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Immunology and Infection

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

doi: 10.3791/56443 Published: April 13, 2018

Summary

Descrevemos um não-invasivo multimodal de imagem abordagem baseada na Micro-CT e fluorescência molecular tomografia computadorizada para avaliação longitudinal do rato modelo fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal duplo da bleomicina.

Abstract

Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar fatal caracterizada pela destruição progressiva e irreversível da arquitetura do pulmão, que causa deterioração significativa na função pulmonar e subsequente morte por insuficiência respiratória.

A patogênese da IPF em modelos animais experimentais tem sido induzida pela administração de bleomicina. Neste estudo, investigamos um modelo IPF-como rato induzido por uma duplo intratraqueal instilação de bleomicina. Padrão histológicas Avaliações para estudar fibrose pulmonar são procedimentos invasivos de terminais. O objetivo deste trabalho é monitorar a fibrose pulmonar através de técnicas de imagem não invasivas, como tomografia computadorizada Molecular fluorescente (FMT) e Micro-CT. Essas duas tecnologias validadas com as conclusões de histologia poderiam representar uma abordagem revolucionária funcional para monitoramento invasivo em tempo real de progressão e severidade da doença IPF. A fusão das diferentes abordagens representa mais um passo para a compreensão da doença IPF, onde os eventos moleculares que ocorrem em uma condição patológica podem ser observados com a FMT e as subsequentes alterações anatômicas podem ser monitoradas por Micro-CT.

Introduction

Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar crônica, com diminuição progressiva das funções pulmonares que infelizmente muitas vezes fatal dentro de quatro anos de diagnóstico1. Os principais recursos do IPF são proliferação de fibroblastos e deposição de matriz extracelular, mas a patogênese não é ainda totalmente compreendida. A hipótese mais apoiada é que vários ciclos de lesões pulmonares causam a destruição das células epiteliais alveolares que leva à alteração da proliferação mesenquimal ciclo celular, exagerado acúmulo de fibroblastos e miofibroblastos, e produção de matriz aumentada. Mediadores envolvidos nestes processos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs) foram encontrados prejudicado no desenvolvimento de fibrose na IPF humana ou em modelos animais induzida por bleomicina. A produção descontrolada de MMP leva a uma deposição de colágeno desequilibrada dentro do interstício pulmonar e o espaço alveolar, imitando anormal ferida reparo1,2.

Um dos principais obstáculos para a descoberta de medicamentos e desenvolvimento é a disponibilidade de modelos de mouse acessível que imitam a patogênese humana e o fenótipo da doença. Diferentes agentes têm sido utilizados para induzir fibrose pulmonar em modelos animais: danos de irradiação, administração de asbesto e sílica, administração de citocinas fibrinogenic e bleomicina3,4; no entanto, bleomicina é a mais usada em ratos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos5 ou em grandes animais (primatas não-humanos, cavalos, cães e ruminantes)6,7. Bleomicina é um antibiótico feito pela bactéria Streptomyces verticillus8 e é usada como um agente anticâncer9. Fibrose pulmonar é um efeito colateral comum da droga e por esta razão, é usado em modelos animais experimentais para induzir fibrose pulmonar.

Em modelos de fibrose pulmonar induzida por bleomicina, as lesões fibróticas ocorrerem 14-21 dias após a administração de bleomicina. No trabalho apresentado, usamos um novo protocolo para induzir fibrose pulmonar em camundongos por instilação intratraqueal de bleomicina duplo. O modelo do rato de bleomicina é muito demorado, porque novos medicamentos precisam ser avaliadas em lesões fibróticas estabelecidas e testada para distinguir seus efeitos antifibróticos de efeitos anti-inflamatórios.

