Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für ganze Berg Immunfluoreszenz und Image-basierten quantitativen volumetrische Analyse der frühen Stadium Mausembryonen. Wir präsentieren diese Technik als ein leistungsfähiger Ansatz qualitativ und quantitativ kardialen Strukturen während der Entwicklung zu bewerten, und schlagen vor, dass es möglicherweise sehr anpassungsfähig an andere Organsysteme.
Abstract
Der Einsatz von bildgebenden Verfahren ständig fortschreitende hat im großen und ganzen zu unserem erhöhten Verständnis der embryonalen Entwicklung beigetragen. Vor der Implantation Entwicklung und Organogenese sind zwei Bereiche der Forschung, die stark von diesen Fortschritten, aufgrund der hohen Qualität der Daten profitiert haben, die direkt von imaging Embryonen vor der Implantation oder ex Vivo Organe gewonnen werden können. Vor der Implantation Embryonen Daten mit besonders hoher räumlicher Auflösung ergeben haben, aber spätere Phasen dreidimensionale Rekonstruktion weniger zugänglich waren. Gewinnung von qualitativ hochwertige 3D oder volumetrische Daten für bekannten embryonale Strukturen in Kombination mit Schicksal Mapping oder genetischen Abstammung Ablaufverfolgung ermöglicht eine umfassendere Analyse der morphogenetischen Veranstaltungen statt in der Embryogenese.
Dieses Protokoll beschreibt einen ganze-Mount Immunfluoreszenz-Ansatz, der zur Kennzeichnung, Visualisierung und Quantifizierung der Stammvater Zell-Populationen innerhalb der entwickelnde kardiale Halbmond, ermöglicht eine zentrale Struktur im Herzen Entwicklung gebildet. Der Ansatz ist so gestaltet eine Weise, die beide Zellen und Gewebe-Ebene Informationen abgerufen werden können. Konfokale Mikroskopie mit Bildverarbeitung, ermöglicht dieses Protokoll für dreidimensionale räumliche Rekonstruktion der kardialen Mondsichel, wodurch die Möglichkeit, die Lokalisierung und die Organisation der bestimmte Vorläuferzellen Bevölkerungen während analysieren dieser kritischen Entwicklungsphase Herz. Wichtig ist, ermöglicht die Verwendung von Referenz-Antikörper für aufeinanderfolgende Maskierung der kardialen Mondsichel und quantitative Messungen der Bereiche innerhalb des Halbmonds. Dieses Protokoll ermöglicht nicht nur eine detaillierte Untersuchung der frühen Entwicklung des Herzens, aber mit Anpassungen auf die meisten Organsysteme in der Gastrula zu frühen Somiten Bühne Mausembryos anwendbar sein sollte.
Introduction
Die Studie der Organogenese hat lange auf die Beobachtung der morphogenetischen Veranstaltungen im sich entwickelnden Embryo verlassen. Diese Studien setzen häufig auf die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen oder Abstammung Ablaufverfolgung Reporter in Kombination mit Kennzeichnung der definierten Populationen. 1 durch den Vergleich der relativer Positionen der diese Etiketten, kann Informationen über die Herkunft, die Bewegung oder die ultimative Beitrag einer Bevölkerung von Interesse zu entnehmen. Transplantation und Schicksal Zuordnung Experimente verwenden morphologischen Sehenswürdigkeiten oder Injektion von Farbstoffen in nicht-bewegliche Linien den Ausgangspunkt der Zellen von Interesse, zu definieren, die dann für Verdienste um die entwickelten Embryo untersucht werden. 2 , 3 , 4 , 5 genetische Abstammung-Ablaufverfolgung Experimente benutzen das gleiche Konzept mit klar definierten Reporter Allele, die Label-Zell-Populationen ohne experimentelle Manipulation verwendet werden. Schlüssel zu dieser Ansätze ist die Fähigkeit, mit hoher räumlicher Auflösung, die Standorte des experimentellen und Referenz-Etiketten zu bestimmen. Diese Ansätze haben herausragende Fortschritte bei der Entwicklung vor der Implantation erbracht und explant Organogenese Studien. 6 , 7 , 8 , 9
Die entwicklungspolitische Ereignisse, die Herzen Morphogenese zugrunde liegen haben in den letzten Jahren zunehmend gut beschrieben. 10 eine der großen Entdeckungen in diesem Bereich der Forschung ist die Beschreibung einer Reihe von Vorläuferzellen Populationen, die durch Ausdruck der einzigartigen Markierungen unterschieden werden können. 11 diese Populationen sind die erste und zweite Herz-Felder (FHF und SHF), die innerhalb der kardialen Halbmond an der vorderen Seite des Embryos an embryonalen Tag (E) 8,25 Maus Entwicklung vorhanden sind. 12 diese Populationen werden häufig durch eine Kombination von Weitfeld-Mikroskopie, die Gewebe-Ebene Informationen und seriellen Schnitt Immunofluoreszenz Tests bietet, untersucht, die zelluläre hochauflösende aber nur bietet zweidimensionaler räumlicher Informationen. 13 so während dieser Studien stark unser Verständnis von Herzen Entwicklung fortgeschritten haben die verfügbaren Methoden haben begrenzte in Tiefe Quantitative Analyse der Morphogenese während dieser Phasen, schaffen die Notwendigkeit für Ansätze zu prüfen, die Organisation dieser Populationen auf der Ebene des gesamten Organismus.
