Summary
Méthodes de détection courantes utilisant l’amplification du génome viral sont limités par leur incapacité de discriminer infectieuses de particules non infectieuses. Le but de cet article est de fournir des protocoles détaillés pour des méthodes alternatives aider à la discrimination des particules infectieuses norovirus à l’aide de la liaison aptamère, diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission.
Abstract
Les norovirus humains exige considérablement la santé publique et pertes économiques dans le monde entier. Émergents en vitro culture avances ne sont pas encore applicables pour la détection systématique du virus. La détection du courant et les techniques de quantification, qui reposent principalement sur l’amplification des acides nucléiques, ne soient pas distinguent infectieuses de particules virales non infectieuses. Le but de cet article est de présenter des détails spécifiques sur les progrès récents dans les techniques utilisées ensemble afin d’obtenir davantage d’informations sur l’état de l’infectiosité des particules virales. Une technique consiste à évaluer la liaison d’un aptamère d’ADNsb norovirus à capsides. Aptamères ont l’avantage d’être facilement synthétisé et modifié et sont peu coûteux et stable. Une autre technique, dynamic light scattering (DLS), présente l’avantage d’observer le comportement de la capside en solution. La microscopie électronique permet pour la visualisation de l’intégrité structurale de le capsides virales. Bien que prometteurs, il y a quelques inconvénients de chaque technique, telles qu’aptamère non spécifiques à la liaison aux molécules chargées positivement de matrices de prélèvement, exigence de capside purifiée pour DLS et une sensibilité médiocre pour la microscopie électronique. Néanmoins, lorsque ces techniques sont utilisées en combinaison, le corps des données produites fournit des informations plus complètes sur l’intégrité de capside des norovirus qui peut être utilisée pour déduire l’infectiosité, information qui est essentielle pour une évaluation précise des Méthodes d’inactivation ou de l’interprétation de détection de virus. Cet article fournit des protocoles permettant d’utiliser ces méthodes pour discriminer les particules infectieuses norovirus humain.
Introduction
Norovirus humain est responsable d’un fardeau considérable de santé publique dans le monde, provoquant des maladies environ 685 millions et 212 000 décès chaque année1, à un coût en milliards de dollars2,3. Aujourd'hui, dosage et détection des norovirus implique l’amplification du génome et/ou plates-formes ligand. Le premier est généralement privilégié car il est plus sensible, fournit des renseignements quantitatifs et a généralement moins de risques de faux positifs4. Technique la plus courante norovirus détection et la quantification du génome amplification est la réaction en chaîne polymérase quantitative de la transcriptase inverse (RT-qPCR). Parce qu’il vise et amplifie un petit segment du génome humain norovirus, RT-qPCR seul n’est pas capable de distinguer les infectieuses et particules non infectieuses, comme l’ARN génomique gratuit, endommageant capsides contenant les génomes et capsides avec mortellement génomes muté/tronqué peuvent encore être amplifiées par RT-qPCR. Alors que deux nouveaux in vitro des techniques culturales pour norovirus humain5,,6 ont été signalés récemment, tous les deux encore s’appuient sur la RT-qPCR pour la quantification des virus et ne sont pas encore des méthodes de routine clinique/environnement tests pour les norovirus humains. Ainsi, la RT-qPCR demeure l’étalon-or pour les essais cliniques sur l’environnement.
Autres méthodes in vitro ont été développés afin de mieux estimer le statut infectieux des particules de norovirus. Ces méthodes peuvent être généralement classés comme ceux qui portent sur l’intégrité de la capside des norovirus et ceux évaluant l’intégrité du génome. La première approche est plus populaire. Une méthode couramment utilisée est le prétraitement RNase avant l’extraction de l’ARN génomique viral, mais cela ne tient pas compte des particules virales qui restent intactes, mais n’ont pas la capacité de lier les récepteurs/co-facteurs de l’hôte, ainsi que les particules virales qui ont muté mortellement ou ont tronqué ou légèrement endommagé génomes7. Intégrité de capside peut également être évaluée basés sur la capacité du virus à se lier aux norovirus humains co-récepteur/co-facteurs, qui est des glucides appelés antigènes de groupe de histo-sang (HBGAs). HBGAs sont présents dans les cellules épithéliales intestinales hôte dans le cadre des glycoprotéines ou glycolipides (parmi de nombreux autres tissus) et peuvent être sécrétées dans les fluides corporels comme la salive. Les bactéries entériques contenant des substances de type HBGA sur leurs surfaces ont également montrés pour lier les norovirus humains8,9,10, et ces interactions peuvent promouvoir des norovirus infection5. Le concept de base de l’utilisation de la liaison de HBGA est que seules des particules virales capables de lier le putatif du récepteur/co-factor serait capables d’infecter les cellules. Plusieurs études suggèrent que la liaison de HBGA axée sur la perle qui précède l’amplification des acides nucléiques est une méthode prometteuse pour l’infectivité discrimination11,12,13,14, 15,16. Un défi majeur au sujet de la HBGAs, c’est qu’aucun type HBGA unique ne peut lier tous les génotypes de norovirus humain. Pour y remédier, mucines gastrique, qui contient HBGAs, a été utilisé à la place des glucides HBGA purifiés dans l’intérêt de la facilité de synthèse, la cohérence et coût réduit.