Bioquímica determinação do teor de colágeno, morfométricas e análise histológica foram baseadas na análise de post mortem, limitando a possibilidade de acompanhar a patogênese da doença no mesmo animal. Apesar desses parâmetros considerados padrão ouro para avaliação de fibrose, eles não fornecem qualquer distribuição espacial ou temporal da lesão fibrótica e impede uma maneira de investigar o processo de progressão da doença. 10

Recentemente, as tecnologias de imagem não-invasivos foram aplicadas ao monitor remodelação de vias aéreas, inflamação e progressão da fibrose em modelos murino: ressonância magnética (MRI), Micro Tomography do computador (Micro-CT), fluorescência Molecular Tomografia computadorizada (FMT) e bioluminescentes (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Propomos uma abordagem de imagem não-invasivos para monitorar a progressão de fibrose pulmonar por FMT e Micro-CT em diferentes pontos de tempo após uma bleomicina desafiar22longitudinalmente.

Muitos caminhos estão envolvidos na criação e no desenvolvimento de fibrose, e não se sabe muito. Somente uma compreensão mais profunda destes processos poderia traduzir para mais alvos de drogas que podem transferir para a clínica. A capacidade de monitorar longitudinalmente ativação MMP por tomografia de fluorescência molecular acoplada para a detecção de alterações parenquimatosas pulmonares por Micro-CT pode ser usada no futuro para acessar a resposta clínica ao tratamento.

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Protocol

Todas as experiências com animais aqui descritas foram aprovadas pelo Comité de bem-estar animal intramural a experimentação animal de Chiesi Farmaceutici e ERASMUS MC sob número de protocolo: EMC 3349 (138-14-07), em conformidade com o Europeu UE Directiva 2010/63, LGS italiano 26/2014 e a revista "Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório"23.

Nota: Antes da utilização, camundongos C57Bl/6 (7-8 semanas de idade) puras fêmeas foram aclimatados pelo menos 7 dias para as condições de viveiro local (temperatura: 20-24 ° C; umidade relativa do ar: 40-70%; ciclo claro-escuro de 12-h), tendo acesso gratuito ao comer roedor padrão e água de torneira amaciada.

1. intratraqueal de tratamento dos ratos com bleomicina

  1. Prepare o equipamento para a instilação traqueal intra12,13,14.
  2. Coloque os ratos na câmara anestésica, conectada a um vaporizador de isoflurano fixado em 2,5%, misturado com oxigênio. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de uma resposta de dedo-pinch. O efeito da anestesia ocorreu após 3-5 min.
  3. Posicione o mouse anestesiado na plataforma de intubação, pendurá-lo pelos seus incisivos colocada no fio.
  4. Ligue o laringoscópio, levar um par de pinças terminou sem corte e usar a pinça ou ponta do laringoscópio suavemente, abrir a boca.
  5. Puxe a língua para fora e segure-o para o lado com fórceps. Coloque a lâmina do laringoscópio rumo à parte posterior da boca até a abertura da traqueia é visualizada e mantenha o laringoscópio no lugar.
  6. Com a outra mão, inserir a extremidade do tubo conectada à extremidade do tubo na traqueia, girando a válvula de três vias de PE. Entrega 50 µ l de bleomicina (0,020 µ g/mouse). Após a instilação, rapidamente Retire o tubo da traqueia para evitar asfixia. Segure os ratos na posição vertical por alguns segundos.
    1. Administrar intratraquealmente bleomicina no dia 0 e repita no dia 4 (Figura 1).
  7. Retire o mouse da plataforma de intubação e monitorar o mouse por 30 min (o tempo necessário para se recuperar totalmente da anestesia).
  8. Execute na vivo de imagem nos pulmões de ratos por FMT e Micro-CT após a instilação de bleomicina duplo no dia 7, 14 e 21.

2. Imaging in vivo por fluorescência Molecular Tomography

Nota: De antemão, prepare uma solução de stock fresca 6 nmol/ml de MMP sensível fluorescente substrato 680 em solução salina (0,9% de cloreto de sódio), loja e protegido da luz a 4 ° C antes do uso. É estável por até 6 meses a 4 ° C. Permitir que a MMP imagem agente para equilibrar a temperatura ambiente antes de injetar em animais.

