Summary
Her, beskriver vi en protokol for hele mount immunofluorescens og image-baserede kvantitative volumetrisk analyse af tidlige fase mus embryoner. Vi præsenterer denne teknik som en kraftfuld tilgang til kvalitativt og kvantitativt vurdere hjerte strukturer under udvikling, og foreslår, at det kan være meget tilpasses andre organsystemer.
Abstract
Brugen af nogensinde fremme Billeddannende teknikker har bidraget bredt til vores øget forståelse af embryonale udvikling. Præ-implantation udvikling og organogenesis er to områder af forskning, der har nydt høj grad fra disse fremskridt, på grund af den høje kvalitet af data, der kan opnås direkte fra imaging præ-implantation embryoner eller ex vivo organer. Mens præ-implantation embryoner har givet data med særlig stor rumlig opløsning, har senere faser været mindre modtagelig for tre-dimensionelle genopbygning. Opnåelse af høj kvalitet 3D eller volumetriske data for kendte embryonale strukturer i kombination med skæbne mapping eller genetiske afstamning sporingen vil give mulighed for en mere omfattende analyse af de morfogenetiske begivenheder finder sted under embryogenese.
Denne protokol beskriver en helhed-mount immunofluorescens tilgang, der giver mulighed for mærkning, visualisering og kvantificering af stamfader cellepopulationer i udvikle hjerte crescent, en central struktur dannet under hjertet udvikling. Fremgangsmåde er udformet på en sådan måde, at både celle - og tissue-niveau oplysninger kan rekvireres. Brug Konfokal mikroskopi og billedbehandling, denne protokol giver mulighed for tre-dimensionelle rumlige genopbygning af den kardiale halvmåne, hvilket giver mulighed for at analysere lokalisering og organisation af specifikke stamfader befolkninger under denne kritiske fase af hjertet udvikling. Vigtigere, brug af reference antistoffer giver mulighed for efterfølgende maskering af den kardiale Halvmåne og efterfølgende kvantitative målinger af områder inden for Halvmåne. Denne protokol vil ikke kun gøre det muligt for en detaljeret gennemgang af tidlige hjerte udvikling, men med tilpasninger bør finde anvendelse på de fleste organsystemer i gastrula til tidlige somite fase mus embryo.
Introduction
Studiet af organogenesis har længe påberåbt sig observation af morfogenetiske begivenheder i den embryo under udvikling. Disse undersøgelser er ofte afhængige brug af fluorescerende farvestoffer eller afstamning sporingen journalister i kombination med mærkning af definerede reference populationer. 1 ved at sammenligne relative positioner af disse etiketter, oplysninger kan blive forstået på oprindelse, bevægelse eller ultimate bidrag af en population af interesse. Transplantation og skæbne kortlægning eksperimenter bruge enten morfologiske vartegn eller injektion af farvestoffer i ikke-motile lineages for at definere udgangspunktet for cellerne i interesse, som derefter undersøges for bidrag til de udviklede embryoner. 2 , 3 , 4 , 5 genetiske afstamning sporingen eksperimenter brug det samme koncept med veldefinerede reporter alleler, der bruges til at mærke cellepopulationer uden eksperimentelle manipulation. Nøglen til disse tilgange er evnen til at bestemme, med høj rumlige opløsning, placeringen af den eksperimentelle og reference etiketter. Disse tilgange har givet fremragende fremskridt i præ-implantation udvikling og explant organogenesis undersøgelser. 6 , 7 , 8 , 9
De udviklingsmæssige begivenheder, der ligger til grund for hjertet morfogenese har været i stigende grad godt beskrevet i de seneste år. 10 en af de store opdagelser i denne del af forskningen er beskrivelsen af et antal stamfader populationer, der kan adskilles ved ekspression af unikke markører. 11 disse populationer omfatter den første og anden hjerte felter (FHF og SHF), som er til stede i den hjerte Halvmåne på den forreste side af embryoet på embryonale dag (E) 8,25 mus udvikling. 12 disse befolkningsgrupper behandles ofte gennem en kombination af wide-felt mikroskopi, som indeholder væv-niveau information, og seriel skæring med immunofluorescens assays, der tilbyder høj cellulære opløsning men kun to-dimensionelle geografisk information. 13 således, mens disse undersøgelser har meget avancerede vores forståelse af hjertet udvikling, de tilgængelige metoder har begrænset i dybden kvantitativ analyse af morfogenese under disse faser, skaber behovet for tilgange til at undersøge de tilrettelæggelsen af disse befolkninger på et hele-organisme niveau.
