Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mäta influensa neutraliserande antikroppen Svaren till A(H3N2) virus i Humansera av mikroneutraliserings-analyser med MDCK-SIAT1 celler

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

Influensa neutraliserande antikroppar korrelerar med skydd av influensainfektioner. Mikroneutraliserings analyser mäta neutraliserande antikroppar i humant serum och används ofta för influensa mänskliga serologi. Vi beskriver en mikroneutraliserings-analys med MDCK-SIAT1 celler för att mäta neutraliserande antikropp titrar för modern 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) virus efter vaccination mot säsongsinfluensa eller infektion.

Abstract

Neutraliserande antikroppar mot hemagglutinin (HA) av influensavirus anses den viktigaste immunmekanism som korrelerar med skydd för influensainfektioner. Mikroneutraliserings (MN) analyser används ofta för att mäta neutraliserande antikroppssvaret hos Humansera efter vaccination mot säsongsinfluensa eller infektion. Madine Darby Canine njure (MDCK) celler är den vanligaste cell substraten för MN analyser. Dock förändrat för närvarande cirkulerar 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) influensa virus har förvärvat receptor bindande specificitet. MDCK-SIAT1 cell raden med ökad α-2,6 sialic galaktos beståndsdelarna på ytan har visat sig ge förbättrad smittsamhet och mer trogna reproduktioner än konventionella MDCK celler för dessa samtida A(H3N2) virus. Här beskriver vi ett MN analysmetod med MDCK-SIAT1 celler som har optimerats för att kvantifiera neutraliserande antikropp titrar till dessa samtida A(H3N2) virus. I detta protokoll, värme inaktiverat sera som innehåller neutraliserande antikroppar först seriellt spädas ut, sedan inkuberas med 100 TCID50/väl av influensa A(H3N2) virus att tillåta antikroppar i sera att binda till virus. MDCK-SIAT1 celler är sedan lagts till virus-antikropp blandningen, och inkuberas i 18-20 h vid 37 ° C, 5% CO2 att tillåta A(H3N2) virus att infektera MDCK-SIAT1 celler. Efter natten inkubation, plattorna är fasta och mängden virus i varje väl kvantifieras i en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) använder anti-influensa en nucleoprotein (NP) monoklonala antikroppar. Neutraliserande antikroppar Titern definieras som det reciproka värdet av den högsta spädning av serumet som ger ≥50% hämning av virus smittsamhet.

Introduction

Influensavirus fortsätter att orsaka sjuklighet och dödlighet i den mänskliga befolkningen varje år. HA är den stora ytan glykoprotein influensavirus. Neutraliserande antikroppar inriktning HA är den huvudsakliga immunmekanism som korrelerar med skydd av influensa infektion1,2. Hemagglutination hämning (HI) analyser och MN analyser är två metoder som ofta används för att mäta antikroppssvaret hos Humansera efter influensa infektion eller vaccination3. HI analysen mäter antikroppar hämning av virus hemagglutination av röda blodkroppar och anses vara en surrogat-analysen. Till skillnad från HI, kan MN analysen direkt mäta nivåerna av antikroppar i humant serum som neutralisera influensainfektion i cellodlingar. MDCK celler används ofta i influensa virusisolering och MN analyser4.

Influensavirus genomgår ständigt antigendrift och Skift, förvärva mutationer på HA proteiner som kan förändra receptor bindande specificitet virus. Sedan 2014 nya kluster av A(H3N2) virus uppstått och fortsatte att cirkulera tills innevarande säsong. Majoriteten av dessa virus hör till genetisk grupp 3C.2a och 3C.3a baserat på fylogenetisk analys av HA proteiner. Många av de cirkulerande virus som 3C.2a hade nedsatt förmåga till hemagglutinate röda blodkroppar och därför inte kan karakteriseras av HI analyser5. Neutralisering analyser måste användas för att mäta antikroppssvaret mot dessa virus som inte hemagglutinate6. Vidare har studier visat att dessa samtida A(H3N2) virus har ändrat receptor bindande egenskaper jämfört med tidigare A(H3N2) virus och tenderar att ackumuleras kultur anpassad mutationer och polymorfism när överförda i in vitro- cell kulturer7,8,9. Jämfört med konventionella MDCK celler, är MDCK-SIAT1 en cellinje som utvecklats av Matrosovich et al. genom stabila transfection MDCK celler med cDNA av mänskliga α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Denna cellinje uttrycker ökade mängder α2, 6-sialic galaktos beståndsdelarna och minskade mängder av α2, 3-sialic acid beståndsdelarna än överordnat MDCK celler10. MDCK-SIAT1 celler har visat sig förbättra isolering priser för A(H3N2) virus jämfört med MDCK celler11. Nyligen, Lin et al. rapporterade att för nyligen framkom 3C.2a och 3C.3a mänskliga A(H3N2) influensavirus, mer trogen virus replikeringar och bättre virus smittsamhet uppnåddes när virus var odlade i MDCK-SIAT1 cellinjer jämfört med MDCK celler7. Således passar bättre MDCK-SIAT1 cellerna i MN analyser att karakterisera antikroppssvaret mot senaste kluster av A(H3N2) virus.

