysieren. Z-Typ - Enzyme katalysieren die Bildung von cis - Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion, wohingegen E-Typ - Enzyme 3 trans - Doppelbindungsbildung katalysieren. Cis- Prenyltransferasen ( cis- PT, Z-Typ-Enzyme) werden klassisch nach ihrer Produktkettenlänge in kurzkettige (C 15 ), mittelkettige (C 50-55 ) und langkettige (C 70-120 ) klassifiziert ) 4 . DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT, das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) 1 katalysiert, 5 , 6 Dies führt zu der Bildung von dehydrodolichyl Diphosphat, ein C 55-100 Polyprenyldiphosphat als Vorstufe für dolichylpyrophosphate dien Molekül des Glycosyl Träger beteiligt in N-verknüpften Proteinglykosylierung 1. Unter den ashkenazischen Juden führt eine nicht-konservative Mutation (K42E) in DHDDS zu einer autosomal-rezessiven Retinitis pigmentosa 7 , 8 . Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um gereinigtes DHDDS für mechanistische Studien zu erwerben.
Escherichia coli gilt als der bequemste und kostengünstigste Wirt für die rekombinante Proteinexpression und ist daher auch der am häufigsten verwendete Wirt. Wenn man jedoch versucht, die Proteine in E. coli heterolog zu überexprimieren, sollten proteinspezifische Überlegungen gemacht werden. Gewinnung richtig gefaltet, aktivE rekombinante Proteine aus E. coli , ist aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften verschiedener Proteine keine einfache Sache. Zahlreiche Ansätze wurden entwickelt, um diese Hürden zu überwinden. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in E. coli zu ermöglichen . Der vorherige Versuch, die Hefe cis- PT ohne Proteinfusion zu überexprimieren, war aufgrund der vollständigen Unlöslichkeit auch in Gegenwart des Detergens 12 nicht erfolgreich . Das beschriebene Protokoll ist einfach, kostengünstig, zeitsparend und erlaubt es, DHDDS-Präparate zu erhalten, die für mechanistische Studien geeignet sind. Angesichts der Homologie von cis- PT unter verschiedenen Spezies schlagen wir vor, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann.
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Protocol
1 Klonierung von cis- PT zur Überexpression in E. coli
- Erhalten Sie den pET-32b-Expressionsvektor, der für die Klonierung und die Expression von Proteinsequenzen mit dem 109aa-Thioredoxin (TRX) -Protein 17 und der E. coli- Codon-optimierten 18- kodierenden Sequenz von Volllängen- cis- PT entwickelt wurde.
- Achten Sie darauf, dass eine TEV-Protease (Tabak-Ätzvirus-Protease) -Schnittstelle (ENLYFQ / G, wo "/" den Spaltpunkt anzeigt) 9, gefolgt von einem kurzen flexiblen Linker (SGSGSG, zur Erhöhung der Spaltungsstelle Zugänglichkeit) stromaufwärts der cis -PT-Sequenz ( Abbildung 1 A ). Auch fügen Sie geeignete 5 'und 3' Restriktionsstellen für das Klonen hinzu.
- Klonieren Sie das synthetisierte DNA-Konstrukt in den pET-32b-Vektor unter Verwendung von Standard-Ligationstechniken 10 .
2 OverexpreSsion von menschlichen DHDDS in E. coli
- Transformieren Sie E. coli T7 kompetente Zellen mit dem TRX-Fusion DHDDS-Konstrukt gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Stellen Sie die transformierten Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers auf LB-Agar unter ampicillinselektiven Bedingungen (200 mg / L) auf.
- Inokulieren ausgewählter Kolonien in 100 ml LB-Medium in 250 ml-Kolben-Starterkulturen mit 100 mg / l Ampicillin und inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter konstantem Schütteln bei 200 U / min.
- Inokulieren Sie 80 ml der Kultur in zwei 5-l-Kolben (40 ml pro Kolben), die jeweils 1,5 l 2x YT-Medium (16 g / l Trypton, 10 g / l Hefeextrakt, 5 g / l NaCl) mit 100 mg / L Ampicillin
- Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C mit konstantem Schütteln bei 180 U / min bis zum Erreichen von OD 600 nm = 0,5.