De seneste fremskridt inden for både Konfokal mikroskopi og 3D billedanalyse giver mulighed for høj opløsning og høj overførselshastighed algoritmisk rekonstruktioner af celler og strukturer i situ med relativ lethed, dermed bane vejen for detaljerede undersøgelser af komplekse cellulære strukturer. 14 med forhøjelsen af datakraft og udviklingen af store-data administrerende algoritmer, begge er nødvendige for at håndtere den eksponentielle stigning i størrelsen af imaging datasæt, analyser kan nu være fuldt automatiseret. 15 automatiseret analyse af imaging datasæt har fordel af at være neutral, men det er kun så pålidelig som kvaliteten af det input datasæt; derefter, er det nødvendigt, at bedste praksis anvendes under erhvervelse og billede forbehandling til at sikre den højeste kvalitet, uvildig analyse. 16 protokoller kan blive fuldstændig automatiseret og delte for reproducerbarhed, og algoritmerne der bruges af leverandørejet software er let tilgængelig via biblioteker skal bruges af forskere, der har kendskab til moderne farmaceutiske eller open source udviklingsværktøjer. 17
Følgende protokol forklarer de nødvendige skridt for at udføre en sådan analyse på et veldefineret model af organogenesis, dannelsen af den kardiale Halvmåne under hjertet udvikling. Denne protokol beskriver specifikt, hvordan du (1) høst og dissekere hjerte Halvmåne fase embryoner, (2) udfører hele mount immunofluorescens for reference (Nkx2-5) og eksperimenterende (Foxa2Cre:YFP18,19) markører, (3) forberede og billede af embryoner ved hjælp af Konfokal mikroskopi, og endelig (4) analysere og kvantificere de fremkomne billeder ved hjælp af avancerede tredimensionale tilgange. Mens den kardiale Halvmåne bruges som et eksempel her, med passende ændringer, kan denne protokol anvendes til analyse af flere slægter i gastrula til tidlige somite fase embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. høst og behandling af kardiale Halvmåne fase embryoner
- Mate en frugtbar kvindelige mus med en frugtbar stud mandlig.
- Check for tilstedeværelse af en vaginal samleje plug ved hjælp af en stump sonde eller pincet. Middag på dagen for stik afsløring anses embryonale dag (E) 0,5 (Se figur 1A for fuld tidslinjen).
Bemærk: Stik skal checkes for om morgenen, da de er tabt i løbet af dagen. - Om morgenen den 8 th dag (E8.25), ofre den gravide dam af CO 2 indånding eller ifølge lokale og institutionelle bestemmelser.
Bemærk: Nøjagtige timing kan være stamme afhængige og bør fastsættes empirisk ved morfologi. - Spray maven af musen med 70% ethanol til at rense området og minimere udgyde. Udsætte indvolde ved at udføre en abdominal snit gennem både huden og kroppen væg.
- Find livmoderen og fjern forsigtigt det hele uterine horn fra dyret. Start med at skære over en oviduct, trimning fedt fra livmoderen under proceduren til cervikal enden. Skære gennem livmoderhalsen og fortsætte til den øvre ende af de andre oviduct, skære for at frigive hele livmoderen.
- Sted i livmoderen på en 10 cm parabol med phosphat bufferet saltvand (PBS, pH 7,4) til at vaske væk overskydende blod. Sub dissekere livmoderen ved at skære mesometrium mellem hver deciduum, som indeholder embryoner. Overførsel af embryoner til en 6 cm parabol med friske PBS.
