Summary
Her beskriver vi en protokoll for hele mount immunofluorescence og bildebasert kvantitative volumetric analyse av tidlig stadium mouse embryoer. Vi presenterer denne teknikken som en kraftig tilnærming til kvalitativt og kvantitativt vurdere cardiac strukturer under utvikling, og foreslår at det kan være mye tilpasses andre organsystemer.
Abstract
Bruk av stadig-fremrykkende Bildeteknikker har bidratt stort til vår økt forståelse av embryonale utvikling. Før implantasjon utvikling og organogenesen er to områder av forskning som har benefitted sterkt fra disse framskrittene, på grunn av høy kvalitet som kan fås direkte fra imaging før implantasjon embryo eller ex vivo organer. Mens før implantasjon embryoer har gitt data med spesielt høy romlig oppløsning, vært senere stadier mindre mottakelig for tredimensjonale gjenoppbygging. Få høykvalitets 3D eller volumetriske data for kjente embryonale strukturer i kombinasjon med skjebnen kartlegging eller genetisk avstamning sporing vil tillate en mer omfattende analyse av Morfogenetiske hendelser som skjer under embryogenesis.
Denne protokollen beskriver en hele-mount immunofluorescence tilnærming som gjør at for merking, visualisering og kvantifisering av stamfar celle populasjoner i utvikle hjerte crescent, en nøkkel struktur dannet under heart utvikling. Tilnærmingen er utformet på en slik måte at begge celle - og vev-nivå informasjon kan fås. Bruke AC confocal mikroskopi og bildebehandling, gir denne protokollen tredimensjonale romlige rekonstruksjon av cardiac crescent, noe som gir muligheten til å analysere lokalisering og organisering av bestemte stamfar populasjoner under denne kritiske fasen av hjertet utvikling. Viktigere, gir bruk av referanse antistoffer påfølgende maskering av cardiac crescent og påfølgende kvantitativ måling av områder crescent. Denne protokollen vil ikke bare aktivere en detaljert undersøkelse av tidlig heart utvikling, men med tilpasninger skal gjelder for de fleste organsystemer i gastrula til tidlig somite scenen mus fosteret.
Introduction
Studiet av organogenesen har lenge basert på observasjon av Morfogenetiske hendelser i utviklingsland fosteret. Disse studiene er ofte avhengige av bruk av fluorescerende fargestoffer eller avstamning sporing journalister i kombinasjon med merking av definerte referanse bestander. 1 ved å sammenligne relative plasseringene til disse etikettene, informasjon kan være samlet på opprinnelse, bevegelse eller ultimate bidrag fra en populasjon av interesse. Transplantasjon og skjebne kartlegging eksperimenter bruke morfologiske landemerker eller injeksjon av fargestoffer i ikke-motile overleveringslinjer definere startpunktet for cellene av interesse, som deretter undersøkt for bidrag til utviklet fosteret. 2 , 3 , 4 , 5 genetiske avstamning-sporing eksperimenter bruke samme konsept med godt definerte reporter alleler som brukes til etiketten celle populasjoner uten eksperimentelle manipulasjon. Nøkkelen til disse metodene er muligheten til å bestemme, med høy romlig oppløsning, plasseringen av den eksperimentelle og referanse etiketter. Disse metodene har gitt enestående fremgang før implantasjon utvikling og explant organogenesen studier. 6 , 7 , 8 , 9
Utviklingsmessige hendelsene underlie hjertet morphogenesis har blitt stadig beskrevet de siste årene. 10 er en av de store funnene i dette området av forskning beskrivelsen av en rekke stamfar populasjoner som kan være preget av uttrykk for unike markører. 11 populasjonene er den første og andre hjerte-feltene (FHF og SHF), som finnes i cardiac crescent på fremre siden av embryoet på embryonale dag (E) 8,25 musen utvikling. 12 populasjonene er ofte undersøkt gjennom en kombinasjon av bred-feltet mikroskopi, som gir informasjon om vev nivåer og seriell snitting med immunofluorescence analyser, som tilbyr mobil høyoppløselig men bare todimensjonal romlig informasjon. 13 derfor, mens disse studiene har sterkt avansert vår forståelse av hjertet utvikling, de tilgjengelige metodene har begrenset grundig kvantitativ analyse av morphogenesis under disse stadiene, opprette behovet for tilnærminger til å undersøke den organisering av populasjonene på hele organismen nivå.