Die jüngsten Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie und 3D-Bildanalyse ermöglichen für hochauflösende und Hochdurchsatz-algorithmische Rekonstruktionen von Zellen und Strukturen in Situ mit relativer Leichtigkeit, so ebnet den Weg für detaillierte Studien des Komplexes Zellstrukturen. 14 mit der Erhöhung der Rechenleistung und der Entwicklung von big Data Geschäftsführer Algorithmen, notwendig zu handhaben die exponentielle Zunahme der Größe der imaging-Daten-Sets, können Analysen jetzt vollständig automatisiert werden. 15 automatisierte Analyse von bildgebenden Datensätzen hat den Vorteil des Seins, unvoreingenommen, aber es ist nur so zuverlässig wie die Qualität des Eingabedatasets; Es ist zwingend notwendig, dann, dass Best Practices beim Erwerb und Bildvorverarbeitung verwendet werden, um die höchste Qualität, unvoreingenommene Analyse zu gewährleisten. 16 können Protokolle vollständig automatisiert und für Reproduzierbarkeit freigegeben, und die von proprietärer Software verwendeten Algorithmen sind leicht über Bibliotheken von Wissenschaftlern verwendet werden, die Vertrautheit mit modernen proprietär oder Open-source Entwickler-Tools. 17
Das folgende Protokoll erklärt die notwendigen Schritte, um eine solche Analyse auf ein definiertes Modell der Organogenese, die Bildung der kardialen Mondsichel bei Herz-Entwicklung durchführen. Insbesondere dieses Protokoll beschreibt, wie Sie (1) ernten und kardiale Halbmond Embryonen zu sezieren, (2) führen Sie ganze Berg Immunfluoreszenz als Referenz (Nkx2-5) und experimentellen (Foxa2Cre:YFP18,19) Marker, (3) vorbereiten und die Embryonen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, image und schließlich (4) zu analysieren und zu quantifizieren die dabei entstandenen Bilder mit erweiterten dreidimensionale Ansätze. Während der kardialen Halbmond als Beispiel hier, bei entsprechender Modifikation verwendet wird kann dieses Protokoll für die Analyse von mehreren Linien in Gastrula zu frühen Somiten Embryonen verwendet werden.
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Protocol
alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an Icahn School of Medicine am Mount Sinai genehmigt.
1. Ernte und Verarbeitung von kardialen Crescent Embryonen
- eine fruchtbare weibliche Maus mit einem fruchtbaren Stud Männchen Paaren.
- Prüfung auf das Vorhandensein von einer vaginalen Koitus Stecker mit einer stumpfen Sonde oder Zange. Mittags am Tag der Stecker Erkennung gilt als embryonale Tag (E) 0,5 (siehe Abbildung 1A für volle Timeline).
Hinweis: Stecker sollte überprüft werden am Morgen, als sie im Laufe des Tages verloren gegangen sind. - Auf dem Morgen von 8 th-Tag (E8.25), zu Opfern den schwangeren Damm durch CO 2 Inhalation oder nach lokalen und institutionellen Regelungen.