Une publication récente de Moore et al. 17 a présenté un ensemble de nouvelles techniques d’estimation des norovirus humains intégrité de capside. À la place de HBGAs, Moore et al. 17 a étudié la liaison d’a globalement réactif acide nucléique aptamère (M6-2)18 et globalement réactif anticorps monoclonal (NS14)19 au traité thermiquement capsides de norovirus GII.4 Sydney (Pseudo-particules virales ou PPV) et comparait cette pour la liaison à HBGAs synthétiques. Aptamères nucléotidiques sont courtes (~ 20-80 nt) unique échoués des acides nucléiques (ADN simple brin ou ARN) qui incorporer des structures tridimensionnelles uniques en raison de leur séquence et lier une cible. Parce qu’ils sont des acides nucléiques, ils sont moins coûteux ; facilement chimiquement synthétisés, purifiée et modifiée ; et à la chaleur. Plusieurs rapports d’aptamères générés contre le norovirus existent, avec certains d'entre eux montrant large réactivité à une variété de souches18,20,21,22. A titre d’exemple, Moore et al. 17 a démontré qu’aptamère M6-2 lié à norovirus humains purifiés, assemblé capsides (VLP) et se sont comportés de la même façon à HBGA dans le recours à la capside virale pour maintenir la structure de la protéine ordre (p. ex., secondaire et tertiaire) plus élevée pour liaison de se produire. En revanche, une proportion significative de liaison VLP norovirus à anticorps NS14 resta après que capsides ont été complètement dénaturés. Évaluation de la liaison de norovirus dans l’étude de Moore et al. 17 a été réalisée selon une méthode simple, axée sur la plaque similaire à ELISA, à l’exception que les aptamères sont utilisés à la place de l’anticorps (d'où la méthode a été appelée ELASA). Cette méthode expérimentale à haut débit a été utilisée pour évaluer les effets des différents traitements sur la capside des norovirus, travail qui est utile pour comprendre le mécanisme d’inactivation virale lors de l’exposition aux facteurs de stress physiques ou chimiques. Cependant, un inconvénient de cette méthode est la plus faible sensibilité et manque de tolérance pour les contaminants associés à matrice à des niveaux supérieurs qui causent les liaisons non spécifiques par aptamères.
Moore et al. 17 a utilisé une autre méthode, diffusion de lumière dynamique (DLS), pour surveiller l’agrégation des particules virales en réponse à un traitement thermique. DLS est couramment utilisée pour évaluer la taille des nanoparticules suspensions et a été étendue aux protéines23,virus et24 25,26,27. L’intensité de la lumière diffusée par les particules en solution fluctue en fonction de la taille des particules, permettant le calcul du coefficient de diffusion, puis diamètre des particules à l’aide de formules bien établies. La technique DLS peut distinguer le diamètre hydrodynamique des particules dispersées à l’échelle nanométrique, qui permet de détecter des virus dispersées, protéines de la capside individuels ou dimères et agrégats de virus basés sur la taille27. Agrégation de virus, représentée par une augmentation de la taille des particules, est révélateur de la perte d’intégrité de la capside. La capside est dénaturée et perturbée de sa structure, résidus hydrophobes deviennent exposées et entraîner les particules à se serrer les coudes et forment des agrégats. Listes de distribution peut être utilisé pour mesurer la taille des particules après un traitement précis ou la cinétique d’agrégation en temps réel17,28. Cette méthode a l’avantage de permettre l’observation du comportement de la capside en solution mais requiert des concentrations élevées de capside purifiée, qui n’est peut-être pas tout à fait représentatives du virus dans son état naturel.
La dernière méthode utilisée par Moore et al. 17 a : microscopie électronique à transmission (TEM). Bien que cette méthode manque de sensibilité et ne produit pas de données quantitatives, il permet la visualisation des effets des différents traitements sur la structure de la capside virale. Bien que pas encore idéal pour les paramètres cliniques et environnementales, l’utilisation de ces méthodes en combinaison est utile dans la compréhension de l’inactivation des norovirus humain. Le but de cet article est de fournir des protocoles approfondies pour l’analyse de la liaison basée sur un plaque (ELASA), DLS, et les méthodes de préparation de TEM utilisées pour étudier les effets des traitements thermiques sur la capside des norovirus dans le contexte des effets des traitements sur la capside intégrité, tel que présenté dans Moore et al. 17.
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Protocol
1. essai de Binding reposant sur la plaque pour évaluer perte de plus élevés ordre Norovirus capside Structure
Remarque : un protocole ELASA très similaire à celui présenté ici a été publié 29, et similaires ELASA tests précédemment ont été signalés comme partie de la recherche les articles ailleurs 17 , 18 , 22.
- Du traitement thermique des capsides GII.4 Sydney norovirus humains obtenir norovirus humains purifiés majeure de la capside (VP1) de Sydney GII.4 (adhésion : JX459908) assemblés dans des capsides.