Här beskriver vi ett MN assay med MDCK-SIAT1 celler för att mäta antikroppssvaret mot moderna 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) virus i Humansera. Virus som odlas i antingen ägg eller celler kan användas i denna analys. Värme inaktiverat sera som innehåller neutraliserande antikroppar först seriellt spädas ut, sedan inkuberas med 100 TCID50/väl av influensa A(H3N2) virus att tillåta antikroppar i sera att binda till viruset. MDCK-SIAT1 celler är sedan lagts till virus-antikropp blandningen, och inkuberas i 18-20 h vid 37 ° C, 5% CO2 att tillåta A(H3N2) viruset infektera MDCK-SIAT1 celler och replikera. Efter natten inkubation, plattorna är fasta och mängden virus i varje brunn kvantifieras i ELISA med anti-influensa A NP monoklonala antikroppar. Påvisande av NP indikerar förekomst av virusinfektion och avsaknad av neutraliserande antikroppar. Neutraliserande antikroppar Titern definieras som det reciproka värdet av den högsta spädning av serumet som ger ≥ 50% hämning av virus smittsamhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla influensavirus ska hanteras enligt lämpliga biosäkerhet nivå krav (BSL-2 eller högre) som definieras i biosäkerhet på Microbiological och biomedicinska laboratorier (BMBL)12.

1. beredning av reagens och utgångsmaterial

  1. Förbereda MDCK-SIAT1 celler och sterila cellodlingsmedium
    1. Förbereda MDCK-SIAT1 cellodlingsmedium med 500 mL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med hög glukos, 10% v/v värme inaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 1 mg/mL G418 sulfat (t.ex., geneticin), och 100 U/ml penicillin med 100 µg/mL streptomycin (valfritt). Sterilisera genom filtrering genom ett 0,2 µM porstorlek membran. G418 sulfat läggs till se plasmiden stabilitet i MDCK-SIAT1 cellerna.
    2. Förbereda den MDCK-SIAT1 cellinje. I en 162 cm2- vävnadskultur flask(s) innehållande 30 mL steril cell kultur media, frö kolvar med 2-2,5 x 106 MDCK-SIAT1 celler och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 i 2 dagar. Detta kommer att användas för vävnadsodling smittsam dos (TCID) beslutsamhet och MN analyser.
      Obs: MDCK-SIAT1 celler var vänligen tillhandahållen av Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland10. Denna cell linje kan också erhållas kommersiellt (se Tabell för material).
  2. Förbereda sterila virus förökning media med 500 mL DMEM hög glukos, 0,3% bovint serumalbumin (BSA) bråkdel V, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, och 20 mM HEPES. Sterilisera genom filtrering genom ett 0,2 µM porstorlek membran.
  3. Förbereda 0,75% (v/v) marsvin röda blodkroppar (gpRBCs) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, vid pH 7,2.
  4. Förbereda sterila virus spädningsvätska använder DMEM hög glukos, 1% bovint Albumin bråkdel V (BSA), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 20 mM HEPES. Sterilisera genom filtrering med 0,2 µm porstorlek membran och förbereda färska för varje analys.
  5. Förbereda kall cell fixativ så 80% kallt aceton i PBS (0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 7,2).
  6. Förbereda den tvätta buffert med PBS (0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,2) och 0,3% (v/v) tween-20.
  7. Förbereda antikropp spädningsvätska använder PBS (0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 och 5% fettfri torr mjölk.
  8. Använd anti-influensa A NP mus monoklonal antikropp klon A1 och A3 pool som primär antikropp. Späd i antikroppen spädningsvätska vid den optimala koncentrationen som bestäms genom titrering.
  9. Använd Get antimus IgG konjugerat till häst Rädisa peroxidas (HRP) som sekundära antikroppar. Späd i antikroppen spädningsvätska vid den optimala koncentrationen som bestäms genom titrering.
  10. Förbereda peroxidas substrat med o- fenylendiamin dihydroklorid (OPD) i 0,05 M fosfatbuffert citrat vid pH 5. Förbereda 0,05 M fosfatbuffert citrat genom upplösning 1 kapsel/100 mL avjoniserat H2O. Lös 1 OPD tablett (10 mg) / 20 mL fosfatbuffert citrat omedelbart före användning.
  11. Använd 0,5 M svavelsyra som den OPD stopplösning. Tillsätt 28 mL 18 M svavelsyra lager till 972 mL avjoniserat H2O i en kemisk huva.
  12. Behandling av människors och djurs sera
    1. Värme inaktivera Humansera används i MN analyserna i vattenbad vid 56 ° C i 30 min före analysen. Omedelbart eller vid behov förvara upptinade sera vid 4 ° C i mer än 24 h; om det behövs längre lagringsperiod, lagra sera fryst vid-20 ° C eller kallare.
    2. Behandla djur sera används i MN analyserna med receptorn förstör enzymet (RDE) och värme inaktivera före analysen som följer.
      1. Tina sera i 37 ° c vattenbad och placera sedan på is. Blanda 1 volymdel djur serumprov med 3 volymdelar RDE. Inkubera vid 37 ° c i 18-20 h.
      2. Värme inaktivera RDE behandlas sera vid 56 ˚C för 30 min. Tillsätt 6 volymer av PBS, pH 7,2 till varje prov för en sista utspädning av 1:10. Om det behövs, förvara upptinade sera vid 4 ° C i mer än 24 h; om det behövs längre lagringsperiod, lagra sera fryst vid-20 ° C eller kallare.
        Obs: Djur sera kan innehålla olika sialic acid glycans som kan binda till har av influensavirus och hämma bindningen av influensa-specifika anti-HA antikroppar. Det är därför nödvändigt att RDE behandla alla djur serum innan MN analyserna att ta bort dessa icke-specifik viral HA bindemedel i serumprov.