Den nylige fremskritt innen både AC confocal mikroskopi og 3D image analyse tillate høy oppløsning og høy gjennomstrømming algoritmisk rekonstruksjoner av celler og strukturer i situ med relativ letthet, dermed banet vei for detaljerte studier av kompleks Cellular strukturer. 14 og økt regnekraft utviklingen av stor-data administrerende algoritmer, både nødvendig å håndtere den eksplosive økningen av imaging datasett, analyser kan nå fullt automatisert. 15 automatisert analyse av tenkelig datasett har fordelen av å være objektiv, men det er bare så pålitelig som kvaliteten på input datasettet; Det er viktig, da, at beste praksis brukes under oppkjøp og bildebehandling pre for å sikre den høyeste kvalitet, saklig analyse. 16 protokoller kan være fullstendig automatisert og delte for reproduserbarhet, og algoritmer som er brukt av proprietær programvare er lett tilgjengelig via biblioteker som skal brukes av forskere som har kjennskap til moderne proprietær eller åpen kildekode utviklerverktøy. 17
Følgende protokollen forklarer fremgangsmåten for å utføre slike analyser på en veldefinert modell av organogenesen, dannelsen av cardiac crescent under utviklingen av hjertet. Spesielt denne protokollen beskriver hvordan å (1) høste og dissekere cardiac halvmåne scenen embryo, (2) utfører hele mount immunofluorescence for henvisning (Nkx2-5) og eksperimentelle (Foxa2Cre:YFP18,19) markører, (3) forberede og image embryo bruker AC confocal mikroskopi, og til slutt (4) analysere og kvantifisere bildene ved hjelp av avanserte tredimensjonale tilnærminger. Mens cardiac crescent brukes som et eksempel her, med passende endring, kan denne protokollen brukes til analyse av flere linjene i gastrula til tidlig somite fase embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Icahn School of Medicine i Sinai.
1. høsting og behandling Cardiac Crescent stadium embryoer
- Mate en fruktbar kvinnelige mus med en fruktbar stud mannlig.
- Sjekk for tilstedeværelsen av en vaginal copulation plugg en stump sonde eller tang. Middag på dagen av plugg regnes embryonale dag (E) 0,5 (se figur 1A for full tidslinjen).
Merk: Plugger bør sjekkes for i morgen, som de er tapt på dagtid. - Om morgenen til 8 th dag (E8.25), ofre gravid demningen ved CO 2 innånding, eller i henhold til lokale og institusjonelle.
Merk: Eksakt tidspunkt kan stamme avhengige og bør fastsettes empirisk av morfologi. - Spray magen av mus med 70% etanol å rense området og redusere shedding. Utsette viscera ved å utføre en underlivs snitt gjennom både huden og kroppen veggen.
- Finn livmoren og fjerne forsiktig hele livmor Hornet fra dyret. Start ved å kutte over en oviduct, trimme fettet fra livmoren mens du går videre til cervical slutten. Skjære gjennom livmorhalsen og fortsette til den øvre enden av andre oviduct, kutte for å frigjøre hele livmoren.
- Plass i livmoren i en 10 cm parabolen med fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7.4) å vaske bort overflødig blod. Sub dissekere livmoren ved å kutte mesometrium mellom hver deciduum, som inneholder embryoene. Overføre embryoene til en 6 cm parabolen med fersk PBS.