NOTE : Capsides dans l’étude ont été obtenus avec la permission de R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
Capsides - diluer à 50 µg/mL en 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2) pour un volume maximal de 15 µL dans des tubes PCR plafonnés individuels. S’assurer que le tube contienne au moins 600 ng de capside. Veiller à ce qu’il y a 600 ng de capside par combinaison de traitement-ligand.
- Préchauffer le thermocycleur à un traitement thermique désiré.
NOTE : aux fins du présent protocole, traitement à 68 ° C pour des moments différents (0 - 25 min) a été choisie. - Préchauffer un thermocycleur supplémentaire à 4 ° C pour un refroidissement immédiat. Ajouter des tubes avec solution de capside au thermocycleur pour la durée désirée. Transférer immédiatement au cycleur préalablement refroidi à 4 ° C pendant 5 min après le chauffage.
Traitement
- Include 95 ° C pendant 5 min comme un contrôle de capside dénaturé. Comme témoin positif, mentionnons la solution de capside non traitées (23 ° C). Inclure les PBS avec aucun capside comme un contrôle négatif supplémentaire.
- Tourner brièvement vers le bas dans une centrifugeuse pour obtenir toutes les gouttelettes au fond du tube et de diluer les solutions de capside traitée dans du PBS à 3 µg/mL. S’assurer qu’il n’y a au moins 200 µL de capside dilué, traitée (100 µL/puits).
- Du traitement thermique des capsides GII.4 Sydney norovirus humains obtenir norovirus humains purifiés majeure de la capside (VP1) de Sydney GII.4 (adhésion : JX459908) assemblés dans des capsides.
- Appliquer 100 µL de solution de capside dans chaque puits, s’assurant il y a au moins deux puits par traitement. En outre, inclure 2 puits de contrôle avec 100 µL de PBS pour chaque ligand ; Cela donne l’absorbance de fond du dosage. Couvrir la plaque avec un couvercle, joint les bords avec de la paraffine pour réduire l’évaporation du film et laissent une nuit sur un agitateur incubateur à 4 ° C ou pendant 2 h à température ambiante.
- Préparer le tampon de blocage en faisant 5 % de solides de lait écrémé (p/v) dans du PBS avec 0,05 % Tween 20 (PBST).
- Enlever les solutions traitées capside de la plaque. Ajouter 200 µL/puits de tampon de blocage. Incuber pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit, scellée à 4 ° C.
- Préparer le ligand liant des solutions pour l’aptamère biotinylé M6-2 18 , 29 et biotinylé synthétique HBGA sang type A biotinylé type H.
- Diluer l’aptamère biotinylé à 1 µM dans l’eau exempte de nucléase. Veiller à ce qu’il y a suffisamment de 200 µL de solution totale pour chaque traitement. Diluer le biotinylé choisi HBGA à 30 µg/mL dans le tampon de blocage. Veiller à ce qu’il y a suffisamment de solution pour le volume total de 200 µL pour chaque traitement.
Remarque : Pour utiliser moins HBGA, 10 µg/mL de HBGA à 0,25 % de lait écrémé-PBST peut être substitué. Concentrations biotinylé M6-2 et HBGA ont été précédemment optimisées et rapportées.
- Diluer l’aptamère biotinylé à 1 µM dans l’eau exempte de nucléase. Veiller à ce qu’il y a suffisamment de 200 µL de solution totale pour chaque traitement. Diluer le biotinylé choisi HBGA à 30 µg/mL dans le tampon de blocage. Veiller à ce qu’il y a suffisamment de solution pour le volume total de 200 µL pour chaque traitement.
- Retirer un tampon bloquant et laver les plaques 3 fois avec 200 µL/puits PBST. Pat la plaque à l’envers sur des essuie-tout stérile pour sécher l’humidité résiduelle. Solutions de liaison
- Ajouter 100 µL/puits du ligand, veillant à ce qu’il y a 2 puits par combinaison de traitement thermique-ligand. Incuber la plaque recouverte d’un couvercle dans un agitateur orbital à environ 60 tr/min pendant 1 h à température ambiante.
Remarque : Veillez à inclure les 2 puits de chaque des capsides non traitées et des capsides complètement dénaturés pour chaque ligand comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Comporte en outre, 2 " sans capside " puits pour chaque ligand comme la plaque de fond contrôle. - Enlever les solutions de ligand et laver les puits 3 fois avec 200 µL/puits PBST. Pat la plaque à l’envers sur des essuie-tout stérile pour sécher l’humidité résiduelle. Peroxydase de streptavidine-raifort
- Ajouter 100 µL/puits de la solution de 0,2 µg/mL dans du PBS. Incuber pendant 15 min à température ambiante avec agitant doucement dans un agitateur orbital.
NOTE : Différentes streptavidine-raifort peroxydase conjugués auront différentes concentrations. Consulter l’utilisateur ' Manuel de s pour la plage idéale de concentration pour des applications de ELISA d’enzyme et être sûr que c’est optimal. - Supprimer la solution de conjugué. Laver 3 fois avec 200 µL/puits PBST. Pat la plaque à l’envers sur des essuie-tout stérile pour sécher l’humidité résiduelle.