  1. Injeção de sonda
    1. Prepare o equipamento para injecção intravenosa de solução de sonda a MMP. Pré-aquecer a água a 50 ° C para aquecer a cauda de rato.
    2. Para Segure com firmeza a nuca de rato, levá-lo pela cauda e permitir que ele Segure a tampa da gaiola. Segurando os ratos através de ombros do animal, coloque o rabo num copo de água morna, para 4 a 8 lesões s de térmicas de máxima para evitar queimaduras na pele da cauda.  Verifique as veias inchaço para mais fácil visualização e inserção da agulha.
    3. Durante o procedimento de injeção, colocar os ratos em uma retenção de plástico para mantê-lo firme e puxar o rabo, através de um furo na parte de trás. Encontrar as duas veias caudais em ambos os lados da cauda; Não a artéria, na parte inferior da cauda.
    4. Introduza a agulha (26G) de seringa de 1 mL na veia. Se a agulha está colocada correctamente, injeção será fácil e a solução de sonda fluirá no recipiente.
    5. Injecte a solução de sonda MMP 10ml/kg.
    6. Descarte a agulha.
      Nota: O ponto ideal de tempo imagem é 24 h após a injeção de sonda MMP porque é o tempo necessário pela sonda para ser ativado. Se forem realizados estudos longitudinais, o tempo ideal de re-injecção é 7 dias, o que permite a liberação completa do agente do mouse.
  2. Imagem de FMT
    Nota: Antes de começar, retire sempre a pele em e em torno das áreas do animal que estão a ser fotografada, neste caso, o peito, para evitar a dispersão e a absorbância no tecido.
    1. Para anestesiar o mouse, colocá-lo na câmara anestésica e gire o dial de isoflurano para indução de 2,5% e 2% para manutenção.
    2. Inicializar o software de aquisição de dados e abrir um novo estudo do banco de dados para o experimento.
    3. Antes de iniciar a imagem com a FMT, transferi o mouse dentro da imagem. Coloque o mouse anestesiado no meio da imagem latente gaveta para otimamente, use o campo de visão do FMT. Manter os ratos plana, seguro e suavemente compactado contra ambas as janelas da fita de imagem. Ajuste de altura por botões na fita e em seguida, deslize-o na estação de ancoragem.
    4. Clique sobre o assunto na janela de verificação e clique em Visualização para ver a imagem ao vivo.
    5. Desenhe a região de varredura suficientemente grande para que o tecido circundante área antecipada da fluorescência é capturado. Incluindo um total de garantias de varredura 25 pontos na região do pulmão será totalmente digitalizada.
    6. Uma vez que o ROI é desenhado, primeiro clique em Adicionar à fila de reconstrução e clique em digitalizar para o mouse de imagem. Certifique-se que o laser correto em 680 nm é selecionado.
    7. Quando estiver concluída a aquisição da imagem, posicione o mouse volta para sua jaula. Certifique-se de que ele se recupere totalmente da anestesia.
    8. Quantificar os picomoles de fluorescência na janela de análise do software de análise usando a ferramenta ROI e reduzir o ROI em torno de 700-800 mm3 do sinal proveniente da região de pulmão. Tenha cuidado para excluir o sinal do fígado. Copie o ROI sobre os outros assuntos para tê-los semelhantes em dimensão e ajustar sua posição em cada imagem animal.
    9. Exporte imagens como arquivos jpg.

3. imagem latente na Vivo por Micro-CT

Atenção: Antes de começar, retire sempre qualquer metal joias ou objetos de metal perto da área de imagem, para evitar o espalhamento de raios-x.

Nota: A fibrose pulmonar induzida por radiação é que um achado comum durante a radiação induzida de lesão pulmonar24. Micro-CT derivado índices nem achados histológicos associados com fibrose pulmonar estavam presentes nos ratos controle tratados salina no dia 21 sujeitado a Micro-CT quatro sessões de imagem, indicando que a dose de raios-x entregues aos animais durante a Micro-CT exames não foi suficiente para afetar as conclusões.