- Under disseksjon mikroskop, bruke fine tang (#5) til å fjerne livmor vev fra decidual vevet.
- Bruke tang, skjær nøye spissen av embryonale halvparten av deciduum å avsløre fosteret. Knip deciduum å presse embryoet ut og trekk forsiktig embryoet.
- Dissekere bort extraembryonic vev så mye som mulig uten å skade morfologi av embryoet ( figur 1B).
- Bruker en overføring pipette å plassere embryoene i en 1,5 mL tube med fersk PBS og plassere på is. Gjenta 1.7-1.9 for de gjenværende embryoene strikkes.
- Leveringstanken PBS og skyll gang med PBS. Sug opp PBS.
Merk: Prøv å fjerne så mye PBS som mulig uten å skade eller tørke av embryo. Manuell fjerning av løsninger anbefales alle skritt å unngå tap av embryo. - Fastsette embryo med 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS 1t på RT.
Merk: Embryo kan fikses over natten (O/N) på 4 ° C. - Skyll tre ganger med PBS. Holde embryoer på 4 ° C helt klar til å fortsette med immunofluorescence.
Merk: Pause poeng. Embryo kan trygt oppbevares i PBS på 4 ° C i flere uker.
2. Immunofluorescence Beising
Merk: inkubasjon betingelsene nedenfor kan justeres for å imøtekomme ulike tidsplaner. Forsiktig risting eller rock for alle lang incubation trinn anbefales.
- Fjern PBS og tilsett 1 mL av blokkering buffer (0,5% saponin, 1% bovin serum albumin (BSA) i PBS).
- Ruge minst 4 h på RT. Dette kan også gjøres O/N på 4 ° C.
- Fjerner blokkerende bufferen og legge primære antistoff blanding fortynnet i blokkering buffer. Inkuber O/N på 4 ° C.
Merk: Se delen beskrivelse av antistoffer brukes og foreslo fortynninger. Antistoff fortynninger bør fastsettes empirisk. Bruk av Nkx2-5 som en referanse flekk for cardiac crescent anbefales, og er nøkkelen til nedstrøms bilde segmentering og analyse. - Fjerne primære antistoffer av aspirasjon.
- Vask 3 ganger for 1 h hver med 0,1% Triton i PBS.
- Fjern vask og Legg sekundære antistoff blanding utvannet blokkerer buffer. Inkuber for 3t på RT. Dette kan også gjøres O/N på 4 ° C.
- Vask 3 ganger for 1 h hver med 0,1% Triton i PBS. Dette kan også gjøres O/N på 4 ° C.
- Counterstain med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i PBS for 10 min.
Merk: Denne counterstain utføres samtidig med sekundær antistoff. - Vask 2 ganger i 5 min hver med 0,1% Triton i PBS.
- Sakte avbryte embryo anti-fade monterer medier (2% w/v-n-Propyl gallate (nPG), 90% glyserol, 1 x PBS; Se materialer delen mer informasjon). La equilibrate minst 1 time før montering. Forsiktig sveip rør med jevne mellomrom for å hjelpe embryo slippe anti-fade løsning.
Merk: Pause poeng. Embryo kan lagres i flere dager i anti-fade løsning helt klar til å montere og bildet.
3. Montering embryo for mikroskopi
- forberede mikroskop lysbilder for montering dobbel-pinne tape eller silikon avstandsstykker. Hvis bruker dobbel-pinne tape, gjør to parallelle stabler av 5-6 lag ca 15-20 mm fra hverandre. Dette vil la nok plass til å plassere embryoene og sikre dekkglassvæske ( figur 1 c).
- Plasser en 15 µL dråpe anti-fade på lysbildet mellom dobbel-pinne tape. Nøye overføre en embryoet til lysbildet.