- Ajouter 100 µL/puits 3,3 ', 5,5 '-substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) et laisser la couleur se développer pour les 5-15 min. puits de contrôle négatif respecter impérativement pour toute couleur et n’oubliez pas de développer systématiquement pour le même temps entre plaques répétées. Être au courant de la gamme d’absorbance du lecteur utilisé, aussi bien.
NOTE : Les temps de développement peuvent différer selon la qualité des ligands/réactifs utilisés. - Arrêter le développement de la réaction avec l’acide phosphorique de 1M 100 µL/puits. Lire immédiatement plaque à 450 nm. Enregistrer les données.
NOTE : Introduction de l’acide généralement ralentit la réaction drastiquement, mais ne l’arrêtera pas complètement. Ne laissez pas la plaque d’arrêtée pendant un certain temps avant de lire l’absorbance.
2. Analyse des résultats d’analyse axée sur la plaque
- enregistrer les données brutes d’absorbance dans un tableur. Produire les absorbances moyennes pour chaque paire bien avec le traitement spécifique et le ligand. Utilisez ces moyennes pour toutes les analyses subséquentes.
Remarque : Comparer les deux absorbances bien pour être sûr qu’aucune paire de puits n’ont des valeurs sensiblement disparates. - Pour analyser l’intégrité absolue de la capside (liaison de tous), soustraire l’absorbance brute de la " sans capside " contrôle de chaque autre valeur d’absorbance échantillon.
Remarque : Vous pouvez également perte de liaison en raison de la perte de commande supérieur (secondaire, tertiaire, quaternaire) structure peut directement être analysé. Au lieu de soustraire l’absorbance du contrôle négatif (aucune capside), soustraire la valeur du contrôle capside complètement dénaturé. Ce enlève toute liaison signal en raison de la non spécifique liant à l’appareil mais aussi contraignante en raison de la séquence de la capside. HBGA aptamère M6-2 affichage peu contraignant à capside dénaturé totalement, donc soit méthode produit des résultats similaires. Faux signaux positif attribué à liaison aptamère non spécifique doit être considéré lors du choix dont l’analyse utiliser. - Avec les absorbances corrigés contrôle négatifs ou dénaturés, divisez le traitement absorbances par leur respective positif (aucun traitement) contrôlent les absorbances et multiplient par 100. Ceci fournit le pourcentage du signal de la capside traitée par rapport aux témoins non traités.
- Pour estimer le degré de signal de liaison pour chaque ligand attribuable à la séquence de la capside, soustraire le " sans capside " contrôle des absorbances initiales négatif et prendre l’absorbance ajusté de la capside dénaturée. Cela divisez par l’absorbance ajusté de signaux positifs et multiplier par 100. Cela indique le pourcentage apparent du signal en raison de la liaison du ligand à séquence dénaturé capside/capside.
3. DLS pour détecter les Virus agrégation après traitement thermique
Remarque : Les étapes suivantes peuvent être spécifiques au logiciel et instrument utilisé, mais peut être adaptée et appliquée à des appareils similaires.
- Créer un nouveau format SOP dans les listes de distribution instrument logiciel utilisation : matériel = protéine, Dispersant = PBS, température = 25 ° C, temps d’équilibrage = 0 sec, type de cellules = godet jetable (petit volume, ZEN0040), angle de mesure = 173° rétrodiffusion, Durée de la mesure = automatique, nombre de mesures = 3, délai entre mesures = 0 sec, traitement de données : modèle d’analyse = usage général (résolution normale). Utilisez les paramètres par défaut pour tous les autres paramètres.
- Sélectionner la flèche verte d’exécution au sein du logiciel et le nom de l’échantillon.
- Suivez les étapes 1.1.1 par 1.1.4 pour le traitement thermique des VLP.
- Diluer la chaleur traités VLP 01:10 dans du PBS 1 x pour une concentration finale de 5 µg/mL. (Facultatif) Filtrer l’échantillon avec une taille de pore 1 µm pour éliminer les particules de poussière ; DLS est très sensible à la poussière, comme les grosses particules diffusent beaucoup plus de lumière que les petites particules. Cuve
- transférer 50 µL de VLP dilué dans un petit volume jetable. Introduisez la cuve dans le compartiment de mesure de l’instrument.
- Lancer l’exécution et utiliser le ' corrélogramme ', ' Cumulants Fit ', et ' des conseils d’experts ' onglets afin d’évaluer la qualité des données.
- Pendant la course, vérifier que la valeur d’index de polydispersité est inférieure à 0,3, ce qui représente une mesure de la qualité. dans la ‘ vue multiple ’ onglet, assurez-vous que le coefficient de corrélation est constante et proche de, mais pas plus de 1, à un peu de temps, et drops éteint brusquement à 0 à une date ultérieure, caractéristique de la taille des particules. Utilisation du ‘ des conseils d’experts ’ onglet de rétroaction sur la qualité des données au cours des mesures.
- Lorsque la mesure est terminée, vérifiez à nouveau que la valeur d’index de polydispersité est inférieure à 0,3. S’assurer que les cumulants ajustera suit ligne les points de données étroitement dans la ‘ Cumulants fit ’ Tab
- Prendre la moyenne du diamètre de particules Z-moyenne rapportée pour chaque mesure que la taille des particules de chaque échantillon. Tracer le diamètre exprimé en nm par rapport à la température en ° C.