  1. Ligue o Micro-CT premindo o botão verde poder e lançar o software para aquecer a fonte de raios-x. Use o pequeno furo e a cama do animal para os ratos de imagem.
  2. Criar o banco de dados clicando no novo banco de dados para um novo e construir o navegador baseado no número de ratos no experimento, ou clique em conexão com o banco de dados existente para salvar os dados para um criado anteriormente.
  3. Antes de iniciar a varredura, selecione os parâmetros de aquisição na janela de controle do software: tensão do tubo de raio x, 90 kV; Corrente de tubo de raio x CT, 160 µA; Viver o tubo de raio x atual, 80 µA; FOV, 36 mm; Nenhuma técnica associada; Verificação técnica, alta resolução 4 min.
  4. Anestesiar os ratos por inalação de 3% de isoflurano e colocá-los na cama inserida o furo com um cone de nariz, proporcionando um fornecimento constante de anestésico. Imobilize as patas dos ratos com fita em cima da cama, para permitir que o peito para ser exposto.
  5. Deslize a porta do instrumento e ativar o Modo de viver para ver a posição do mouse em tempo real, pressionando o botão de captura. Afastar a cama animal para alinhar o peito com o campo de visão (FOV) usando os botões diretamente no instrumento CT. Centro da varredura do mouse; Se não ajustar a posição com as setas esquerda e direita localizadas no instrumento CT.
  6. Confirme a posição da cama ideal girando o pórtico selecionando 90 ° e clicando em definir. Certifique-se que a região a imagem está totalmente dentro do FOV.
  7. Não aplicar qualquer técnica associada e iniciar a varredura clicando no botão de tomografia computadorizada . Clique em Sim para a mensagem que informa que a fonte de raios-x será ativada.
    Nota: Uma vez que as radiografias estão ativadas, acende a lâmpada cor de laranja em cima do instrumento e a porta de correr será impossível de abrir para a segurança do operador. Quando a digitalização estiver concluída, uma nova janela do software 2D Viewer aparece mostrando o transaxial, coronal e sagital fatia da reconstrução.
  8. Verificar a qualidade da imagem e não se esqueça de ter borrado imagens de movimentos devido ao baixo nível de anestesia. Se necessário, repita o exame.
  9. Coloque os animais de volta para a jaula e certifique-se de que eles se recuperar totalmente da anestesia.

4. broncoalveolar

  1. Anestesia animais com 3% de isoflurano e sacrifício por sangramento da aorta abdominal.
  2. Use uma tesoura para expor a caixa torácica e pescoço. Em seguida, expor a traqueia e faça uma pequena incisão para permitir que o procedimento de BAL, a ser realizada com um tubo de calibre 21 lavagem anexado a uma seringa de 1 mL sem a agulha. Preste atenção para não cortar a traqueia.
  3. Para executar o BAL, encha a seringa de 1 mL sem agulha com 0,6 mL de solução estéril [10 x Hank está equilibrada solução salina (HBSS); ácido de 100mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic de 1mm (HEPES); água destilada água].
  4. Insira o tubo de lavagem a incisão na traqueia e, lentamente, injetar e retirar a solução 3 vezes, pausando sobre a terceira retirada para permitir a melhor coleção da LBA para análise posterior.