Hinweis: Exaktes Timing kann Belastung abhängig und sollte durch Morphologie empirisch ermittelt werden. - Sprühen Sie den Bauch der Maus mit 70 % Ethanol, reinigen Sie den Bereich und vergießen zu minimieren. Setzen Sie die Eingeweide durch ausführen ein Bauchschnitt über die Haut und die Körperwand.
- Die Gebärmutter suchen Sie und entfernen Sie vorsichtig die gesamte Gebärmutter Horn des Tieres. Zunächst schneiden oben eine Eileiter Fett weg von der Gebärmutter während des Verfahrens bis zum zervikalen Ende trimmen. Durch den Muttermund geschnitten und weiter zum oberen Ende des anderen Eileiters, schneiden, um die gesamte Gebärmutter freizugeben.
- Ort der Gebärmutter in ein 10 cm Schale mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) überschüssiges Blut abzuwaschen. Sub-sezieren Sie die Gebärmutter durch Schneiden der Mesometrium zwischen jedem Deciduum, enthält die Embryonen. Transfer der Embryonen zu einem 6 cm Schüssel mit frischen PBS.
- Unter dem Mikroskop Dissektion feinen Pinzette (#5) verwenden, um die uterine Gewebe vom deziduale Gewebe zu entfernen.
- Mit Zange, schneiden sorgfältig Sie die Spitze der embryonalen Hälfte des Deciduum um den Embryo zu offenbaren. Prise Deciduum herausdrücken des Embryos und den Embryo vorsichtig herausziehen.
- Sezieren Weg extraembryonic Gewebe so weit wie möglich ohne Beschädigung der Morphologie des Embryos ( Abbildung 1 b).
- Verwenden eine Transferpipette die Embryonen in einem 1,5 mL-Tube mit frischen PBS und auf Eis legen. 1.7-1.9 für die restlichen Embryonen zu wiederholen, bevor Sie fortfahren.
- Aspirat PBS und Spülen mit PBS. Aspirieren PBS.
Hinweis: Versuchen Sie, so viel PBS wie möglich zu entfernen, ohne zu beschädigen oder trocknen die Embryonen. Manuelle Entfernung von Lösungen wird empfohlen bei allen Schritten, Verlust von Embryonen zu vermeiden. - Fix-Embryonen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 1 h bei RT
Hinweis: Embryonen können behoben werden über Nacht (O/N) bei 4 ° c - Spülen dreimal mit PBS. Embryonen bei 4 ° C zu halten, bis bereit zum Fortsetzen der Immunfluoreszenz.
Hinweis: Pausenpunkt. Embryonen sicher verstauen mit PBS-Puffer bei 4 ° C für mehrere Wochen.
2. Immunfluoreszenz-Färbung
Hinweis: unten Inkubationsbedingungen können angepasst werden, um unterschiedliche Zeitpläne unterzubringen. Sanftes Schütteln oder Schaukeln für alle Schritte der langen Inkubationszeit wird empfohlen.
- PBS zu entfernen und fügen Sie 1 mL der blockierenden Puffer (0,5 % Saponin, 1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer).
- Mindestens 4 h bei RT inkubieren Auch dies kann O/N bei 4 ° c
- Blockieren Puffer zu entfernen und fügen Sie Primärantikörper Mischung in blocking-Puffer verdünnt. O/N bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Siehe Materialbereich für Beschreibung von Antikörpern verwendet und Verdünnungen vorgeschlagen. Antikörper-Verdünnungen sollte empirisch ermittelt werden. Die Verwendung von Nkx2-5 als eine Referenz-Fleck für die kardiale Sichel wird empfohlen und ist nachgelagerten Schlüsselbild Segmentierung und Analyse Schritte. - Primäre Antikörper durch Aspiration entfernen.
- Wash 3 Mal für jeweils 1 h mit 0,1 % Triton in PBS.
- Waschen zu entfernen und fügen Sie Sekundärantikörper Mischung in Blocking-Puffer verdünnt. 3 h bei RT inkubieren Auch dies kann O/N bei 4 ° c
- Wash 3 Mal für jeweils 1 h mit 0,1 % Triton mit PBS-Puffer. Auch dies kann O/N bei 4 ° c
- Gegenfärbung mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) mit PBS-Puffer für 10 min.