- Senken Sie die Temperatur auf 16 ° C und induzieren Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). ConZinn inkubieren unter der gleichen Bedingung für 16-20 h für Proteinexpression.
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (10.000 x g für 10 min).
Hinweis: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Das Zellenpellet sollte bis zur Reinigung auf -80 ° C gehalten werden.
3 . Reinigung von menschlichen DHDDS
- Die Zellen in Puffer A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-Mercaptoethanol), 1 μg / ml DNase I und einem Protease-Inhibitor-Gemisch resuspendieren.
- Homogenisieren der Zellen mit einem Glas-Teflon-Homogenisator.
- Unterbrechen Sie die Zellen mit einem Mikrofluidizer oder gleichwertig bei 12.000 - 15.000 psi 11 .
- Zentrifugieren des Zelllysats bei 40.000 xg für 45 min bei 4 ° C. Wiederherstellen des Überstandes, der die lösliche Fraktion enthält.
- Legen Sie den Überstand auf eine 5 - 10 ml Kobalt-immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (Co 2+ -IMAC) 12 Säule mit 10MM Imidazol, gefolgt von gründlichem Waschen mit Puffer A und 10 mM Imidazol, um die unspezifische Proteinbindung zu reduzieren.
- Eluieren Sie die überexprimierten Proteine mit Puffer A, ergänzt mit 250 mM Imidazol.
- Entfernen Sie Imidazol unter Verwendung einer 53 ml präparativen Entsalzungssäule, die mit Puffer A äquilibriert ist.
- Füge 6xHis-markierte TEV-Protease (1 mg TEV-Protease pro 50 mg Protein) zu den eluierten Proteinen hinzu, um ihr 6xHis-markiertes TRX-Fusionsprotein bei 4 ° C über Nacht zu entfernen.
- Laden Sie die gespaltenen Proteine auf eine Co 2+ -IMAC-Säule, äquilibriert mit Puffer A, ergänzt mit 5 mM Imidazol, um das gespaltene 6x His-markierte TRX-Fusionsprotein und TEV-Protease zu entfernen.
- Sammeln Sie den Durchfluss und konzentrieren Sie auf 3 - 4 ml mit einem 30 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfilter.
- Laden Sie das konzentrierte Protein auf eine Superdex-200-Size-Ausschluss-Chromatographiesäule, die mit Puffer A für die Endreinigung äquilibriert wurde. Das Protein eluiert als Dimer (~ 76 kDa). Wählen Sie relevante Fraktionen aus, indem Sie das Elutionsprofil mit einer Spaltenkalibrierungskurve vergleichen.
- Beurteilen Sie die Reinheit der Zubereitung mit SDS-PAGE.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration, die für nachgeschaltete Experimente und Flash-Freeze-Aliquote von gereinigten, konzentrierten Proteinen in flüssigem Stickstoff benötigt wird, und lagern bei -80 ° C bis zur Verwendung.
4 Analytische Größenausschluss-Chromatographie (SEC)
- Um die Fähigkeit des Proteins zu gewährleisten, Gefrier-Tau-Zyklen zu ertragen, ein Aliquot der gefrorenen Proteine auftauen und bei 21.000 x g für 10 min zentrifugieren, um unlösliche Aggregate zu entfernen. Sammle den Überstand.
- Laden Sie die Proteine auf eine Superdex-200-Analysensäule, die mit 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-Mercaptoethanol, unter Verwendung eines Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiesystems 13 , 14
- Beobachten Sie Tryptophan-Fluore(Λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm), um das Elutions-Elutionsprofil der Proteine zu detektieren. Achten Sie darauf, eine gültige Kalibrierkurve für die Molekulargewichtsbewertung zu haben - solche Kurven sind über die SEC-Säulenhersteller erhältlich.
5 Enzymkinetik - zeitabhängige Aktivität 15 , 16 , 17
- Um die Aktivität des gereinigten Proteins zu gewährleisten, mischen Sie 5 μM gereinigtes DHDDS mit 10 μM FPP und 50 μM 14 C-IPP, um die Reaktion in Puffer A mit 0,5 mM MgCl 2 bei 22 - 30 ° C einzuleiten.