2. tidens MDCK-SIAT1 cellkultur

Obs: Alla cellkulturer måste utföras i biologiska säkerhetsdragskåp att förhindra kontaminering.

  1. Dekantera cellodlingsmedium från den cell enskiktslager i 162 cm2 kolvar. Trypsinize cellerna genom att skölja enskiktslager med trypsin-EDTA. Tillsätt 5 mL trypsin-EDTA för att täcka den cell enskiktslager. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 tills enskiktslager lossnar (5-10 min). Tillsätt 15 mL MDCK-SIAT1 cell kultur media till varje kolv som innehåller trypsinized celler, pipett upp och ner för att separera celler.
  2. Använd en hemocytometer och trypan blå att avgöra de blodkroppar och livskraft. Utsäde cellerna i nya 162 cm2 vävnadsodling flaskor som innehåller 30 mL cell kultur media med 2-2,5 x 106 celler /flask och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 i 2 dagar för användning i TCID och MN analyser. Utsäde celler på 4-5 x 106 celler/kolv och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 i 2 dagar för användning i virus förökning.
    Obs: Sådd densiteten kan justeras om kortare eller längre kultur perioder önskas. För virus förökning, celler bör nå över 100% konfluens. För vävnadsodling infektion dos (TCID) och MN analyser bör cellerna vid 75-95% konfluens (figur 1).

3. spridning av A(H3N2) virus i MDCK-SIAT1 celler

Obs: A(H3N2) virus kan spridas antingen i 10-11 dag gamla embryonated hönans ägg enligt standardprotokoll3eller MDCK-SIAT1 cell kulturer. MDCK-SIAT1 celler bör nå över 100% confluency för virus inympningen. Virus utsädespotatis kan ympas med flera spädningar av inokulatet. De inokulum spädningar med den bästa skörden HA och smittsamhet kan användas för ytterligare MN analyser.

  1. Ta bort cellodlingsmedium från den cell enskiktslager (> 100% konfluens) i 162 cm2 kolvar. Tvätta enskiktslager två gånger med 15 mL steril 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,2, och Dekantera.
  2. Etikett 1 kolv som kontroll och tillsätt 20 mL av virus förökning media. Inkubera kolv vid 37 ° C med 5% CO2. Lämna denna kolv orörd och använda för jämförelse efter dag 1 av virus förökning.
  3. Tillsätt 10 mL steril virus förökning media till flask(s) och inkubera alla flask(s) vid 37 ° C, 5% CO2. Tina en injektionsflaska med influensa virus lager vid rumstemperatur och placera sedan på is. Späd med virus förökning media att målet spädningarna.
    Obs: Target utspädningar kan justeras baserat på HA titrar av virus bestånd. För att förbereda ett 1: 1000 utspädda inokulum, tillsätt 100 µL av virus till 9,9 mL steril virus förökning media. Vänd försiktigt, ta bort 1 mL av 1: 100 till 9 mL steril virus förökning media, vänd försiktigt för en 1: 1000 utspädd inokulum. Placera på is.
  4. Ta bort alla kolvar utom referenskolven från inkubatorn. Ta bort virus förökning media från flask(s) av MDCK-SIAT1 celler och Inokulera varje kolv med 10 mL utspädd virus. Inkubera kolvar vid 37 ° C, 5% CO2 för 1 h, roterande flask(s) var 15 minut.
  5. Ta 5 mL av inokulatet från flask(s) och ersätta med 15 mL virus förökning media som innehåller 1 µg/mL TPCK-trypsin. Inkubera i flask(s) vid 37 ° C, 5% CO2 för 16-18 h.
  6. Efter den natten inkubationen, iaktta flask(s) under 100 X lupp förstoring och leta efter cytopatisk effekt (CPE) på cellerna. Ta bort 15-17 mL virus supernatant från flask(s) och Ersätt med 15-17 mL nyberedd virus förökning media innehållande 2 µg/mL TPCK-trypsin.
  7. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2kolvar. Övervaka CPE av enskiktslager (jämfört med cell kontroll kolven) och kontrollera HA regelbundet (varje 4 h) med 0,75% gpRBC till skörd.
    1. Ställa in en HA 96 brunnar mikrotiterplattan. Tillsätt 50 µL 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 7,2 till brunnar A2 - A12 och B2 - B12 (duplikat), och wells H1 - H12 för kontroll.
    2. Tillsätt 100 µL av virus supernatant A1 och A2, utföra en 2-faldig seriell utspädning från A1 och B1 genom A12 och B12. Kassera 50 µL efter blandning i A12 och B12. Tillsätt 50 µL 0,75% gpRBCs i rader A, B och H.
    3. Knacka plattan och inkubera i rumstemperatur i 1 h.
      1. Bestämma HA virus supernatanten genom att luta 96 brunnar mikrotiterplattan i 45° till 60° vinkel.
      2. Läs plattor för hemagglutination; den högsta utspädningen av virus som uppnår fullständig hemagglutination anses HA titrering slutpunkten för den specifika viruset. Spela in det reciproka värdet av den högsta virus utspädningen med komplett hemagglutination som HA titern av viruset.
        Obs: De kvittade RBC i rad H (kontroller) bör börja ”köra” och bilda en liten teardrop-form på grund av tyngdkraften. Vänta tills röda blodkropparna kontroll brunnar är klar läsa kör, sedan knapparna RBC i viruset titrering brunnar. De som uppvisar RBC knappar och ”kör”, uppnår inte hemagglutination. Leta upp den högsta utspädningen av virus som helt hämmar hemagglutination som slutpunkt HA titern av viruset.
  8. Samla in viruset när HA virus kultur platåer eller virus kulturen når målet HA (till exempel > 16 HAU), men före cellen enskiktslager börjar visa betydande CPE.
    1. Centrifugera virus kulturen supernatant vid 300 x g i 10 minuter vid 4 ° C till pellet cellulära skräp. Överföra skirat supernatanten innehållande virus skörden till en ren röret. Alikvotens supernatanten innehållande viruset skörd till engångsbruk sterila kryogen injektionsflaskor och frysa omedelbart vid-70 ° C eller kallare.
      Obs: Virus bestånden används för MN analyserna bör ha hög smittsam titer och minimal defekt partiklar. Minsta utspädning av viruslagren att uppnå 100 TCID50/50 µL för MN assay är 1: 100.
      Obs: Virus bestånden används i MN analyserna bör inte vara tinade och omfrysning.