Hinweis: Diese Gegenfärbung erfolgen kann gleichzeitig mit Sekundärantikörper. - Wash 2 Mal für 5 min mit 0,1 % Triton in PBS.
- Aussetzen langsam Embryonen in Anti-Fade Montage Medien (2 % w/V n-Propyl Gallat (nPG), 90 % Glyzerin, 1 X PBS; Materialien siehe für weitere Details). Erlauben Sie mindestens 1 h vor der Montage equilibrate. Streichen Sie sanft Schlauch regelmäßig, um Embryonen in Anti-Fade-Lösung fallen helfen.
Hinweis: Pausenpunkt. Embryonen können für mehrere Tage in Anti-Fade-Lösung bis zu montieren und Bild gespeichert werden.
3. Montage von Embryonen für die Mikroskopie
- Prepare Mikroskop Folien für die Montage mit Silikon Abstandhalter oder doppelseitiges Klebeband. Wenn doppelseitiges Klebeband verwenden, stellen Sie zwei parallele Stapel von 5-6 Schichten ca. 15-20 mm voneinander entfernt. So bleibt genügend Platz, um die Embryonen zu platzieren und sichern das Deckglas ( Abbildung 1).
- Geben einen 15 µL Tropfen Anti-Fade auf der Folie zwischen die doppelseitiges Klebeband. Ein Embryo sorgfältig auf die Folie übertragen.
Hinweis: mehr als ein Embryo kann auf einer Folie platziert werden. Jedoch die spätere Ausrichtung Schritte sind immer schwieriger mit mehreren Embryonen und lange Laufzeiten imaging, Foto-bleichen führen. - Unter dem Mikroskop Dissektion mit feinen Pinzette den Embryo so positionieren, dass die anteriore Seite von der Folie mit der Körperachse im Einklang mit der Längsachse der Folie abgewandt. Abbildung 1 eine schematische Darstellung des Montage-Setup finden Sie unter.
- Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über der Probe durch einseitig auf einem Stapel von doppelseitiges Klebeband ruht und mit Zange um das Deckglas vorsichtig absenken, bis es das andere Band berührt.
Hinweis: Schritte 3.3 und 3.4 sind entscheidend für die korrekte Ausrichtung des Embryos für die Bildgebung zu gewährleisten. Durch die Absenkung des Deckglases entlang der hinteren zum vorderen Richtung, sollte der Embryo nicht Rollen und die kardialen Halbmond Region bleibt orientierten Weg von der Folie, die ideal für die Bildgebung auf einem inversen Mikroskop ist. - Mit Hilfe eine Pipette zusätzliche Anti-Fade zwischen der Folie und dem Deckglas zu verhindern, dass die Probe während der Lagerung/Bildgebung Aussterben hinzu.
4. Confocal Imaging
- Acquire Bilder mit der höchsten Vergrößerung-Ziel, das für die gesamte kardiale Halbmond Region in einem Blickfeld erfasst werden kann. Verwenden Sie Nyquist Sampling-raten, um X-y-Z Voxel Dimensionen zu bestimmen. Die meisten Hersteller von Mikroskop haben eine " optimieren " Taste Nyquist Probenahme sicherzustellen.
Hinweis: Färbung für Nkx2-5 ist vorteilhaft, hier, da es die gesamte kardiale Halbmond Region abzugrenzen wird. Kleineren Z-Schrittweiten (Oversampling) erbringt bessere Ergebnisse der 3D-Modellierung aber zu längeren Aufnahmezeiten und/oder bleichen für einige Proben führen kann. - Imaging-Parameter verwenden standard am besten bildgebende Verfahren eingerichtet. Nämlich, die niedrigste mögliche Laserstärke verwenden, um zu erreichen, gutes Signal-Rausch-Verhältnis für jede Fluorophor und wählen Gewinn und versetzen Ebenen, die einen breiten dynamischen Bereich ohne Sättigung das Signal liefern.
Hinweis: Seien Sie konsequent mit imaging-Parameter zwischen Proben, die direkt verglichen werden. Dies ist besonders wichtig für nachgeschaltete 3D Analyse und Quantifizierung.