Merk: flere fosteret kan plasseres på et lysbilde. Imidlertid de påfølgende orientering er vanskeligere med flere embryo, og lenge imaging varighet kan føre til Foto-bleking. - Under disseksjon mikroskop med fine tang, plassere embryoet slik at den fremre siden vender bort fra lysbildet med kroppen aksen i tråd med den lange aksen av lysbildet. Se figur 1 c for en skjematisk for montering.
- Forsiktig plassere en dekkglassvæske over prøven ved hvile en side på en bunke med dobbel-pinne tape og bruke tang forsiktig redusere dekkglassvæske til det berører andre båndet.
Merk: Trinn 3.3 og 3.4 er avgjørende for å sikre riktig retning av embryoet for bildebehandling. Ved å redusere dekkglassvæske langs bakre fremre retning, fosteret burde ikke gynge og kardiale halvmåne regionen vil bli orientert fra lysbildet som er ideelt for bildebehandling på en invertert mikroskopet. - Bruker en pipette til flere anti-fade mellom lysbilder og dekkglassvæske å holde eksempel dø ut under lagring tenkelig.
4. AC confocal Imaging
- Hent bilder ved hjelp av høyeste forstørrelse målet som gir hele hjerte halvmåne regionen for å bli fanget i en synsfelt. Hjelp Nyquist samplingsfrekvenser angi x-y-z voxel dimensjoner. De fleste mikroskop produsenter vil ha en " optimalisere " for å sikre Nyquist prøvetaking.
Merk: Flekker Nkx2-5 er gunstig her, som det vil avgrense hele hjerte halvmåne regionen. Mindre Z-trinn størrelser (oversampling) vil gi bedre 3D modellering resultater, men kan føre til utvidet oppkjøpet ganger og/eller bleking for eksempler. - Angi imaging parametere med standard best tenkelig praksis. Nemlig bruke lavest mulig intensiteten å oppnå godt signal-til-støy-forhold for hver fluorophore og velge gevinst og kompensere nivåer som gir et bredt dynamisk område uten mette signalet.
Merk: Være konsekvent med imaging parametere mellom eksempler som skal sammenlignes direkte. Dette er spesielt viktig for nedstrøms 3D Analyser og kvantifisering.
5. Analyse og kvantitativ 3D modellering
Merk: For denne protokollen, ble bilder analysert ved hjelp av Imaris programvarepakken. Tilsvarende analyse kan være mulig å bruke alternative pakker. Beskrivelsen nedenfor dekker rørledningen analyse for en referanse kanal (dvs. Nkx2-5) og en eksperimentell kanal (dvs. YFP). Flere kanaler kan analyseres via repetisjon av disse trinnene. Et eksempel datasett har blitt gitt som kan brukes til å replikere analysen under.
- Last råbildebehandling datasett i Imaris Arena visning og åpne filen for ønsket embryoet i Overgå visning. Data skal lastes inn i 3D-visning i MIP (maks) modus. Åpne vinduet vise justering, og velg bare referanse kanalen.
- Juster terskelen til bildet hvis nødvendig for bedre visualisering. For denne analysen, justere gamma hvis signal-til-støy forholdet er for lav for segmentering.
Merk: Hvis utfører gamma rettelser, som er ikke-lineær justeringer, justert bildene kan ikke brukes for intensitet mål eller sammenligninger. På dette stadiet kan du utføre ytterligere pre bildebehandling (i.e. belysning rettelser, Gaussuklarhet eller andre filtrering), hvis din signal-til-støy-forhold ikke er tilfredsstillende. Hvis du velger å gjøre pre-prosessering, må du utføre de samme forhåndsbehandling trinnene for alle bilder i din dataset. - Opprette en ny overflate for referanse kanalen benytter overflate algoritmen dialogen.
- Velg den " Segment bare et område av interesse " sjekkheftet.
- Justere markeringsrammen for regionen slik at den inneholder regionen rundt (ROI, dvs den halvmåne hjerteområde) av referanse flekken.