4. bestämning av TCID av viruset

  1. Dag 1: Virustitrering
    1. Tina en injektionsflaska av virus i rumstemperatur och placera omedelbart på is.
    2. Testa viruset på två olika start utspädningar: 10-2 och 10-3. Tillsätt 100 µL av virus till 9,9 mL virus spädningsvätska för 10-2 utspädning. Tillsätt 1 mL 10-2 utspädning till 9,0 mL virus spädningsvätska för 10-3 spädning.
    3. Använder två mikrotiter tillsätt plattor (1 för 10-2 utspädning) och plåt 2 för 10-3 utspädning, 100 µL av virus spädningsvätska till alla brunnar utom kolumn 1 i 96 brunnar mikrotiterplattan.
    4. Utföra ½log10 utspädningar (10-2, 10-2,5, 10-3, etc.). Lägg till 146 µL av viruset börjar utspädning till alla brunnar i kolumn 1 och överföra 46 µL seriellt från kolumn 1 genom kolumn 11 (figur 2). Förändring pipettspetsar mellan brunnar. Efter blandning kolumn 11, kassera tips med 46 µL utspädning.
    5. Använd kolumn 12 som Cell kontroll (CC); den innehåller bara virus spädningsvätska. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C, 5% CO2.
  2. Dag 1: Förberedelse av MDCK-SIAT1 celler
    Obs: Den MDCK-SIAT1 cell enskiktslager bör nå 75-95% konfluens för TCID och MN analyser. En 162 cm2 kolv på 95% konfluens bör ge tillräckligt med celler till utsäde ~ 4-5 mikrotiter plattor.
    1. Tvätta den 75-95% konfluenta enskiktslager med 20 mL PBS ta bort FBS i kultur media. Trypsinize cellerna som följer.
      1. Skölj enskiktslager med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, lägga till 7 mL trypsin-EDTA för att täcka den cell enskiktslager. Lägg kolven platt och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 tills enskiktslager lossnar (cirka 5-10 min). Tillsätt 7 mL virus spädningsvätska till varje kolv som innehåller trypsinized celler.
    2. Tvätta cellerna med virus spädningsvätska för att ta bort FBS.
      1. Pipettera försiktigt upp och ner för att separera celler. Överföra cellerna till en 50 mL konisk röret; Fyll röret med virus spädningsvätska.
      2. Centrifugera 485 x g för 5 min. Dekantera viruset spädningsvätska, ersätta med färsk 50 mL spädningsvätska för virus, och centrifugera 485 x g för 5 min. Dekantera viruset spädningsvätska och ersätta med färsk virus spädningsvätska (10 mL/kolv) att resuspendera pelleten.
    3. Använd en hemocytometer och trypan blå för att fastställa celltal och livskraft. Justera cell koncentration med spädningsvätska till 1,5 x 105 celler/mL-virus.
    4. Tillsätt 100 µL utspätt MDCK-SIAT1 celler till varje brunn av mikrotiter pläterar (1,5 x 104 celler per brunn) och täcker plattorna. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 18-20 h.
  3. Dag 2: ELISA
    1. Fixering av celler
      1. Ta bort mediet från de mikrotiter plattorna. Tvätta vart bra med 200 µL av PBS. Tillsätt 300 µL kallt 80% aceton till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur för 10 min. ta bort fixeringsvätskan och låta plattorna att luften torr.
    2. ELISA
      1. Primär antikropp tillägg
        Obs: Anti-influensa A NP monoklonal antikropp bör användas i överskott som primära antikroppen i ELISA. Bestämma den optimala antikropp utspädningen för varje parti av primära antikroppar genom att utföra antikropp titreringar i MN. Markera den primära antikropp-koncentration som finns i överskott och med bästa signal-bakgrund-förhållande.
        1. Späd den anti-influensa A NP monoklonala antikroppen (primär antikropp) i målet koncentrationen i antikroppen spädningsvätska (t.ex. lägga till 30 µL av primär antikropp i 30 mL av antikropp spädningsvätska för en target utspädning av 1: 1000).
        2. Tvätta plattorna 3 gånger med 300 µL tvättlösning. Tillsätt 100 µL utspätt primär antikropp till varje brunn. Odla i rumstemperatur för 1 h.
      2. Sekundära antikroppar tillägg
        Obs: Geten anti mus IgG konjugerat med pepparrots peroxidas (HRP) bör användas i överskott som sekundära antikroppen i ELISA. Bestämma den optimala antikropp utspädningen för varje parti av sekundära antikroppar genom att utföra antikropp titreringar. Välj den sekundära antikroppskoncentrationen i överskott och med bästa signal-bakgrund-förhållande.
        1. Späd den Get antimus IgG konjugerat till HRP antikropp (sekundär antikropp) i målet koncentrationen i antikroppen spädningsvätska (t.ex. lägga till 7,5 µL av sekundära antikroppar till 30 mL av antikropp spädningsvätska för en target 1:4000 utspädning).
        2. Tvätta plattorna 3 gånger med 300 µL tvättlösning. Tillsätt 100 µL utspätt sekundär antikropp till varje brunn. Odla i rumstemperatur för 1 h.
      3. Substratet tillägg och plattan läsning
        1. Tvätta plattorna 5 gånger med 300 µL tvättlösning och tryck på en luddfri torka.
        2. Tillsätt 100 µL av nylagade substrat till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur tills färgutvecklingen mättat fett och optiska densitet (OD) cell kontrollbrunnar < 0,2.
        3. Tillsätt 100 µL stopplösning i alla brunnar. Läs OD av brunnar på 490 nm med en spektrofotometer i mikroplattan.
  4. TCID 50 beräkning
    1. Beräkna den median OD490 cell kontroller (kolumn 12).
    2. Överväga något test väl med en OD490 större än två gånger medianen OD490 i CC brunnarna som ”positiva”; annars är det ”negativa”.
    3. Beräkna de TCID50 av den virus användande den Reed-Muench metod13.
      1. Bestämma antalet positiva och negativa vid varje spädning.
      2. Beräkna den ”kumulativa positiva”, ”kumulativ negativa”, ”Ratio” och ”% positiva” som illustreras i tabell 1.
      3. Beräkna ”proportionella avståndet” mellan den utspädning visar > 50% positiva och utspädning visande < 50% positiva använder följande:
        Equation 1
        Obs: Korrektionsfaktorn för ½ log utspädning är 0,5. Till exempel i tabell 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Beräkna viruset TCID50 genom att lägga till proportionella avståndet till en utspädning visar > 50% positiva.
        Till exempel i tabell 2, TCID50 är 10-5+(-0.25) = 10-5.25. Observera att detta är den TCID50 av viruset per 100 µL (eller 10-5.25/100 µL).
    4. Beräkna den virus utspädningen. För MN analyser, späd viruset till 200 TCID50/100 µL (motsvarande 100 TCID50/50 µL per brunn).
      Observera: I exemplet i tabell 1, 1 TCID50 är 10-5.25 i 100 µL och utspädning att uppnå 200 TCID50/100 µL är 1:891 baserat på beräkningar: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102,95 = 1 / 891