4. DLS pour détecter les Virus agrégation en temps réel
Remarque : les étapes suivantes peuvent être spécifiques au logiciel et instrument utilisé, mais peut être adaptée et appliquée à des appareils similaires.
- Créer un nouveau format SOP dans les listes de distribution instrument logiciel utilisant : matériau = protéine, Dispersant = PBS, température = comme désiré, temps d’équilibrage = 0 sec, type de cellules = cuve quartz, angle de mesure = 173° rétrodiffusion, durée de mesure = automatique, Nombre de mesures = 50 (peut être le taux augmenté ou diminué selon le regroupement), délai entre mesures = 0 sec, traitement de données : modèle d’analyse = plusieurs modes étroits (haute résolution). Utilisez les paramètres par défaut pour tous les autres paramètres.
- Sélectionner la flèche exécution du logiciel d’ouvrir et de nommer un nouvel échantillon et laisser l’instrument atteindre l’équilibre de la température.
- Suspendre les PPV dans 1 X PBS dans un tube à microcentrifugation à une concentration de 5 µg/mL et un volume entre 200-500 µL. Vortex la suspension.
- Spin down la suspension VLP pendant 5-10 s dans une centrifugeuse de table à dé gaz. Cela aide à prévenir la formation de bulles lors du traitement thermique qui interfère avec les mesures de la taille.
- Transfert le VLP suspension à un quartz de faible volume godet-éviter les bulles et Pipeter lentement contre la paroi de la cuve. Après que l’appareil a atteint un équilibre de la température, insérer la cuvette dans le compartiment de mesure.
- Attendre 10 s pour la température de l’échantillon s’équilibrer, puis lancer l’exécution. Lancer une horloge au début de la course. Arrêter la minuterie à la fin de la première mesure. Prenez cette fois le premier point de temps. Obtenir des points dans le temps ultérieur depuis les temps les mesures enregistrées par le logiciel.
- Lancer l’exécution et de surveiller le corrélogramme, s’adapter et distribution des conseils d’experts pour évaluer la qualité des données.
Remarque : Le PDI nécessairement ne sera pas qu'inférieure à 0,3 pour ces mesures comme l’échantillon devrait être polydispersés au cours de l’agrégation.- Assurez-vous que le coefficient de corrélation est constante et proche de, mais pas plus de 1 dans peu de temps et tombe brusquement à une ou plusieurs fois plus tard, caractéristiques de la taille des particules.
- S’assurer que la distribution se suit ligne les points de données étroitement.
- Analyser les données de taille.
Point
- déterminer chaque fois de la différence de temps entre chaque mesure et le point de temps initial. Durées de mesure ne sont pas tous exactement les mêmes.
- à l’aide d’une distribution d’intensité, enregistrer la taille des sommets avec les plus grandes régions pour chaque point de mesure/temps.
- Tracer le diamètre de pointe en nm / temps en min.
5. Préparation des échantillons TEM
- support en carbone Obtain grilles de film (nickel) conçus pour TEM.
Remarque : Consulter le laboratoire central sur réactifs recommandés ainsi que leur manipulation pour une utilisation avec le microscope de l’installation. N’oubliez pas de stocker des grilles dans une boîte contenant un sachet déshydratant ou une chambre à vide pour minimiser l’exposition à l’humidité. - Larme à environ 5 cm x 5 cm morceaux de papier filtre. Obtenir verre Pétri et bon à autofermeture inverser pincettes conçu pour être utilisé en microscopie.
- Couper environ 2,5 cm x 5 cm film de paraffine. Place sur le banc.
- Le traitement thermique des capsides de norovirus GII.4 Sydney
- suivre la procédure de traitement thermique exactement comme décrit ci-dessus aux points 1.1.1 - 1.1.5 sauf : utiliser 10 mM HEPES (pH 7,4) pour traitement au lieu de PBS et ne diluez pas davantage les capsides après le traitement (garder une solution à 50 µg/mL). Déposer la goutte de tout ~ 15 µL de solution de capside traités sur la pellicule de paraffine.
- Saisir le bord de la grille avec la pince à épiler, ce qui leur permet de fermer sur le bord pour tenir la grille et placez la grille carbone-côté-vers le bas sur le dessus de la goutte de la solution traitée. Laisser incuber pendant 10 min permettre la capside attacher à la grille de.
- Selon la pureté de la préparation de la capside, ajouter des lavages de la solution HEPES 10 mM si nécessaire sous la forme de 10-15 gouttes µL mis en ligne après la gouttelette de capside traitée.
- Bout de 10 min, ramasser la grille avec la goutte. Placez la grille presque perpendiculaire à un morceau de papier filtre à mèche à la goutte. Ramasser les gouttelettes de 10-15 µL de tampon de HEPES avec la grille, maintenez pendant 30 s, puis la mèche loin avec un autre morceau de papier filtre à Washington
- Place une goutte 15 µL de solution d’acétate d’uranyle de 2 % sur le film de paraffine dans une zone vide.