- Velg referanse kanalen fra nedtrekksmenyen kilde kanal. Standardinnstillingen for mykere (lik z voxel størrelsen) er vanligvis tilstrekkelig, men kan kreve empirisk optimalisering. For denne analysen, bruke utjevning halv z voxel-størrelsen.
- Utføre terskelverdi av absolutt intensitet. For å sikre at overflaten ikke utover kanalen signalet, justere den nedre grensen bruker skyvekontrollene.
Merk: For visse bilder der cellene kan angis lett, kan du inkludere den " delt berøre objekter " algoritmen, ytterligere skille signalet fra bakgrunnen. - Filter med voxel nummer eller volum og Avvis bakgrunn (liten eller i områder utenfor området Nkx2-5) objekter algoritmen kan generert. Fullføre algoritmen.
- Bruker nyopprettede overflaten, opprette en maskert kanal for eksperimentell kanalen.
- Surface(s) valgt, Velg den " maske Sel... ͟ " funksjonen fra redigeringsvinduet.
- Velg en eksperimentell kanal rundt (dvs. YFP). Kontroller at den " Dupliser kanal før maske " merket.
- i the Display justering vinduet Velg bare maskert kanalen. Opprette en ny overflate for maskerte kanal ved å følge trinn 5.3-5.3.5.
Merk: På dette punktet kan det være nyttig å justere utseendet på hver maske å lette visualisering av 3D-modellen: Velg hver overflate og Velg farger-kategorien Juster basisfargen og gjennomsiktigheten etter behov. Overflaten farger ikke flette når overlappes. - å få volumetriske dataene, med hver overflate valgt Velg kategorien statistikk. I den " detaljert " igjen, Velg " gjennomsnittsverdier " fra det miste-ned menyen. Det totale volumet av overflaten kan finnes i Sum-kolonnen i tabellen genererte.
Merk: Hvis genererte overflaten inneholder feilaktige fragmenter (i.e. fragmenter som fra bakgrunn signal ikke utelates under segmentering eller områder usammenhengende fra viktigste overflaten), kan det være nødvendig for å beregne det totale volumet manuelt, eller filtrere overflater av volum eller antall voxels og sikre at bare signal segmenter er inkludert i beregningen. Volumet for hver del av overflaten kan finnes ved å velge " alle verdier " fra det miste-ned menyen. Velge hver verdi vil gjøre tilsvarende regionen vises gule, som hjelpemidler i å bestemme verdier å utelate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på den endelige dataene og analyse avhenger sterkt på (1) integritet og morfologi av dissekert embryo, (2) bruk av høy spesifisitet antistoffer og (3) riktig oppsett Imaging parametere. Skadet embryo vil forvirre den overflaten prosessen og hindre kvantitativ analyse. Eksempler på riktig dissekert og iscenesatt embryo vises i figur 2B. Embryoene kan bli ytterligere dissekert ved å fjerne plommesekken, som antistoffer ofte vil binde nonspecifically. Imidlertid gjør fjerning av plommesekken embryoene mindre robust, så forsiktighet bør utvises under nedstrøms håndtering.
Kombinasjonen av høy kvalitet antistoffer og riktige innstillinger for imaging er avgjørende for å oppnå høy signal-til-støy forholdet bilder. Figur 2A viser et eksempel bilde med antistoffer mot Nkx2-5 som et merke etiketten cardiac halvmåne, og GFP etiketten en slektslinje spores befolkningen av interesse (Foxa2Cre:YFP ventrikkel hjerte stamfar celler) (se supplerende dataene for rå bilde- og datafiler). 19 denne strategien gir sammenligning av en gitt befolkning med hele hjerte halvmåne regionen. For noen eksperimenter, kan det være av interesse å undersøke FHF og SHF underdomenene av cardiac crescent. I dette tilfellet FHF og SHF kan merkes med Hcn4 og Islet1, henholdsvis (se referanse19 for bilder og kvantitativ analyse med disse antistoff kombinasjoner). Med riktig oppsett og sekundære antistoff kombinasjoner, har vi fotografert og analysert tre linjene samtidig (dvs. cardiac crescent, YFP, og første eller andre HF).