5. MN Assay med MDCK-SIAT1 celler

  1. Dag 1: Test och kontroll sera förberedelse och plattan layout
    1. Tina sera i 37 ° C vattenbad och ta bort omedelbart efter upptining. Alikvot mängden sera som måste provas. minst 10 µL av ursprungliga sera behövs för att testa med en virus i linne. Testa sera i dubbletter om möjligt.
    2. Värme inaktivera Humansera i 30 min i 56 ° C vattenbad som i steg 1.12.1. Plats sera på is inlägg Värmeinaktivering, lägga till virus spädningsvätskan i sera att uppnå en 1:10 före utspädning.
    3. RDE behandla och pre späd djur sera 1:10 för kontroller per 1.12.2.
      Obs: Tinade och behandlade människors och djurs sera kan lagras vid 4 ° C för längre än 24 h. skall sera frysas vid-20 ° C eller kallare om längre lagringsperiod krävs före analysen.
    4. För att testa med en virus, tillsätt 100 µL 1:10 utspädd sera att kolumnerna A1 till A10 (figur 4). Tillsätt 50 µL virus spädningsvätska i raderna B genom H, utom kolumner 11 och 12 (figur 4). Utföra en 2-faldig seriell utspädning från rader A genom H, och kassera de senaste 50 µL på rad H (figur 4).
      Obs: När flera virus testas, sera kan spädas i titer rör. Utspädning av serumet, till syfte att fastställa antikroppnivåns serum, i väl A är 1:10, väl B 1:20, väl C 1:40, väl D 1: 80, väl E 1:160, väl F 1:320, väl G 1:640, väl H 1:1,280 (figur 4).
    5. För virus kontroll, tillsätt 50 µL virus spädningsvätska till brunnar A12, B12, C12 och D12 (inget serum). För cell kontroll, tillsätt 100 µL av virus spädningsvätska brunnar E12, F12, G12 och H12 (inga virus, inga sera).
    6. För kontrollsera (exempelvis iller sera kontroller), tillsätt 100 µL utspätt kontrollsera till väl en kolumn 11 och tillsätt 50 µL av virus spädningsvätska till brunnar B11 - H11. Serial utspädd ner.
    7. Täck plattorna, inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 tills redo för virus tillägg.
  2. Dag 1: Virus tillägg
    1. Späd viruset till 100 TCID50/50 µL med virus spädningsvätska.
    2. Tillsätt 50 µL utspädda virus alla brunnar, med undantag för kolumn 11 på återtitrering (BT) plåtarna och cell kontrollbrunnarna E12, F12, G12 och H12 på alla plåtar (figur 4). För dessa plattor med kontrollsera på kolumn 11, lägga till virus i kolumn 11.
    3. Återtirering (BT)
      1. Inkludera en BT i kolumn 11 av en uppsättning duplicerade plattor (till exempel platta 1A och 1B). Tillsätt 50 µL av virus spädningsvätska till alla brunnar i kolumn 11. Tillsätt 50 µL av viruset på 100 TCID50/50 µL till den första brunnen (A11). Blanda genom pipettering upp och ner.
      2. Blanda och överför 50 µL till successiva brunnar att utföra 2-faldig seriespädningar. Ändra pipettspetsarna mellan brunnar att undvika virus överföring. Kassera 50 µL från väl H11.
      3. Tillsätt 50 µL av virus spädningsvätska till kolumn 11 att föra den slutliga volymen 100 µL. Tryck plattorna att blanda.
    4. Inkubera plattorna vid 37 ° C, 5% CO2 för 1 h.
    5. Utföra MDCK-SIAT1 cell tillägg på dag 1 och ELISA på dag 2 enligt beskrivningen i steg 4.2 och 4.3 (också beskrivs i 5.3 och 5.4)
  3. Dag 1: MDCK-SIAT1 cell tillägg
    1. Förbereda MDCK-SIAT1 cellerna som beskrivs i steg 4,2. Tillsätt 100 µL MDCK-SIAT1 celler på 1,5 x 105 celler/mL till varje brunn (1,5 x 104 celler per brunn). Inkubera plattorna vid 37 ° C, 5% CO2 för 18-20 h.
  4. Dag 2: ELISA