- Under et mikroskop for dissektion, bruge fine pincet (#5) til at fjerne den uterine væv væk fra det decidual væv.
- Brug af pincet, skær forsigtigt spidsen af den embryonale halvdel af deciduum til at afsløre embryonet. Knivspids deciduum for at skubbe fosteret ud og træk forsigtigt embryonet.
- Dissekere lager extraembryonic væv så meget som muligt uden at beskadige morfologi af embryo ( figur 1B).
- Bruger en overførsel pipette til embryoner i en 1,5 mL tube med friske PBS og Anbring på is. Gentag 1,7-1,9 for de resterende embryoner før du fortsætter.
- Aspirat PBS og skylles en gang med PBS. Opsug PBS.
Bemærk: Prøv at fjerne så meget PBS som muligt uden at beskadige eller tørring af embryoner. Manuel fjernelse løsninger anbefales alle skridt til at undgå tab af embryoner. - Fix embryoner med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS for 1 h på RT.
Bemærk: Embryoner kan fastsættes overnatning (O/N) på 4 ° C. - Skylles tre gange med PBS. Opbevare embryoner ved 4 ° C indtil klar til at gå videre med immunofluorescens.
Bemærk: Pause punkt. Embryoner kan være sikkert gemt i PBS ved 4 ° C i flere uger.
2. Immunfluorescens farvning
Bemærk: nedenstående inkubation betingelser kan justeres til at rumme forskellige tidsplaner. Brug af blid ryster eller vuggende for alle lang inkubationstid trin anbefales.
- Fjerne PBS og tilsættes 1 mL blokerende buffer (0,5% saponin, 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS).
- Ruger mindst 4 h på RT. Dette kan også gøres O/N ved 4 ° C.
- Fjerner blokerende buffer og tilføje primære antistof blandingen fortyndes i blokerende buffer. Inkuber O/N ved 4 ° C.
Bemærk: Se materialer sektion for beskrivelse af antistoffer bruges og foreslog fortyndinger. Antistof fortyndinger bør fastlægges empirisk. Brug af Nkx2-5 som en reference plet til den kardiale crescent anbefales, og er nøglen til downstream billede segmentering og analyse trin. - Fjerne primære antistoffer ved aspiration.
- Vask 3 gange for 1 h med 0,1% Triton i PBS.
- Fjerne vask og tilføje sekundær antistof blandingen fortyndes i blokering buffer. Inkuber i 3 h på RT. Dette kan også gøres O/N ved 4 ° C.
- Vask 3 gange i 1 time med 0,1% Triton i PBS. Dette kan også gøres O/N ved 4 ° C.
- Kontrastfarve med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i PBS for 10 min.
Bemærk: Denne kontrastfarve kan udføres samtidig med sekundær antistof. - Vask 2 gange for 5 min med 0,1% Triton i PBS.
- Langsomt suspendere embryoner i anti-fade montering medier (2% w/v n-Propyl gallate (nPG), 90% glycerol, 1 x PBS; Se materialer afsnittet for flere detaljer). Lad blandingen henstår i mindst 1 time før montering. Forsigtigt svirp rør med jævne mellemrum for at hjælpe embryoner drop i anti-fade løsning.
Bemærk: Pause punkt. Embryoner kan opbevares i flere dage i anti-fade løsning indtil klar til at montere og billede.
3. Montering af embryoner til mikroskopi
- Forbered mikroskop slides til montering ved hjælp af enten dobbelt-stick tape eller silikone afstandsstykker. Hvis du bruger dobbelt-stick tape, gøre to parallelle stakke af 5-6 lag omkring 15-20 mm fra hinanden. Dette vil efterlade tilstrækkelig plads til at placere embryoner og sikre coverslip ( figur 1 c).
- Placere en 15 µL dråbe af anti-fade på diaset, mellem dobbelt-stick tape. Omhyggeligt overføre et embryon til diaset.