Manglende evne til å sterkt signal også begrenser muligheten til å generere høy visshet 3D-modeller, så det blir vanskelig å fjerne bakgrunn signal fra siste overflater. I disse tilfellene må utvises forsiktighet når du justerer bildets gamma (under pre-prosessering, figur 2B, 2 C, 2N, 2O) eller overflate terskelverdi (under overflaten generasjon algoritmen, figur 2 g, 2 H, 2 L ) og lignende innstillinger bør brukes for alle bilder i et eksperiment. Gjør det vil føre til inkonsekvent volumetriske data som ville være upassende å bruke for direkte sammenligning. Ofte kan feilaktig overflater fra bakgrunn signal fjernes gjennom størrelse filtrering (figur 2I, 2J), men gjøre det fra høy-bakgrunn bilder blir vanskelig uten å miste ekte overflaten fragmenter også.
Figur 1: eksperimentell tidslinjen og skjematisk. (A) hele eksperimentet, fra parring data analyse, kan utføres i ca to uker. Embryo er samlet i morgen på 8th dag innlegget copulation (E8.25) for cardiac halvmåne scenen analyse (B). En gang bestemt, er embryoer blokkert og farget med primære og sekundære antistoffer før montering. Embryo montert med standard mikroskopi lysbilder og coverslips, bruke dobbeltsidig tape som et avstandsstykke (C). Embryo plasseres i en dråpe anti-inntoning vises retningen (C, øvre) og en dekkglassvæske senkes sakte på båndet (C, lavere). AC confocal imaging og bildeanalyse utføres for å generere bilder med høy oppløsning z stabel (D) og 3D-overflate modeller (E). HF, hodet hjord. CC, hjerte halvmåne; A, anterior; P, bakre; AF, anti-fade. Skala barer er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: gradvis AC confocal bildebehandling og 3D overflaten generasjon. (A) AC Confocal z-serien i visningen volum. Referanse kanalen (Nkx2-5) er valgt (B) og intensitet og gamma justert (C) før du starter opprette overflater algoritmen. Etter regionen rundt er valgt (D) og overflate detaljnivået er valgt (E). Første overflaten (F) er thresholded med alle sanne signal i overflaten (G). Filtreringen utføres deretter for å fjerne små bakgrunn fragmenter (H) å gi en siste henvisning overflate (jeg). Velger referanse overflaten (J), sammenligning kanalen (YFP) kan dupliseres og maskert (K). Intensiteten og gamma for denne kanalen er så justert (L) før du genererer en andre overflaten gjennom den samme sekvensen av trinn (M, N). Totalvolumet for hver overflaten beregnes automatisk, og kan sammenlignes med både kvantitativt og visuelt (O, Merk at overflaten farger ikke flette når overlappende). Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen ovenfor beskriver en strategi for å få kvantitative data fra høy kvalitet hele mount immunofluorescence bilder av etter implantasjon mouse embryoer. Når utført korrekt, kan 3D volumetriske dataene som genereres gjennom disse trinnene brukes for sammenlignende og interseksjonell analyse av flere domener i fosteret. Overflaten signalet maskering tilnærming er beskrevet er spesielt nyttig når undersøke romanen celle populasjoner med veletablerte referanse strukturer.
Vi tror at denne tilnærmingen tilbyr en klar fordel over eksisterende tilnærminger. Hele mount immunofluorescence med bred-feltet imaging kan tilby vev-nivå informasjon, men mangler cellular oppløsning. Derimot kan immunofluorescence føljetong deler gi detaljert mobilnettet nivå oppløsning, om disse dataene mangler tredimensjonale fordelen av hele mount bildebehandling. Mens tredimensjonale AC confocal imaging løser disse svakhetene, få brukere dra nytte av kvantitative potensialet til disse dataene, og vi håper at tillater våre protokollen flere forskere til å utnytte dataene de samler inn.