5. Bild-Analyse und Quantitative 3D-Modellierung
Hinweis: Für dieses Protokoll wurden Bilder mit Imaris-Softwarepaket analysiert. Ähnliche Analyse kann mit alternativen Paketen möglich. Die folgende Beschreibung umfasst die Analyse Pipeline für einen Referenzkanal (d.h. Nkx2-5) und einem experimentellen Kanal (d.h. YFP). Durch Wiederholung dieser Schritte können zusätzliche Kanäle analysiert werden. Ein Beispiel-Dataset wurde vorausgesetzt, die verwendet werden können, um die Analyse unten zu replizieren.
- Raw-Bild Datensätze in Imaris Arena Ansicht laden und öffnen Sie Datei für gewünschte Embryo Surpass Ansicht. Daten sollten in der 3D Ansicht in MIP (max) Modus geladen werden. Öffnen Sie das Fenster Anzeige Einstellung und wählen Sie nur den Referenzkanal.
- Stellen Sie die Schwelle des Bildes zur besseren Visualisierung. Für diese Analyse das Gamma anpassen, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis zu niedrig für die Segmentierung ist.
Hinweis: Wenn Gamma Korrekturen durchführen, die nicht-linearen Anpassungen sind, können nicht die angepasste Bilder für Intensität Messungen oder Vergleiche verwendet werden. In dieser Phase führen Sie weitere Bildvorverarbeitung (d.h. Beleuchtung Korrekturen, Gaußsche Unschärfe oder anderen Filtern), wenn Ihr Signal-Rausch-Verhältnis nicht zufriedenstellend ist. Wählt man vor der Verarbeitung zu tun, führen Sie dieselben Schritte aus Vorverarbeitung für alle Bilder im Dataset. - Erstellen Sie eine neue Fläche für den Referenzkanal mit der Oberfläche Algorithmus Dialog.
- Wählen Sie die " nur eine Region of Interest Segment " Checkbox.
- Die bounding Box-Region so einstellen, dass es die Region of Interest (ROI, d. h. die kardiale Halbmond Bereich) enthält, wie durch den Verweis Fleck abgegrenzt.
- Wählen Sie den Referenzkanal im Quellkanal Dropdown-Menü. Die Standardeinstellung für Glättung (gleich der Z-Voxel-Größe) in der Regel reicht jedoch empirische Optimierung erfordern. Für diese Analyse verwenden glätten gleich der halben Z Voxel-Größe.
- Perform Schnittstellenüberwachung durch absolute Intensität. Um sicherzustellen, dass die Oberfläche nicht über das Eingangssignal hinausragt, passen Sie mithilfe der Schieberegler Untergrenze.
Hinweis: Für bestimmte Bilder, wo die Zellen leicht abgegrenzt werden können, zählen Sie die " Split berühren Objekte " Algorithmus, um weiter das Signal vom Hintergrund zu trennen. - Filter Objekte von Voxel-Anzahl oder Volumen und ablehnen Hintergrund (klein oder gefunden in Bereichen außerhalb des Nkx2-5) Objekte, die der Algorithmus generiert haben könnte. Den Algorithmus beendet.
- Mit der neu erstellten Oberfläche erstellen Sie einen maskierten Kanal für die experimentelle Kanal.
- Mit der Fläche(n) ausgewählt, wählen Sie die " Maske Sel... ͟ " Funktion aus dem Bearbeitungsfenster.
- Wählen Sie die experimentelle Kanal von Interesse (d.h. YFP). Stellen Sie sicher, dass der " Kanal duplizieren, bevor Sie die Maske anwenden " Kontrollkästchen aktiviert ist.
- In the Displayanpassung Fenster wählen Sie nur den maskierten Kanal. Erstellen Sie eine neue Oberfläche für der maskierte Kanal indem Sie die folgenden 5.3-5.3.5 Schritte.