Bemærk: mere end ét embryon kan placeres på et dias. Men de efterfølgende orientering skridt er vanskeligere med flere embryoner, og længe imaging varigheder kan føre til foto-blegning. - Under en dissektion mikroskop ved hjælp af fine pincet, Placer fosteret sådan at den forreste side vender væk fra diaset med kroppen akse i overensstemmelse med den lange akse af diaset. Se figur 1 c for en skematisk af opsætningen montering.
- Omhyggeligt placere en coverslip over prøven ved hviler ene side på en stak af dobbelt-stick tape og bruge pincet til Sænk forsigtigt coverslip, indtil det kontakter de andre tape.
Bemærk: Trin 3.3 og 3.4 er afgørende for at sikre den korrekte orientering af Foster for billeddannelse. Ved at sænke coverslip langs posterior anterior retning, embryonet bør ikke rulle og hjerte Halvmåne regionen vil blive orienteret fra dias, som er ideel til billedbehandling på en inverteret mikroskop. - Bruge en pipette til at tilføje yderligere anti-fade mellem dias og coverslip at holde prøven fra at dø under opbevaring/imaging.
4. Konfokal Imaging
- erhverve billeder ved hjælp af den højeste forstørrelse mål, der giver mulighed for hele hjertets Halvmåne regionen til at blive fanget i et synsfelt. Bruge Nyquist prøveudtagning satser til at bestemme x-y-z voxel dimensioner. De fleste mikroskop fabrikanter vil have en " optimerer " knap hen til sikre Nyquist prøveudtagning.
Bemærk: Farvning for Nkx2-5 er gavnlige her, som det vil afgrænse hele hjerte Halvmåne regionen. Mindre Z-step størrelser (oversampling) vil give en bedre 3D-modellering resultater men kan føre til udvidet erhvervelse gange og/eller blegning for nogle prøver. - Oprettet imaging parametre ved hjælp af standard bedst tænkelig praksis. Nemlig, bruge den laveste mulige laser intensitet at opnå god signal-støj-forholdet for hver fluorophore og vælge gevinst og opveje niveauer, der giver et bredt dynamikområde uden mætte signalet.
Bemærk: Være i overensstemmelse med imaging parametre mellem prøver, der skal sammenlignes direkte. Dette er især vigtigt for downstream 3D analyse og kvantificering.
5. Billede analyse og kvantitative 3D modellering
NOTE: For denne protokol, blev billeder analyseret ved hjælp af Imaris softwarepakke. Lignende analyse kan være muligt ved hjælp af alternative pakker. Beskrivelsen nedenfor dækker analyse pipeline for reference kanal (dvs. Nkx2-5) og en eksperimentel kanal (dvs. YFP). Ekstra kanaler kan analyseres gennem gentagelse af disse trin. Et eksempel datasæt har været forudsat der kan bruges til at replikere analyse nedenfor.
- Indlæse raw-billede datasæt i Imaris Arena Se og åbne filen for ønskede embryo i overgå visning. Data skal indlæses i 3D-visning i MIP (max) tilstand. Åbn vinduet Display justering og vælg kun reference kanalen.
- Justere tærsklen på billedet, hvis det er nødvendigt for bedre visualisering. Til denne analyse, justere gamma hvis signal-støj-forholdet er for lavt for segmentering.
Bemærk: Hvis udfører gamma korrektioner, som er ikke-lineær tilpasninger, de justerede billeder kan ikke bruges til intensitet målinger eller sammenligninger. På dette tidspunkt kan du udføre yderligere billede forbehandling (dvs. belysningen korrektioner, Gaussisk sløring eller andre filtrering), hvis dit signal-støj-forholdet ikke er tilfredsstillende. Hvis du vælger at gøre forbehandling, skal du foretage de samme trin som forbehandling for alle billeder i datasættet. - Opret en ny overflade for reference kanal ved hjælp af dialogen overflade algoritme.
- Vælg den " Segment kun en Region af interesse " afkrydsningsfeltet.
- Justere afgrænsningsrammen boks regionen, så det indeholder regionen af interesse (ROI, dvs den kardiale Halvmåne område), som afgrænset af reference pletten.