Her har denne tilnærmingen blitt eksemplifisert ved å bruke markøren Nkx2-5 å avgrense cardiac crescent og undersøke tilstedeværelsen av Foxa2Cre:YFP slektslinje spores celler i domenet. Men på grunn av evne til minst tre linjene samtidig og høy oppløsning tre-dimensjonal dataene som genereres, vil denne protokollen trolig være nyttig for forskerne på mange felt. Vi foreslår at denne tilnærmingen kan brukes til flere embryonale stadier, organsystemer og linjene gjennom mindre justeringer til protokollen basert på behovene til systemet. I vår erfaring gjelder denne protokollen direkte for embryonale aldre (E6.5-E9.5 minst) med begrenset tilpasninger. 19 vi har ikke oppdaget problemer med permeabilitet eller antistoff gjennomtrengning i embryoer så stor som E9.5 med inkubering tiden vises, men vi forventer at med tykkere eller tettere vev dette måtte bli forlenget for å oppnå full penetrasjon.
Analysen beskrevet her det ble utført en proprietær programvarepakke, men kan tilpasses utføres i alternative proprietære pakker optimalisert for store-håndtering. Alternativt kan lignende rørledninger enkelt implementeres beregningsorientert språk eller åpen kildekode programvarepakker, som vil føre til den raske utviklingen av en deles protokoller database. Veksten av et globalt nettverk av forskere, med tilgang til fritt tilgjengelige verktøy og protokoller for bildeopptak og analyse, vil raskt fremme innen og øke reproduserbarhet studier. 17
I vår erfaring, store begrensningen til denne tilnærmingen var relatert til bildebehandling dybde, spesielt for senere embryonale stadier, og vil avhenge sterkt av spesifikk av mikroskopi oppsettet brukes. På samme måte avhengig hvordan prøver er montert for bildebehandling av behovene til brukeren. Vi har funnet at å plassere regionen rundt nærmest linsen forbedrer tenkelig dybde og reduserer bakgrunn signal, og vi foreslår at du bruker lagdelte dobbeltsidig tape for montering, som gjør at brukerne oppretter et kammer som passer deres behov. Bruk av en glyserol-baserte montering medier med en Antifade reagens og equilibrating prøver i denne media før montering, anbefales å undertrykke photobleaching. Endelig, prøver som brukes i denne analysen er nesten transparent. brukerne trenger å innlemme clearing trinnene for mer avanserte embryonale stadier, vev fragmenter eller organoids, og avgjøre best fjerne protokollen for et gitt program vil kreve empirisk testing.
I tilfelle av cardiac morphogenesis, kan ulike tenkelig metoder brukes. Mens AC confocal mikroskopi brukes her, er lys arks mikroskopi svært godt egnet for disse studiene på grunn av hastigheten, oppløsning og signal-til-støy-forhold av ervervet bildet. 20 vi forventer økt tilgjengelighet av denne nye teknologien å fremme ytterligere verktøyet og rikdom av lignende tenkelig. Tilsvarende kontinuerlig fremme fluorescerende journalister,21 chromophores, fargestoffer,22 og live-fosteret kultur23,24 vil føre til disse studiene flyttet til fire dimensjoner, legger elementet tid, og gir enda mer informasjon om hvordan embryonale strukturer skjemaet under utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH/NHLBI R56 HL128646 og Mindich barnehelse og utvikling Institute (MCHDI) på ISMMS (til nd). EB er støttet av en NIH/NIDCR lærlingeplass T32 HD075735. Mikroskopi og bildet ble utført mikroskopi kjernen ved Icahn School of Medicine i Sinai, som støttes delvis av Tisch Cancer Institute på Mount Sinai P30 CA196521-Cancer Center støtte Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