5. histologia e Histomorfometria

  1. Expor e remover os pulmões, inflando-os com uma cânula através da traqueia por infusão suave com 0,6 mL de formol a 10% neutro-tampão e armazenar as amostras à temperatura ambiente por 24 h.
  2. Desidratar amostras através de diferentes passagens em concentrações crescentes de soluções de álcool (etanol 60% por 1h, etanol a 70% para 1 h, 90% de etanol por 1h, etanol a 95% para 2h e 100% de etanol para 2h) usando um processador automático de tecidos.
  3. Colocar as amostras em xilol para 2h para torná-los translúcidos. No final da desidratação, infiltrar-se amostras em parafina a 60 ° C por 3 h e incorporá-los no processador automatizado.
  4. Obter 5 µm espessura seções de serial usando um micrótomo rotativo.
  5. Deparaffinize e reidratar slides em graus decrescentes de etanol e mancha com Masson Trichrome usando um processador automático de tecidos.
  6. Concentre-se em fatias de pulmão, digitalização ampliação de X 20 usando um scanner de slides e capturar imagens digitais de seções de pulmão inteiro usando o software de visualização com uma resolução de 451 nm/pixel manualmente.
  7. Morfologicamente avalie lesões pulmonares fibróticas pelos parâmetros quantitativos e semi-quantitativa da seguinte forma:
    1. Determine a pontuação de Ashcroft. Semi-quantitativamente grau mudanças morfológicas nas seções de pulmão, de acordo com a escala definida por Ashcroft10 modificado por et al . Hübner 25 a utilização do sistema de 8-0 Pontuação para avaliar o parênquima todas as seções do pulmão.
    2. Determine o teor de colágeno. Quantificar o grau de fibrose10,25 pelo software de análise de imagem do microscópio. Selecione aleatoriamente três ROIs na ampliação de 10x, por cada slide. Pela padronização das configurações de limite de cor, detecta o colágeno como área manchada de verde.
    3. Determine a área de ar Alveolar. Quantificar a área de ar alveolar como um parâmetro indireto de fibrose10,25. Através do mesmo software e ROIs aplicados para a fração de fibrose, detecta a área de ar dentro do ROIs usando um limite branco.

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Representative Results

Resolução espontânea das lesões fibrose pulmonar observado três semanas após a administração única de bleomicina e moderadas alterações estruturais destacam os limites deste modelo. Tratamento preventivo só pôde ser executado devido a estreita janela terapêutica que não representam a prática clínica17.

Aqui, demonstramos que nosso protocolo de instilação intratraqueal de duplo bleomicina é capaz de desenvolver duradouro fibrose pulmonar em ratos18. O delineamento experimental é mostrado na Figura 119,20,21. O objetivo deste estudo é olhar para a progressão de fibrose pulmonar em camundongos com tecnologias de imagem não-invasivos. Bleomicina era intratraquealmente administrado duas vezes (no dia 0 e 4; 1 mg/kg de bleomicina em 50 µ l de cada vez). Doze ratos para cada grupo foram desafiado com o mesmo volume de veículo só ao mesmo tempo que o grupo de bleomicina para usar como um controle de intratraquealmente. Para a avaliação da fibrose, uma análise histológica semi-quantitativa foi feita com base na Ashcroft sistema de pontuação. 10

No presente trabalho, avaliamos o desenvolvimento de fibrose pulmonar em modelo de rato induzida por bleomicina, usando tecnologias de Micro-CT e FMT em combinação com histologia clássica. A natureza não-invasiva de tecnologias de imagem representa o valor real de avaliação pré-clínica de progressão de fibrose pulmonar e o acordo com a histologia é um excelente passo. Micro-CT imagem poderia desempenhar um papel importante na quantificação de alterações parenquimatosas de pulmão devido a lesões fibróticas longitudinalmente.

Fotos de histologia da bleomicina trataram grupo apresentou padrão de fibrose, a partir de dia 7, principalmente como único massas fibróticas, pronuncia-se e progrediu no dia 14 de conglomerados confluentes de colágeno substitutivo e permaneceu inalterado até dia 21 ( Figuras 2A - 2C). Tratamento de bleomicina induzida inflamação pulmonar(Figura 3),onde o número de WBC foi significativamente maior no LBA de ratos de bleomicina Tratado em 7, 14 e 21 dias comparar ao grupo do veículo. Curiosamente, as frações de linfócitos e monócitos também foram aumentadas em cada tempo de amostragem (Figura 3B-3C); em contraste, observou-se um aumento significativo da fração de neutrófilos no dia 7 (Figura 3-D).