- Vælg reference kanalen fra kildekanalen dropdown menu. Standardindstillingen for udjævning (lig med z voxel størrelse) er typisk tilstrækkelig men kan kræve empiriske optimering. Denne analyse, at bruge gulvafslibning lig med halvdelen af z voxel-størrelsen.
- Udføre tærskel af absolutte intensitet. For at sikre, at overfladen ikke overskride kanalen signalet, justere den nedre grænse ved hjælp af skyderne.
Bemærk: For visse billeder, hvor cellerne kan være afgrænset let, kan du medtage den " split rørende objekter " algoritme, yderligere adskille dit signal fra baggrunden. - Filter voxel antal eller volumen og Afvis baggrund (små eller fundet i områder uden for området Nkx2-5) objekter, algoritmen, der måske har genereret. Slut algoritmen.
- Ved hjælp af den nyoprettede overflade, oprette en maskeret kanal for den eksperimentelle kanal.
- Med den overflade, der er valgt, skal du vælge den " maske Sel... ͟ " funktion fra redigeringsvinduet.
- Vælg den eksperimentelle kanal af interesse (dvs. YFP). Sørg for, at den " duplikere kanal før du anvender maske " afkrydsningsfeltet er markeret.
- I Display justering vinduet Vælg kun den maskerede kanal. Opret en ny overflade for den maskerede kanal ved at følge trin 5.3-5.3.5.
Bemærk: På dette punkt kan det være nyttigt at justere udseendet af hver maske til at lette visualisering af 3D-modellen: Vælg hver overflade og Vælg farve tab. Juster grundfarven og gennemsigtighed efter behov. Overflade farver ikke flette når overlappede. - At få den volumetriske data, med hver overflade valgte Vælg fanen statistik. I den " detaljeret " under fanen, skal du vælge " gennemsnitlige værdier " fra drop-down menuen. Den samlede mængde af overfladen kan findes i kolonnen summen af de genererede tabel.
Bemærk: Hvis den genererede overflade indeholder fejlagtige fragmenter (dvs. fragmenter, der ikke er fra baggrunden signal udelukket under segmentering eller områder diskontinuert fra de vigtigste overflade), det kan være nødvendigt at beregne den samlede mængde manuelt, eller Filtrer overflader af mængden eller antallet af voxels og sikre, at kun signal segmenter er medtaget i beregningen. Lydstyrken for hver del af overfladen kan findes ved at vælge " alle værdier " fra drop-down menuen. Valg af hver værdi vil gøre det tilsvarende område vises gul, som aids i fastlæggelse af værdier at udelukke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten af de endelige data og analyse afhænger i høj grad på (1) integritet og morfologi af dissekerede embryoner, (2) anvendelsen af høj specificitet antistoffer og (3) korrekt opsætning af imaging parametre. Beskadigede embryoner vil forvirre overflade generation proces og hindre kvantitativ analyse. Eksempler på korrekt dissekeret og iscenesat embryoner er vist i figur 2B. Embryoner kan yderligere dissekeret ved at fjerne blommesækken, som antistoffer ofte binder ikke-specifikt. Men fjernelse af blommesækken vil gøre embryonerne mindre robust, så bør sikres under downstream håndtering.
Kombinationen af høj kvalitet antistoffer og korrekte indstillinger er afgørende for at opnå høj signal-støj-forholdet billeder. Figur 2A viser et eksempel billede ved hjælp af antistoffer mod Nkx2-5 som reference markør til etiketten hjerte halvmåne, og normal god landbrugspraksis at mærke en slægt spores befolkning af interesse (Foxa2Cre:YFP ventrikulær hjerte-kar-stamceller) (jf. supplerende data for rå billede og data filer). 19 denne strategi giver mulighed for sammenligning af en given befolkning med hele hjerte Halvmåne regionen. For nogle eksperimenter, kan det være af interesse at undersøge hjertets crescent FHF og SHF underdomæner. I dette tilfælde FHF og SHF kan mærkes med Hcn4 og Islet1, henholdsvis (Se reference19 for billeder og kvantitativ analyse med disse kombinationer af antistof). Med passende opsætning og sekundær antistof kombinationer, har vi med succes afbildet og analyseres tre lineages samtidigt (dvs. den kardiale halvmåne, YFP, og første eller anden HF).