- Ramasser la goutte de l’acétate d’uranyle avec la grille et maintenez pendant 45 s. Wick à l’acétate d’uranyle, en veillant à retirer la plus grande partie de la solution. Placer la grille carbone-face vers le haut sur un morceau de papier filtre, en prenant soin que la grille n’est pas " bâton " de l’humidité sur la pince à épiler. Placer le papier filtre avec la grille là-dessus dans un verre ouvert Pétri.
NOTE : N’utilisez pas de boîtes de Pétri en plastique, car les grilles seront électrostatiquement attirés par eux et sont coincer dans plat à.
- Ramasser la goutte de l’acétate d’uranyle avec la grille et maintenez pendant 45 s. Wick à l’acétate d’uranyle, en veillant à retirer la plus grande partie de la solution. Placer la grille carbone-face vers le haut sur un morceau de papier filtre, en prenant soin que la grille n’est pas " bâton " de l’humidité sur la pince à épiler. Placer le papier filtre avec la grille là-dessus dans un verre ouvert Pétri.
- Répéter pour tous les traitements. Placer les moitiés de Pétri avec les grilles dans un dessicateur, du jour au lendemain, sécher avant d’observer avec TEM.
- Consulter l’installation de la microscopie à l’institution respectif en ce qui concerne observant les grilles préparées. Certains établissements permettent à l’utilisateur d’être formé sur le fonctionnement de leurs installations ' instrument s. Des détails spécifiques concernant l’installation et l’observation d’un microscope spécifique est bfaudrait-il le champ d’application du présent article.
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Representative Results
L’intégrité structurale des capsides de norovirus humain GII.4 Sydney (VLP) a été évaluée à l’aide de plusieurs méthodes novatrices présentées par Moore et al. 17. tout d’abord, il a été faite une expérience dans laquelle l’intégrité des capsides en fonction de leur capacité à lier un putatif du récepteur/co-factor (HBGA) ou aptamère d’ADN simple brin (M6-2) ont été comparé (Figure 1). Les résultats affichés ont été précédemment présentés par Moore et al. 17et démontrer que le comportement de liaison aptamère M6-2-capside était similaire à celle des virus-HBGA lie exposition à 68 ° C un traitement thermique pour différentes durées d’exposition. Alors que le signal de liaison HBGA a perdu un peu plus tôt que que de l’aptamère M6-2, M6-2 affiche un taux de perte de signal calculé après les PPV ont été exposés à 65 ° C et 68 ° C pendant des temps différents points (tableau 1)17similaire. Ceci suggère que les HBGA et liaison aptamère M6-2 abolie de manière similaire.
DLS mesures démontrent qu’agrégation en raison de la dénaturation de protéines susceptible l'correspond avec perte de signal de liaison de ligand (Figure 2), comme un diamètre hydrodynamique est supérieur à 100 nm a été observée après environ 18 min de traitement à 68 ° C. Ce sont les conditions à laquelle une perte complète de liaison HBGA et presque toute perte de signal de liaison pour aptamère M6-2 (> 80 %) s’est produite (Figure 1)17. TEM résultats corroborent ces observations comme changements morphologiques et agglutination des capsides est devenu de plus en plus évident à mesure que la température augmentait progressivement entre 60 ° C et 80 ° C pendant 1 min (Figure 3 a). Un phénomène similaire a été observé après avoir réchauffé les capsides à 68 ° C jusqu'à 25 min, mais la résolution du TEM a été que moins prononcée (Figure 3 b)17.
Figure 1 : fixation de Conformation dépendante de deux différents ligands à capsides de norovirus GII.4 Sydney soumis à traitement thermique. Purifiée capsides GII.4 Sydney (VLP) ont été soumis à un traitement thermique à 68 ° C pour des quantités différentes de temps, et la liaison à type de sang A HBGA et aptamère M6-2 a été évaluée à l’aide d’une analyse axée sur la plaque de fixation ELASA. L’axe des ordonnées affiche le signal d’absorption observé pour un traitement (temps d’exposition) en pourcentage d’un contrôle de capside non traitée. Ce chiffre a été précédemment présenté et ce chiffre a été modifié par Moore et al. 17 barres d’erreur représentent ± 1 écart-type de signal %. Les données sont pour au moins trois plaques répétées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : exemple de listes de distribution des données pour les norovirus traité thermiquement capsides de Sydney GII.4 idéal et ambigu/basse qualité des résultats. Capsides (VLP) ont été soumis à un traitement thermique à 65 ° C et 68 ° C, et leur taille a été suivie en temps réel. Panneau (a) correspond à une haute qualité, mesure du coefficient de corrélation claire ; et (b) à une faible qualité, mesure du coefficient de corrélation ambigu. Panneau (c) affiche des données de taille de particules, montrant un profil clair agrégation des capsides traités à 68 ° C ; et (d) montre des données de taille de particules ambigu pour capsides traité thermiquement. Certaines de ces données sont présentées, et donc cette image a été modifiée de Moore et al. 17 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : TEM des capsides de norovirus GII.4 Sydney soumis à différents traitements thermiques. Capsides purifiées (VLP) ont été soumis à divers traitements thermiques et observés au microscope électronique à transmission. Panneau (a) montre les données pour les capsides chauffés à différentes températures (60, 65, 70, 75 et 80 ° C) pour 1 min. paroi (b) montre les capsides, soumis à un traitement pour les 0 - 25 min. (bar) à 68 ° C sur la photos de droite représente 100 nm. Ces images sont présentées en Moore et al. 17 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Taux de décroissance exponentielle (% signal/min) | |||
| Température | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligand | |||
| HBGA Type A | 2,50 ± 0,24 | 13.30 ± 1,15 | |
| Aptamère M6-2 | 2,47 ± 0,66 | 13.18 ± 0,47 | |
Tableau 1 : taux de décroissance exponentielle des capsides de norovirus GII.4 Sydney traitement à 65 ° C et 68 ° C. Capsides ont été soumis à des traitements thermiques pour divers moments à 65 ° C et 68 ° C, refroidi à 4 ° C et leur capacité à lier synthétique HBGA ou aptamère évalués. Le taux de perte de signal au fil du temps (décroissance) a ensuite été calculé avec chaque ligand pour chaque température. Ces données ont déjà été présentées au Moore et al. 17 les données sont présentées sous forme de % signal/min ± 1 écart-type de signal %.