Neste estudo, o Micro-CT foi usado para monitorar as alterações do parênquima pulmonar longitudinalmente. Alterações anatômicas progressivas da arquitetura do pulmão em pontos diferentes do tempo de observação da linha de base são claramente vistas nas projecções de Micro-CT (figuras 4A-4B). O raio das vias aéreas na parte distal da árvore brônquica (figuras 5A e C 5)19,20,21 e percentual de fibrose pulmonar total (figuras 5B e 5D) poderia quantificar a progressão da fibrose. A quantificação de percentual de fibrose no grupo de tratamento de bleomicina no dia 7 (Figura 5D) ligeiramente foi superestimada, se comparada à histologia marcando. Isto poderia ser explicado por uma reação de dupla de início de inflamação e fibrose, tornando-se difícil distinguir entre os dois sintomas. O raio das vias aéreas e a percentagem de fibrose foram selecionados de processamento de imagem das projeções Micro-CT para a quantificação do pulmão alterações parenquimatosas (Figuras 5 C-5 D)19,20,21 . Esses parâmetros de Micro-CT são muito bem de acordo com achados histológicos como mostrado nas Figuras 2A/2C.

Micro-CT imagem diretamente reflete as alterações patológicas e terapêuticas do parênquima pulmonar e tecnologia FMT fornecido informações quantitativas mais relacionado com a expressão da proteína gostado de IPF. Para este estudo, optamos por uma sonda MMP com base na sua relevância para a IPF e encontrámos ativação específica de MMPs no bleomicina tratada ratos (Figura 6)18. O papel das MMPs foi investigado pela injeção de veículo ou bleomicina tratou ratos com sondas fluorescentes activable de MMP em pontos de tempo selecionado. Vinte e quatro horas após a injeção, os ratos foram fotografados por FMT revelando que ratos fibróticos podem ativar o específico MMP sonda fluorescente na vivo (figuras 6A-6D)18 e ex vivo (Figura 6E)18 .