Manglende evne til at opnå stærkt signal vil også begrænse evnen til at generere høj genkendelsessikkerhed 3D modeller, som det vil blive vanskeligt at fjerne baggrunden signal fra de endelige overflader. I disse tilfælde, der bør udvises forsigtighed ved justere gamma for billedet (under forbehandling, figur 2B, 2 C, 2N, 2O) eller overflade tærskel (under overfladen generation algoritme, figur 2 g, 2 H, 2 L ) og lignende indstillinger skal bruges til alle billeder i et eksperiment. Udeblivelse vil resultere i inkonsekvent volumetriske data, der ville være upassende at anvende for direkte sammenligning. Ofte, kan fejlagtige overflader som følge af baggrunden signal fjernes gennem størrelse filtrering (figur 2I, 2J), selv om derved fra høj-baggrund billeder vil blive svært uden at miste sande overflade fragmenter samt.
Figur 1: eksperimenterende tidslinje og skemaer. (A) hele eksperiment, fra parring til dataanalyse, kan udføres i omkring to uger. Embryoner indsamles i morgen på 8th dag post samleje (E8.25) for kardiale Halvmåne fase analyse (B). Når fast, er embryoner blokeret og farves med primære og sekundære antistoffer før montering. Embryoner er monteret med standard mikroskopi dias og coverslips, bruge dobbeltklæbende tape som en spacer (C). Embryoner er placeret i en dråbe af anti-fade i den viste retning (C, øverste) og en coverslip er langsomt sænkede på båndet (C, lavere). Konfokal billedbehandling og image analyse udføres for at generere z-stak billeder i høj opløsning (D) og 3D overflade modeller (E). HF, hoved fold; CC, cardiac Halvmåne; A, forreste; Pedersen, posterior; AF, anti-fade. Skala barer er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: trinvis Konfokal billedbehandling og 3D surface generation. (A) Konfokal z-serie indlæst i visningen volumen. Reference-kanal (Nkx2-5) er markerede (B) og intensitet og gamma justeret (C) før du starter algoritmen, der opretter overflader. Efter det pågældende område, er valgte (D), og den overflade detaljeringsgrad er valgt (E). Den oprindelige overflade (F) er thresholded til at omfatte alle sande signal i overfladen (G). Filtrering udføres derefter for at fjerne små baggrund fragmenter (H) at give en endelig reference overflade, (jeg). Ved at vælge reference overflade (J), sammenligning kanal (YFP) kan kopieres og maskeret (K). Intensitet og gamma for denne kanal er derefter justeres (L) før du genererer en anden overflade gennem den samme sekvens af trin (M, N). Den samlede mængde for hver overflade beregnes automatisk og kan sammenlignes med både kvantitativt og visuelt (O, Bemærk, at overfladen farver ikke flette når overlappede). Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen ovenfor beskriver en strategi for at opnå kvantitative data fra hele mount immunofluorescens billeder i høj kvalitet efter implantation mus embryoner. Når udført korrekt, kan den 3D-volumetriske data genereres gennem disse trin bruges til sammenlignende og stilling analyse af flere domæner inden for embryoet. Overflade signalet maskering fremgangsmåden er særlig nyttig når undersøger roman cellepopulationer sammenlignet med veletablerede reference strukturer.
Vi mener, at denne fremgangsmåde giver en tydelig fordel i forhold til eksisterende metoder. Hele mount immunfluorescens med wide-felt imaging kan tilbyde væv-niveau oplysninger men mangler cellulære opløsning. Omvendt kan immunfluorescens af serielle sektioner give detaljerede cellulære niveau beslutning, selvom disse data mangler den tre-dimensionelle fordel af hele mount imaging. Mens tredimensionale Konfokal imaging løser disse mangler, få brugere drage fordel af den kvantitative potentiale i disse data, og vi håber, at vores protokol giver mulighed for flere forskere til at drage fuld fordel af de data, de indsamler.