    1. Efter natten inkubation, den andra dagen, fixa cellerna med 80% kallt aceton som beskrivs i steg 4,3.
    2. Primär antikropp tillägg
      1. Tvätta plattorna 3 gånger med 300 µL tvättlösning. Späd den anti-influensa A NP monoklonala antikroppen (primär antikropp) till den optimala koncentrationen som bestäms genom titrering i antikropp spädningsvätska (t.ex. lägga till 30 µL av primär antikropp i 30 mL av antikropp spädningsvätska för en target utspädning av 1: 1000).
        Obs: 100 µL av primär antikropp krävs per brunn. ~ 10 mL behövs per platta.
      2. Tillsätt 100 µL utspätt primär antikropp till varje brunn. Odla i rumstemperatur för 1 h.
    3. Sekundära antikroppar tillägg
      1. Tvätta plattorna 3 gånger med 300 µL tvättlösning. Späd geten anti mus IgG konjugerat till HRP antikropp (sekundär antikropp) i målet koncentrationen i antikropp spädningsvätska (t.ex. lägga till 7,5 µL av sekundära antikroppar till 30 mL av antikropp spädningsvätska för en mål-1:4000.)
        Obs: 100 µL av sekundära antikroppar krävs väl per 96. ~ 10 mL behövs per platta.
      2. Tillsätt 100 µL utspätt sekundär antikropp till varje brunn. Odla i rumstemperatur för 1 h.
    4. Substratet tillägg och plattan läsning
      1. Tvätta plattorna 5 gånger med 300 µL tvättlösning och tryck på luddfri torka.
      2. Tillsätt 100 µL av nylagade substrat till varje brunn och odla i rumstemperatur tills de virus-kontrollbrunnarna når en OD490 = 0,8 - 3, med cell control låg bakgrund OD490 < 0,2.
      3. Tillsätt 100 µL av stopplösning i alla brunnar. Läs OD av brunnar på 490 nm med en spektrofotometer i mikroplattan.
  5. Analys av data
    Obs: MN beräkningarna skall bestämmas för varje platta individuellt.
    1. Bestämma neutraliserande antikropp titern i varje serumprov.
      1. Beräkna OD490 cut-off av 50% virus neutralisering för varje platta med hjälp av följande ekvation:
        Equation 2
        Obs: Här x = 50% av neutralisering cut-off. Den ömsesidiga serumspädningen som motsvarar den högsta utspädningen med OD490 anses mindre än 50% av avskärningen (≥50% hämning) neutralisering antikropp titern för att serumprov (figur 5).
    2. Kontrollera att cellen kontrollbrunnarna har en OD490 < 0,2 och virus kontrollbrunnarna har en OD490 = 0,8 - 3.
    3. Kontrollera virus smittsamheten i varje analys (100 x TCID50) av virus BT. det godkända intervallet av BT 50, 100 eller 200 TCID. Om du använder samma cut-off som definieras i steg 4.4.2, bör den högsta virus utspädningen i kolumnen BT med OD ovan cut-off i brunnar E11, F11, G11.
      Obs: Serum positiva kontroller bör ge titrar inom 2-faldigt av de värden som erhålls i de tidigare testerna. Den OD490 i kontrollen negativt serum bör vara densamma som observerats för virus kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestämning av smittsamhet virus bestånden är det första steget i MN-analysen. Figur 2 illustrerar plattan layouten för att bestämma de TCID50 av bestånd som virus. För virus bestånd med okänd smittsamhet, kan viruset titreras från flera före utspädningar, till exempel både 10-2 och 10-3, för att fånga de bästa Titrerkurvan för att beräkna smittsamhet av viruset. Mängden virus som används i MN analysen bör vara standardiserat till 100 TCID50/well (50 µL). Minsta utspädning av viruslagren att nå 100 TCID50/väl är 1: 100.