Hinweis: An dieser Stelle kann es hilfreich sein, passen das Erscheinungsbild jeder Maske um die Visualisierung des 3D-Modells zu erleichtern: Wählen Sie jede Oberfläche und die Farbe tab. anpassen die Grundfarbe und die Transparenz nach Bedarf. Oberflächenfarben nicht zusammenführen, wenn überschnitten. - , Die volumetrische Daten mit jeder Oberfläche ausgewählt zu erhalten wählen Sie die Registerkarte "Statistik". In der " detaillierte " Sub-Registerkarte, wählen Sie " Durchschnittswerte " aus dem Dropdown-Menü. Das Gesamtvolumen der Oberfläche finden Sie in der Spalte Summe der erzeugten Tabelle.
Hinweis: Wenn die erzeugte Oberfläche enthält fehlerhafte Fragmente (d.h. Fragmente von Hintergrundsignal nicht während der Segmentierung oder Bereiche von der Hauptfläche diskontinuierliche ausgeschlossen sind), es kann erforderlich sein, das Gesamtvolumen manuell zu berechnen oder Filtern Sie die Oberflächen nach Volumen oder Anzahl der Voxel zu und sicherstellen Sie, dass nur Signal Segmente in die Berechnung einbezogen werden. Die Lautstärke für jeden Teil der Oberfläche finden Sie durch Auswahl von " alle Werte " aus dem Dropdown-Menü. Jeder Wert auswählen die entsprechenden Region gelb erscheinen, die hilft bei der Wertermittlung auszuschließende machen.
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Representative Results
Die Qualität der endgültigen Daten und Analyse hängt stark von (1) die Integrität und die Morphologie der sezierten Embryonen, (2) die Verwendung der hohen Spezifität Antikörper und (3) die korrekte Einrichtung von imaging-Parameter. Beschädigte Embryonen werden die Oberfläche Generierung zu verwirren und Quantitative Analyse behindern. Beispiele für richtig seziert und inszenierten Embryonen sind in Abbildung 2 b. Die Embryonen können weitere seziert werden, durch das Entfernen der Dottersack an die Antikörper werden häufig unspezifisch binden. Jedoch machen Entfernung von dem Dottersack Embryonen weniger robust, also bei der nachgeschalteten Handhabung geachtet werden sollte.
Die Kombination von hochwertigen Antikörper und richtigen bildgebenden Einstellungen sind entscheidend für hohen Signal-Rausch-Verhältnis Bilder zu erreichen. Abbildung 2A zeigt ein Beispielbild mit Antikörpern gegen Nkx2-5 als Referenz Marker zur Beschriftung der kardialen Halbmond und GFP Label eine Abstammung Bevölkerung zurückzuführen (Foxa2Cre:YFP ventrikuläre Herz-Kreislauf-Vorläuferzellen) interessieren (siehe ergänzende Daten für die Bild- und raw-Dateien). 19 diese Strategie ermöglicht den Vergleich von einer gegebenen Population mit der gesamten kardiale Halbmond Region. Für einige Versuche kann es von Interesse, der FHF und SHF Subdomains der kardialen Mondsichel zu prüfen sein. In diesem Fall der FHF und SHF können beschriftet werden mit Hcn4 und Islet1, bzw. (siehe Referenz19 für Bilder und Quantitative Analyse mit diesen Antikörper-Kombinationen). Mit dem entsprechenden Setup und Sekundärantikörper Kombinationen haben wir erfolgreich abgebildet und analysiert drei Linien gleichzeitig (d.h. der kardialen Halbmond, YFP und ersten oder zweiten HF).
Unfähigkeit zu starkes Signal wird auch die Möglichkeit, hohes Vertrauen 3D-Modelle erzeugen beschränken, da es schwieriger wird, zu Hintergrundsignal von der endgültigen Oberflächen zu entfernen. In diesen Fällen sollte darauf geachtet werden beim Bild Gamma einstellen (während der Pre-processing, Abb. 2 b, 2 C, 2N, 2O) oder Oberfläche Schwellwerte (während Oberfläche Generation Algorithmus, Abbildung 2, 2 H, 2 L ) und ähnliche Einstellungen für alle Bilder innerhalb eines Experiments verwendet werden soll. Nichtbeachtung führt zu inkonsistenten volumetrische Daten, die unangemessen wäre, für den direkten Vergleich zu verwenden. Oft können fehlerhafte Oberflächen aus Hintergrundsignal durch Größe Filtern (Abbildung 2I, 2J), obwohl damit aus hoch-Hintergrundbildern, schwierig sein wird ohne wahre Oberfläche Fragmente sowie entfernt werden.