Her, har denne tilgang været eksemplificeret ved hjælp af mærket Nkx2-5 til at afgrænse den kardiale Halvmåne og undersøge tilstedeværelsen af Foxa2Cre:YFP afstamning-spores celler inden for dette domæne. Men på grund af evnen til at mindst tre slægter samtidigt og høj opløsning tre-dimensionsdata genereret billedet, denne protokol vil sandsynligvis være nyttigt at forskere inden for mange områder. Vi foreslår, at denne fremgangsmåde kan anvendes til flere vorden, organsystemer og lineages gennem mindre justeringer i protokollen, baseret på de specifikke behov i systemet. Denne protokol er vores erfaring, gælder direkte for en vifte af embryonale aldre (E6.5-E9.5 på minimum) med begrænsede tilpasninger. 19 vi ikke stødt på problemer med permeabilitet eller antistof penetration i embryoner så stor som E9.5 med inkuberingstider opført, selvom vi forvente, at disse med tykkere eller tættere væv må blive forlænget for at opnå fuld penetration.
Analysen beskrives her blev udført ved hjælp af en proprietær softwarepakke, men kan tilpasses udføres i alternative proprietære pakker optimeret til big-datahåndtering. Alternativt kan lignende rørledninger nemt gennemføres ved hjælp af computational sprog eller open source software-pakker, som vil føre til en hurtig udvikling af en database, shareable protokoller. Vækst af et globalt netværk af forskere, med adgang til frit tilgængelige værktøjer og protokoller for image erhvervelse og analyse, vil hurtigt forhånd feltet og øge reproducerbarhed af undersøgelser. 17
Vores erfaring, den store begrænsning til denne fremgangsmåde var relateret til billedbehandling dybde, især for senere vorden, og vil afhænge stærkt detaljerne i opsætningen mikroskopi anvendes. Ligeledes, hvordan prøver er monteret til billeddannelse vil afhænge af de specifikke behov af brugeren. Vi har fundet at placere det pågældende område, tættest på linsen forbedrer imaging dybde og falder baggrund signal, og vi foreslår at bruge lagdelt dobbeltklæbende tape for montage, da det gør det muligt for brugere at oprette en afdeling, der passer til deres specifikke behov. Brug af en glycerol-baserede montering medier med en anti-fade reagens, og equilibrating prøver i dette medie før montering, kan varmt anbefales at undertrykke photobleaching. Endelig, de prøver, der indgår i denne analyse er næsten gennemsigtig. brugere kan være nødvendigt at indarbejde clearing skridt til mere avancerede vorden, væv fragmenter eller organoids, og bestemme den bedste clearing protokol for en given ansøgning vil kræve empiriske test.
Ved hjertets morfogenese, kan forskellige Billeddannende metoder anvendes. Mens Konfokal mikroskopi anvendes her, er lys-ark mikroskopi yderst velegnet til disse undersøgelser på grund af hastigheden, opløsning og signal / støj forholdet mellem den erhvervede billede. 20 vi forventer øget tilgængeligheden af denne nye teknologi til yderligere fremme nytten og rigdom af lignende Billeddannende metoder. Ligeledes, den kontinuerlige avancement fluorescerende reportere,21 lysopfangende, farvestoffer,22 og live-embryo kultur23,24 vil føre til disse undersøgelser, der flytter til fire dimensioner, tilføjer element af tid, og giver endnu flere oplysninger om, hvordan embryonale strukturer form under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH/NHLBI R56 HL128646 og Mindich børns sundhed og udvikling Institute (MCHDI) på ISMMS (at N.D.). E.B. understøttes af en NIH/NIDCR praktikantopholdet T32 HD075735. Mikroskopi og billede analyse blev udført på mikroskopi kernen på Icahn School of Medicine på Mount Sinai, som er delvist understøttet af Tisch Cancer Institute på Mount Sinai P30 CA196521 – kræft Center støtte Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