Figur 3 beskriver de kritiska steg en MN analys med MDCK-SIAT1 celler. Värmeinaktiverade sera är serial utspädda i 96 brunnar som illustreras i figur 4. 100 TCID50/50 µL virus läggs sedan till varje brunn. Efter 1 h inkubation att tillåta antikroppen i sera bind till virus, 100 µL av 1,5 x 105 celler/mL MDCK-SIAT1 celler läggs till varje brunn. För optimalt resultat bör MDCK-SIAT1 celler vid 75-95% konfluens (figur 1) för både TCID50 och MN analyser. Plattorna inkuberas därefter för 18-20 h vid 37 ° C, 5% CO2. Efter natten inkubation, mängden virus i varje brunn upptäcks och kvantifieras i ett anti-influensa A NP ELISA (figur 3).

OD i varje representerar väl mängden virusinfektion och replikation i MDCK-SIAT1 celler i närvaro av seriellt utspädda sera som innehåller neutraliserande antikroppar. Det kan plottas mot sera spädningarna (figur 5). Det reciproka värdet av den högsta serumspädningen som uppnått ≥50% neutralisation anses antikropp titern för serumprovet. Figur 5 innehåller exempel på resultat från 2 patienter med Parade sera testades mot en/HongKong/4801/2014 A(H3N2) 3C.2a virus före och efter influensa vaccinering. Med patient 1 före vaccination sera, ingen av sera spädningarna hämmade virusinfektion (figur 5, ljus blå kurva) och därför anses negativa (< 10). Däremot hämmade efter vaccination sera från denna patient virusreplikation, som anger vaccination induced neutraliserande antikroppar. Den tredje utspädningen av detta serum är den högsta utspädningen under 50% cut-off, denna patient har således en efter vaccination titer 40 (figur 5, mörk blå kurvan). I jämförelse innehåller serum från den andra patienten före vaccinationen redan befintliga neutraliserande antikroppar på en titer på 320. Efter vaccination, titern utökas till > 1,280. I det här fallet på en 1:10 utspädning av serumet, inga antikroppar slutet titer uppnåddes. Serum bör testas igen på en högre utspädning för att uppnå slutet titer.

Figure 1
Figur 1 . MDCK-SIAT1 cellkultur. MDCK-SIAT1 celler. (A) MDCK-SIAT1 konfluenta enskiktslager (> 100% konfluens) för virus inympningen; (B) MDCK-SIAT1 celler på loggen fas med 75-95% konfluens för TCID50 och MN analyser.

Figure 2
Figur 2 . TCID plattan layout. Virus smittsamhet avgörs av TCID50. Virus lager är före utspädning till 10-2och sedan seriellt spädas på en ½ logg per spädning till 10-7 (kolumn 1-11), på 8 replikat per utspädning (rad A -H). Kolumn 12 används som den enda cell-kontrollen. TCID50 virus beståndet kan beräknas med metoden Reed-Muench.