Hinweis: Die genauen Reaktionsbedingungen können mit den von DHDDS verschiedenen Zubereitungen von cis- PTs variieren. Darüber hinaus hängt die Aktivität von DHDDS auch von der Temperatur und [Mg 2+ ] ab.
Achtung: 14 C-IPP ist radioaktiv und sollte nach den örtlichen Strahlenschutzvorschriften verwendet werden. Nach der sofortigen Abschreckung der Reaktion durch Zugabe von 15 μl Puffer A, ergänzt 20 mM EDTA (bis zu einer Endkonzentration von 10 mM EDTA), wurden 15 μl Proben aus der Reaktion bei 0, 2, 4 und 6 h abgezogen. - Füge 1 ml H 2 O-gesättigtes 1-Butanol hinzu und verwirre mich gründlich, um die Reaktionsprodukte zu extrahieren.
Hinweis: Das Protokoll kann hier gestoppt und die Samples zum späteren Lesen gehalten werden. - Füge Szintillationscocktail zu den Proben hinzu und unter Verwendung eines Szintillationszählers die Reaktionsprodukte in der Butanolphase, die 14 C umfasst, zusammen mit der Radioaktivität von 15 μl aus dem Reaktionsgemisch quantifizieren, was die gesamte Radioaktivität darstellt.
- Subtrahieren Sie die Hintergrundwerte, die mit den 0 h Proben von jedem Zeitpunkt gemessen wurden, und berechnen Sie den Prozentsatz von 14 C-IPP, der verwendet wird.
- Berechnen Sie den Netto- 14- C-IPP-Einbau zu jedem Zeitpunkt, indem Sie den Prozentsatz aus der Gesamtmenge 14 berechnen 14- C-IPP-Einbaus mit der Zeit wird erwartet.
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Representative Results
Ein allgemeiner Überblick über das hier verwendete Konstrukt und den Reinigungsprozess sind in Abbildung 1 dargestellt . Die bei jedem Reinigungsschritt erhaltenen Proben sind in Fig. 2 gezeigt . Diese SDS-PAGE-Analyse zeigt die schrittweise Reinigung von DHDDS, was zu einem hochgereinigten Produkt führt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der analytischen SEC des gereinigten Enzyms und zeigt, dass das Protein nur als Homodimer beobachtet wird. Fig. 4 zeigt einen repräsentativen zeitabhängigen Aktivitätsassay. 14 C-IPP-Einarbeitung deutlich über 6 h steigt, wobei bestätigt wird, dass das gereinigte Enzym funktionell ist.
Abbildung 1: Menschliches DHDDS Klonen und Reinigen . (
Abbildung 2: Reinigung von humanem DHDDS . SDS-PAGE-Analyse der menschlichen DHDDS-Affinitätsreinigungsschritte. Spur 1, Molekulargewichtsmarker (kDa); Spur 2, Rohextrakt; Spur 3, Co 2+ -IMAC Durchfluss. Pfeil zeigt das TRX-DHDDS-Fusionsprotein an; Spur 4, Co 2+ -IMAC-Eluat; Spur 5, Protein-TEV-Protease-Mischung nach über Nacht-Inkubation; Spur 6, Co 2+ -IMAC Durchfluss nach TEV-Spaltung; Spur 7, Co 2+ -IMAC-Eluat nach TEV-Spaltung; Spur 8, gereinigte menschliche DHDDS (IndMit einem Pfeil versehen) nach der Größenausschlusschromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Analytische SEC von gereinigtem menschlichem DHDDS. Tryptophan-Fluoreszenz wurde wie im Protokoll beschrieben überwacht. Nach der Eichkurve dieser Säule bildet DHDDS ein Homodimer (77,4 kDa). Der Pfeil zeigt die Leerlaufmenge an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig. 4 : TiMich-abhängige Aktivität von gereinigten menschlichen DHDDS. In-vitro- Aktivität von gereinigtem humanem DHDDS in der Reaktion mit 10 μM FPP und 50 μM 14 C-IPP als Substrate wird als IPP-Inkorporation pro Protein (mol / mol) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Reinigung von funktionellen humanen DHDDS in E. coli- Zellen ist einfach und effizient, so dass man das Protein in 3 - 4 Tagen überexprimieren und reinigen kann, sobald ein geeignetes Konstrukt vorliegt. Solche Protokolle für die Proteinreinigung sind bei den Durchbrüchen in der Genomsequenzierung von besonderer Bedeutung, die eine Fülle von Informationen über die Genetik vieler Krankheiten 18 lieferte und damit die Entwicklung von Hochdurchsatzmethoden zur Charakterisierung pathogener Mechanismen auf Proteinebene 19 erfordert.