Figure 1
Figura 1 : Experimental criado para a fibrose pulmonar induzida por bleomicina rato. C57Bl/6 ratos fêmeas ou tinham solução salina ou bleomicina inculcado intratraquealmente em duas ocasiões, dia 0 e 4. Os ratos foram fotografados por um scanner de Micro-CT na linha de base (dia 0), 7, 14 e 21 dias. Grupos de 12 ratos foram sacrificados no 7, 14 e 21 dias e seus pulmões foram avaliados para deposição de colágeno correlacionar os resultados histológicos com imagens obtidas por µCT. Esta figura foi modificada o artigo publicado21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: curso de tempo de análise histológica da bleomicina induzida por fibrose pulmonar em camundongos. 
(A) a quantificação de fibrose pulmonar por Ashcroft marcar qualquer veículo ou bleomicina tratados ratos em pontos diferentes do tempo. O experimento foi repetido três vezes, e cada ponto representa a média ± SEM de 12 animais. Análise estatística foi realizada pela ANOVA seguida pelo teste de Tukey. * p < 0,05; * * p < 0,01.
(B) Ashcroft distribuição de frequência de Pontuação alocada em subcategorias de leves, moderadas e severas.
(C) histologia representativa de tricomas de Masson manchado bleomicina de seções para intratraquealmente duplo instiladas de pulmão de rato ou salinos ratos tratados em 7, 14 e 21 dias pós tratamento (ampliação 10x, escala bar 200 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: curso a tempo para o LBA de bleomicina infiltração celular induzida por fibrose pulmonar em camundongos. 
O (A) número de WBC, (B) monócitos, linfócitos (C) e (D) neutrófilos. Células encontradas no LBA foram expressos em número de células * 103/µL. O experimento foi repetido três vezes, e cada ponto representa a média ± SEM de 9 animais. Análise estatística foi realizada pela ANOVA seguida pelo teste de Dunnett. * p < 0,05; * * p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Projeções de imagens de Micro-CT longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina e veículo trataram de ratos. (A) Micro-CT, mouse de bleomicina Tratado e (B) Micro-CT, salino Tratado mouse clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Airways, quantificação de lóbulos fibrose pulmonar e segmentação com base nas imagens repetidas de Micro-CT.
(A) Airways foram divididos em uma parte central e distal. (B) a parte distal das vias aéreas é tracto intrapulmonar, usado para identificar e dividido em lóbulos pulmonares como: lobo Cranial do direito (RCrL), lobo médio direito (RMdL), direito lobo Caudal (RCdL), direito acessório lobo (RAcL) e pulmão esquerdo (LL). (C) o raio das vias aéreas e (D) total de quantificação de fibrose pulmonar veículo ou bleomicina tratados ratos em pontos diferentes do tempo. Cada ponto representa a média ± SEM de 5 animais, para um total de 30 ratos. Análise estatística foi realizada pela ANOVA seguida pelo teste de Dunnett. * p < 0,05; * * p < 0,01. Esta figura foi modificada o artigo publicado21Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura . 6. tempo curso de fluorescência sinal medido pela FMT inbleomycin induzida ratos de fibrose pulmonar. In vivo (A e B) e ex vivo FMT (C e D) imagens representativas dos ratos injetados com sonda MMP trataram com veículo ou com bleomicina. (E) o montante total do sinal de fluorescência do pulmão foi calculado automaticamente pelo software de imagem FMT. O experimento foi repetido três vezes, e cada ponto representa o média ± desvio-padrão de 9 animais. Análise estatística foi realizada pela ANOVA seguida pelo teste de Dunnett. * p < 0,05; * * p < 0,01. Esta figura foi modificada o artigo publicado18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Apesar de muitos grupos de pesquisa se concentra no desenvolvimento de novos medicamentos para tratar o IPF, no momento apenas dois estão disponíveis para os pacientes. Há uma necessidade urgente de médica para encontrar mais eficazes terapias7 porque só pulmão transplantationis capaz de prolongar a sobrevivência de 4-5 anos26. O pré-requisito essencial para o desenvolvimento de novas drogas e medicina translacional é a disponibilidade de um modelo animal que imita as características da IPF e em quais estudos intervencionais são preditivos de sucesso na clínica. No entanto, a utilidade dos modelos animais existentes fibrose pulmonar é ainda controverso27. Desenvolvemos um novo modelo de mouse de fibrose pulmonar que requer uma dupla instilação da bleomicina, conforme descrito na Figura 118. Tecnologias de imagem são ferramentas poderosas para visualizar a progressão da doença e a resposta farmacológica para tratamento. Este modelo animal recapitulada melhor os recursos humanos da IPF e tecnologias não-invasivas poderiam criar uma ponte entre configurações pré-clínica e clínica27.

No entanto, para obter dados robustos e reprodutíveis, alguns passos são cruciais. A instilação endotraqueal deve ser realizada quando os ratos são totalmente anestesiados, usando um procedimento padronizado. Aquisição de micro-CT exige muito acurada monitoramento da anestesia, porque as projeções de CT são bloqueadas pela frequência respiratória. Antes de imagem, verifique se os ratos tem a mesma profundidade de anestesia. Um passo muito importante para a imagem latente ótica por FMT é depilação. Antes de começar, retire sempre a pele em e em torno do peito, para evitar a dispersão e a absorbância no tecido. A injeção de sonda precisa ser corrigido pelo peso do corpo do animal.

A possibilidade de investigar e quantificar uma leitura molecular específica com alterações anatômicas nos ratos mesmos em pontos de tempo diferente representa um grande passo no desenvolvimento de fibrose de compreensão, um óbvio avanço para funcional, bem como farmacológicas estudos.

Este multimodal abordagem de imagem é uma ferramenta inteligente para avaliar a eficácia de drogas, fornecer muito mais informações em relação ao terminal avaliação, traduzindo-se em um processo de descoberta de medicamentos mais eficiente.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer a Dr. Daniela Pompilio e Roberta Ciccimarra para ajuda técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos
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Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).More

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

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