Abbildung 1: experimentelle Timeline und Schaltpläne. (A) das gesamte Experiment, aus Verpaarung zur Datenanalyse, kann in etwa zwei Wochen durchgeführt werden. Embryonen werden in der früh auf 8th Tag Post Kopulation (E8.25) für kardiale Halbmond Bühne Analyse (B) gesammelt. Einmal festgelegt, sind Embryonen blockiert und befleckt mit primären und sekundären Antikörper vor der Montage. Embryonen sind mit standard-Mikroskopie Rutschen und Deckgläsern, mit doppelseitigem Klebeband als Abstandshalter (C) montiert. Embryonen werden in einem Tropfen Anti-Fade in der angezeigten Richtung (obere C) und einem Deckgläschen sinkt langsam auf das Band (C, unten). Konfokale Bildverarbeitung und Bildanalyse werden durchgeführt, um Bilder mit hoher Auflösung Z-Stapel (D) generieren und 3D Flächenmodelle (E). HF, Kopf Falte; CC, kardiale Halbmond; A, anterior; P, posterior; AF, Anti-Fade. Maßstabsleisten sind 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: schrittweise konfokale Bildbearbeitung und 3D Oberfläche Generation. (A) konfokale Z-Serie in der Volumen-Ansicht geladen. Der Referenzkanal (Nkx2-5) ist ausgewählten (B) und die Intensität und Gamma angepasst (C) vor Beginn des erstellen Oberflächen-Algorithmus. Nach Abschluss des Interessenbereichs ausgewählten (D) und das Niveau der Oberflächendetails ist (E) gewählt. Die ursprüngliche Oberfläche (F) ist thresholded, alle true-Signal in der Oberfläche (G) aufzunehmen. Filterung erfolgt dann entfernen Sie kleine Hintergrund Fragmente (H), um eine endgültige Referenzfläche (ich) zu erzielen. Durch die Auswahl der Referenzfläche (J), der Vergleich Kanal (YFP) kann dupliziert und maskiert (K). Die Intensität und Gamma für diesen Kanal sind dann angepasst (L) vor dem Generieren einer zweiten Fläche durch die gleiche Abfolge von Schritten (M, N). Das Gesamtvolumen für jede Oberfläche wird automatisch berechnet und verglichen werden können, sowohl quantitativ als auch optisch (O, Hinweis, die Oberflächenfarben nicht zusammenführen wenn überlappt). Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das obige Protokoll beschreibt eine Strategie für den Erhalt der quantitativer Daten aus ganzen Berg Immunfluoreszenz Bilder in hoher Qualität von Mäuseembryonen nach der Implantation. Wenn richtig durchgeführt, können die 3D volumetrischen Daten generiert durch diese Schritte für vergleichende und intersektionale Analyse von mehreren Domains innerhalb des Embryos verwendet werden. Die Oberfläche Signal Maskierung beschriebene Ansatz ist besonders nützlich bei der Untersuchung von neuartigen Zellpopulationen im Vergleich zu etablierten Referenzstrukturen.
Wir glauben, dass dieser Ansatz einen entscheidenden Vorteil gegenüber bestehenden Ansätze bietet. Ganzen Berg Immunfluoreszenz mit Weitfeld-Bildgebung kann Gewebe-Ebene Informationen aber es fehlt zellulären Auflösung bieten. Umgekehrt kann Immunfluoreszenz Schnittserien detaillierte Mobilfunk-Ebene Auflösung geben, obwohl diese Daten den dreidimensionalen Vorteil der ganze Berg Bildgebung fehlt. Während dreidimensionale Bildgebung konfokale befasst sich diese Mängel, einige Benutzer das quantitative Potential dieser Daten nutzen, und wir, dass hoffen ermöglicht unser Protokoll mehr Forscher nutzen die Daten, die sie sammeln.