Um gemeinsame Fallstricke bei der heterologen Proteinüberexpression und -reinigung zu überwinden, wurden hier mehrere Maßnahmen ergriffen, die entscheidend sind, um erfolgreich lösliche und funktionelle Proteine zu erhalten. Zuerst wurde DHDDS als TRX-Fusion überexprimiert. TRX erleichtert das Fusionsprotein-Falten und erhöht die Löslichkeit des Fusionsproteins und verhindert die Aufnahme bOdybildung 20 Als nächstes wurde zur Erhöhung der Proteinausbeute das DNA-Konstrukt für die Expression in E. coli 21 codonoptimiert . Um die Wahrscheinlichkeit der Einschlusskörperbildung weiter zu verringern, wurde die Expression des Proteins bei 16 ° C induziert, um die Proteinsyntheserate zu verlangsamen, was wahrscheinlich die Proteinfaltung 22 unterstützt .
Unter Berücksichtigung der Homologie von cis- PT unter verschiedenen Spezies schlagen wir vor, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann 1 . Unter Verwendung des aktuellen Protokolls als Ausgangspunkt und unter Angabe der allgemeinen Richtlinien, die für die DHDDS-Expression entscheidend sind, kann diese Methode für eine optimale Expression verschiedener cis- PTs modifiziert werden. Zum Beispiel kann man verschiedene Fusionspartner (wie z. B. Maltose-bindendes Protein) versuchen oder die Kulturbedingungen für das zu untersuchende spezifische Protein weiter optimieren.
<P class = "jove_content"> Mit ihrer biomedizinischen und biotechnologischen Bedeutung 1 , 7 , 8 wird die zukünftige Verwendung des beschriebenen Protokolls, um große Mengen an gereinigtem funktionellen DHDDS zusammen mit anderen cis- PT zu erhalten, die Verfolgung ihrer strukturellen und funktionellen Charakterisierung zu ermöglichen . Zum Beispiel werden weitere molekulare Untersuchungen von DHDDS die Mechanismen lösen, die der DHDDS-bedingten Retinitis pigmentosa zugrunde liegen, was möglicherweise zur Entdeckung und Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze führt. Zusätzlich, da prokaryotische cis- PTs an der bakteriellen Wandsynthese beteiligt sind, bildet diese Gruppe von Enzymen möglicherweise neue Ziele für neue antibakterielle Mittel. In der Tat kann eine gründliche Charakterisierung der eukaryotischen und prokaryotischen Enzyme Studien die rationale Entwicklung von antimikrobiellen Arzneimitteln, die für prokaryotisches cis- PT selektiv sind, ermöglichen. Schließlich, da Naturkautschuk synthetisiert wird bY-Mitgliedern der cis- PT-Familie, kann der hier beschriebene Ansatz zukünftige Verwendung in der Naturkautschuk-Industriesynthese finden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Zentrum für Forschungs-Exzellenz der Israelischen Wissenschaftsstiftung (I-CORE) in der Strukturzellbiologie (1775/12) und die Israelische Wissenschaftsstiftung 1721/16 und 2338/16 (YH) und 825/14 (DK ). Die Unterstützung der Fields Estate Foundation an DK wird sehr geschätzt. Diese Arbeit wurde von Ilan Edri und Michal Goldenberg in Teilerfüllung der MD-Thesis-Anforderungen der Sackler Fakultät für Medizin, Tel Aviv Universität durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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