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Discussion
Le protocole et les techniques décrites ici constituent un moyen d’évaluer les norovirus humains capside intégrité/fonctionnalités. Ces méthodes peuvent être utilisés pour l’obtention de mécaniste dans les effets de l’inactivation des traitements contre le virus et potentiellement peuvent compléter les méthodes d’évaluation inactivation plus traditionnels tels qu’essai RT-qPCR ou plaque. Par exemple, l’évaluation de l’inactivation chimique ou physique par des essais de plaque seul fournit une mesure du degré d’inactivation des virus, mais pas le mécanisme sous-jacent de cette inactivation. Aussi, agrégation de virus peut donner lieu à une sous-estimation du titre et donc surestimer l’efficacité de traitement30. Ces méthodes peuvent éclairer davantage cette étude en fournissant des informations sur les effets d’un traitement sur l’intégrité de la capside des norovirus. Récemment, deux in vitro (culture de cellules) méthodes de culture pour les norovirus humains ont été signalés5,6; elles dépendaient encore des PCR pour le dénombrement de virus, bien que théoriquement l’enteroid modèle présenté pourrait être utilisé pour DICT50 utilisant des anticorps pour la détermination de la réduction relative de coloration. Les méthodes présentées ici pourraient avoir utilité pour comprendre le mécanisme complet d’inactivation virale pour plusieurs différents types de traitements au-delà de tout traitement thermique. Par exemple, liaison du ligand axée sur la plaque et TEM ont été utilisés comme outils pour compléter les données de test RT-qPCR et plaque pour déterminer le mécanisme de l’inactivation de norovirus sur31,surfaces de cuivre32, au contact de l’argent de dihydrogène citrate de33et de traitement haute pression hydrostatique14.
Il y a plusieurs étapes dans ces protocoles dans lequel une attention aux détails méthodologiques est cruciale. Plus précisément, pour l’essai de plaque, grande attention est versée à la mémoire tampon utilisée pour diluer le ligand pour la liaison. Aptamère M6-2 et ADNsb aptamères en général, sont sensibles au sel des concentrations et des conditions de mémoire tampon. En utilisant un tampon non optimale avec l’aptamère peut l’ablation obligatoire. Bien qu’aptamère dans que M6-2 a été utilisé avec succès dilué les selles humaines, trop d’interférence de selles/matrice peut interférer avec la liaison, qui est conforme aux observations des autres norovirus humains aptamères18,22. Un des principaux facteurs causant ce sont que les aptamères peuvent montrer un certain degré de liaison non spécifique aux molécules chargées positivement. Ainsi, cela pourrait conduire à un certain degré de faux signaux positif avec le test décrit ici. Cela peut s’expliquer en sélectionnant un témoin négatif qui est une matrice complexe sans virus ou une protéine non apparentée. De même, la concentration de HBGA et la quantité de solides de lait écrémé utilisé dans le tampon de liaison peuvent affecter significativement positif et les signaux de fond. Notez que HBGAs différents ont des degrés d’affinité à différentes souches du norovirus humain, les tampons de liaison devrez peut-être être optimisée selon HBGA type14,31,33. Semblable il conviendrait dans la mémoire tampon utilisée pour le conjugué de peroxydase de raifort streptavidine, que les concentrations de différents fabricants peuvent différer ; Cependant, beaucoup moins variabilité s’attendrait compte tenu de la forte affinité de la Streptavidine-biotine interaction34. En raison de la grande faculté d’adaptation de cette méthode axée sur la plaque, il est relativement simple de dépannage résultats sous-optimaux. Par exemple, dans le cas des signaux ambiants, optimisation en augmentant que la concentration de lait écrémé et de la concentration de ligand baisse peuvent être étudiées et vice versa pour les plaques avec faibles signaux positifs. Pour TEM, une des considérations plus importantes est l’utilisation de matériaux non statique (comme le verre) lors de stockage/manutention de grilles, que les grilles sont extrêmement difficiles à manipuler autour de matériaux tels que des plats de Pétri jetables. Si ces matériaux sont utilisés, grilles auront tendance à « sauter » et de s’en tenir à la matière. En outre, il faut beaucoup de soin pour s’assurer qu’il n’y a aucune humidité résiduelle sur les grilles. Idéalement, un dessiccateur à vide doit être utilisé s’il est disponible.