Hier hat dieser Ansatz veranschaulicht, mit dem Marker Nkx2-5 Abgrenzung des kardialen Halbmonds und prüfen das Vorhandensein von Foxa2Cre:YFP Abstammung verfolgt Zellen innerhalb dieser Domäne. Jedoch aufgrund der Fähigkeit, gleichzeitig mindestens drei Linien und gewonnenen Daten hochauflösende 3-Dimension-Bild, werden dieses Protokoll nützlich, um Forscher in vielen Bereichen wahrscheinlich. Wir schlagen vor, dass dieser Ansatz auf mehrere embryonalen Stadien, Organsysteme und Linien durch geringfügige Änderungen des Protokolls anhand der spezifischen Anforderungen des Systems angewendet werden kann. Nach unserer Erfahrung ist dieses Protokoll direkt auf eine Reihe von embryonalen Alter (E6.5-E9.5 auf Minimum) mit begrenzten Anpassungen anwendbar. 19 wir haben nicht mit Durchlässigkeit oder Antikörper-Penetration in Embryonen so groß wie E9.5 mit der Inkubationszeiten aufgeführt, Probleme wenn wir erwarten, dass mit dicker oder Dichter Gewebe diese verlängert werden, um volle Penetration zu erreichen müssten.
Die hier beschriebenen Analyse erfolgte mittels einer proprietären Software-Paket, aber lässt sich in alternativen proprietäre Pakete für big Data Handling optimiert durchgeführt werden. Alternativ können mit computational Sprachen oder Open-Source-Software-Pakete, die zur schnellen Entwicklung einer teilbaren Protokolle Datenbank führt ähnliche Rohrleitungen leicht implementiert werden. Das Wachstum eines globalen Netzwerks von Wissenschaftlern, mit Zugriff auf frei verfügbare Tools und Protokolle für die Bilderfassung und -Analyse, wird schnell das Feld und die Reproduzierbarkeit der Studien zu erhöhen. 17
Nach unserer Erfahrung die große Einschränkung dieses Ansatzes war verwandt mit bildgebenden Tiefe, besonders für später embryonalen Phase und wird hängen stark von den Besonderheiten der Mikroskopie-Installation verwendet wird. In ähnlicher Weise wird wie die Proben für die Bildgebung montiert sind auf die spezifischen Bedürfnisse des Benutzers abhängen. Wir haben festgestellt, dass Platzierung des Interessenbereichs am nächsten an der Linse verbessert Bildgebung Tiefe und Hintergrundsignal verringert, und wir empfehlen die Verwendung von geschichteten doppelseitiges Klebeband zur Befestigung, da es ermöglicht Benutzern das Erstellen einer Kammer, die ihren spezifischen Bedürfnissen passt. Verwendung von Glycerin-basierte Medien mit einer Anti-Fade-Reagenz Montage und Äquilibrierung Proben in diesem Medium vor der Montage, wird dringend empfohlen, Immunofluoreszenz zu unterdrücken. Schließlich sind die Proben, die in dieser Analyse verwendeten fast transparent; Benutzer müssen möglicherweise Clearing Schritte für fortgeschrittene embryonalen Stadien, Gewebefragmente oder Organellen zu integrieren, und bestimmen die beste clearing-Protokoll für eine bestimmte Anwendung empirische Tests erfordern.
Im Falle von kardialen Morphogenese können verschiedene bildgebende Verfahren verwendet werden. Während konfokalen Mikroskopie hier verwendet wird, ist Licht-Blatt Mikroskopie sehr gut geeignet für diese Studien wegen der Geschwindigkeit, Auflösung und Signal-Rausch-Verhältnis des erfassten Bildes. 20 wir erwarten die zunehmende Verfügbarkeit von dieser neuen Technologie um das Dienstprogramm weiter und Reichtum durch ähnliche Bildgebung Konzepte. Ebenso führt die kontinuierliche Weiterentwicklung von fluoreszierenden Reporter,21 Chromophore, Farbstoffen,22 und Leben Embryonenkultur23,24 zu diesen Studien in vier Dimensionen hinzufügen das Element der Zeit, und mit noch mehr Informationen über Strukturen wie ansatzweise während der Entwicklung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH/NHLBI R56 HL128646 und dem Mindich Child Health and Development Institute (MCHDI) am ISMMS (, N.D.) finanziert. E.b. wird unterstützt durch ein NIH/NIDCR Praktikum T32 HD075735. Mikroskopie und Bildanalyse erfolgte der Mikroskopie Kern an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai, die teilweise vom Tisch Cancer Institute am Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
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