Lors d’expériences à l’aide de listes de distribution, la pureté de l’échantillon est un facteur très important. Les fonctions utilisées pour établir une corrélation entre les changements dans l’intensité de la diffusion de la lumière au diamètre dépendent ayant monomodaux ou restreindre la distribution des particules multimodal. Impuretés jusqu'à l’échelle nanométrique, y compris les protéines, introduisent la polydispersité et modifient les calculs de taille. Aussi, l’intensité de la lumière dispersée est proportionnelle au diamètre élevé à une puissance de 6, donc grosses particules comme la poussière gênent considérablement les mesures. Formation de bulles lors des traitements thermiques en temps réel se traduit par des résultats absurdes en raison de la lumière diffusée par les bulles fluctuantes. Concentration de capside (VLP) doit aussi être considéré comme à l’aide de listes de distribution. Concentrations de l’échantillon doivent être suffisamment élevée pour produire le signal suffisant et suffisamment bas pour éviter la diffusion multiple. Il est également d’une importance vitale à l’entrée du matériel correct et dispersant, car ces valeurs sont utilisées par le logiciel pour les calculs de taille. En particulier, les dispersant viscosité est fonction de la température et doit être ajustée en conséquence lors de traitements thermiques (le logiciel utilisé a viscosité dépend de la température d’eau construit en).
Bien que les méthodes décrites ici offrent de multiples possibilités de meilleurs moyens d’évaluer l’intégrité de la capside, ils ne sont pas parfaits. Parce que ces méthodes nécessitent de très fortes concentrations de virus, ils doivent être utilisés avec des capsides purifiées, assemblés au lieu de virus infectieux natives. Les PPV utilisés ici se composent de la protéine majeure de la capside des norovirus humain (VP1), qui assemble dans la capside des norovirus sans acide nucléique viral. Bien que ces VLP ont des comportements similaires sur le plan antigénique à capsides virus infectieux, ils peuvent être plus sensibles à l’inactivation. En outre, les PPV sont difficiles à produire et purifier et ne sont pas facilement disponibles pour de nombreux chercheurs. Utilisation de purifiée norovirus humain (p. ex., à l’aide d’ultracentrifugation) est possible mais disponibilité des échantillons de selles humaines positives norovirus est limité et même avec purification, titres de virus peuvent ne pas être assez grande pour accueillir les méthodes décrit ici. Les travaux futurs à optimiser les dosages pour utilisation du semi-purifiée virus infectieux dans les selles sont actuellement en cours. En fait, cela a déjà été démontrée pour la plaque essai18,22, mais serait sans doute plus compliqué pour les listes de distribution. Il convient également de noter que ces méthodes étaient seulement appliquées pour évaluer l’intégrité de la capside après application d’un procédé physique (chaleur) approche inactivation, ce qui est connu pour affecter directement la capside. Résultats peuvent être plus ambiguës étaient ces techniques utilisées pour évaluer l’intégrité de la capside à l’aide d’autres méthodes d’inactivation, tels que des agents chimiques ou de méthodes qui ciblent surtout destruction du génome viral. Cependant, certains rapports ont démontré favorablement les performances de la liaison de HBGA pour évaluer l’inactivation chimique31,33,35,36,37. À l’heure actuelle, les protocoles présentés ici sont mieux utilisés de concert avec la technique traditionnelle comme la RT-qPCR et plaque essais avec le virus de la mère porteuse.
Ces protocoles offrent qu'une alternative simple de comprendre les effets d’une méthode d’inactivation des virus physiques (chaleur) sur norovirus humains s’entend. Ces méthodes pourraient probablement être élargies pour une utilisation avec d’autres virus non enveloppés (p. ex., l’hépatite A et E virus), comme le principe global de détection de perte de structure des protéines plus élevée ordre est le même. En outre, l’utilisation de comportement et le potentiel d’autres ligands pour indiquant une perte d’intégrité de la capside devrait être évaluée. Adaptation des protocoles pour les matrices de prélèvement plus complexes et l’amélioration de leur sensibilité analytique (limite de détection) estégalement également une orientation future logique. Dans l’ensemble, les méthodes décrites ici constituent un moyen plus accessible de déterminer l’intégrité de capside des norovirus humains et mécaniste mieux comprendre les effets des traitements d’inactivation contre ce pathogène important.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Agriculture and Food Research Initiative compétitive Grant no 2011-68003-30395 du United States Department of Agriculture, Institut National de l’alimentation et l’Agriculture à travers le projet NoroCORE. Frais d’accès ouvert a été financé par l’United States Department of Agriculture. Nous tenons à remercier Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) de bien vouloir nous les capsides purifiées et Valerie Lapham pour son aide avec les images TEM. Nous tenons également à remercier Frank N. Barry pour nous aider à commencer les expériences présentées.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
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