Figure 3
Figur 3 . Schematiska MN analysens med MDCK-SIAT1 celler. 50 µL av Värmeinaktiverade sera späds seriellt 2gånger i 96-wells plattor. 50 µL av 100 TCID50 av A(H3N2) virus läggs sedan till varje brunn. Plattorna inkuberas vid 37 ° C i 1 h så att bindningen av virus och antikropp. Sedan 1,5 x 104 MDCK-SIAT1 celler läggs till varje brunn. Plattorna inkuberas i 18-20 h vid 37 ° C, 5% CO2. Efter natten inkubation, Plattorna tvättas och fast, mängden virus i varje brunn kvantifieras i ELISA med anti-influensa A NP monoklonala antikroppar. Sera antikroppsnivåerna var beräknas baserat på cut-off definieras av virus kontroller och cell-kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . MN assay plattan layouten. Värmeinaktiverade sera späds pre vid 1:10, sedan seriellt 2gånger utspätt i 96 brunnar i kolumn 1-10. Virus-kontroller (virus och celler bara, ingen sera) och cell kontroller (celler bara, inget virus och ingen sera) finns i kolumn 12. Kolumn 11 används för tillbaka titrering eller kontroll sera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . MN assay resultaten av Humansera testades mot en/HongKong/4801/2014 A(H3N2) virus använder MDCK-SIAT1 cellerna. Sera från två patienter pre- och post-2016-17 säsongsbunden influensavaccinering testades mot en/HongKong/4801/2014 A(H3N2) virus använder MDCK-SIAT1 celler. Neutralisering titrarna är det reciproka värdet av den högsta serumspädningen som uppnår ≥50% virus neutralisering, som anges med pilar på varje kurva. Patient 1: före vaccination titer < 10, efter vaccination titer 40; patientens 2:pre-vaccination titer 320, efter vaccination titer > 1,280.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MN analysen är en av de viktigaste analyser som används för influensa serologi för att påvisa antikroppssvar efter influensainfektion eller vaccination. Titrar som genereras från MN analyser används ofta som det primära resultatet av många influensa seroepidemiology studier. MN analyser används också allmänt för sero-diagnos och utvärdering av vaccin immunogenicitet. Internationella Inter lab studier har utförts för att jämföra MN analyser utförs i flera laboratorier14.

I motsats till HI syftar MN analysen till att direkt mäta funktionella antikroppar som kan neutralisera virusinfektion i cellkultur. Det finns olika former av MN analyser används i fältet laboratorier runt om i världen. Avläsning av analyserna (dvs, minskning av virus smittsamhet i närvaro av neutraliserande antikroppar) kan baseras på ELISA kvantifiering av virus NP antikroppar, HA kvantifiering av virus, eller immuno-färgning virus plack i varje brunn följande virusinfektion i närvaro av antikroppar och inkubation i cell kulturer14,15. Olika former av lysrör-baserade plack minskning neutralisering analyser (t.ex., fokus minskning analyser och ViroSpot analyser) används ofta för antigena karakterisering av stora mängder influensa virus fältet isolat, delvis på grund av det låga viruset belopp som krävs i dessa analyser15,16. För karakterisering av antikroppssvaret mot influensa i mänskliga serologi, 2-dagars ELISA baserat MN assay rekommenderas av Världshälsoorganisationen (WHO) globala influensa övervakningsnätverk för serologisk diagnos av influensa3. Denna metod används också allmänt i sero-epidemiologi studier och utvärdering av antikroppssvar efter vaccination mot säsongsinfluensa. Det upptäcker primärt antikroppar mot influensa HA ytan protein och därför kan identifiera funktionella stamspecifika antikroppar.

Här beskriver vi en 2-dagars ELISA-baserade MN assay som använder MDCK-SIAT1 celler. Denna analys är optimerad för att detektera neutraliserande antikroppar mot samtida A(H3N2) virus i humant serum. Flera kritiska steg bör övervägas när utför MN-analyser med MDCK-SIAT1 celler. Först bör vara passaged MDCK-SIAT1 celler i kultur media som innehåller G418 sulfat för att upprätthålla stabiliteten i den mänskliga αSIAT1 cDNA i cellinje. G418 sulfat (t.ex., geneticin) krävs inte i media under virus förökning och MN-analyser med MDCK-SIAT1 celler. Celler som används i MN analyser bör vara log tillväxtfas med 75-95% konfluens. Andra, bra virus bestånd är nödvändiga för att genomföra framgångsrika MN analyser. Viruslagren bör ha hög smittsamhet mätt som TCID50 titrering och ett minimum av defekta partiklar. Minsta utspädning av viruslagren att nå 100 TCID50/väl virus bör vara lika eller större än 1: 100. Även om både ägg och cell överförda virus kan användas i MN analyser, MDCK-SIAT1 cellinje upprätthåller bättre genetisk stabilitet för förökningsmaterial 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) virus7. Efter virus förökning, bör HA och NA gener av virus bestånden sekvenseras för att säkerställa att inga ägg eller cell kultur anpassad mutationer introduceras på viktiga antigena webbplatser som kan orsaka förändringar i antigenicitet av det virus som används i analysen. Tredje, mängden smittsamma virus som används i varje assay bör noggrant titrerad och verifierade med införandet av en återtitrering för varje virus i varje analys. För mycket virus som används i analysen kan sänka de antikroppsnivåerna var upptäckt och minska känsligheten för analysen. Jämväl, för lite virus som används i analysen kommer att orsaka svaga VC signaler och hög bakgrunder (CC) och falskt positiva resultat. Det är därför viktigt att inkludera lämpliga positiva och negativa kontrollsera i analyserna att övervaka prestanda. När man jämför antikroppssvaret mot flera virus använder samma sera, är det viktigt att se till att ryggen titreringar av alla virus inom ett godtagbart intervall.

MN analysen med MDCK-SIAT1 celler är känsliga och specifika att upptäcka antikroppssvaret mot moderna 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) influensavirus i Humansera, inklusive antigena drev A(H3N2) virus6. Denna analys har använts för att utvärdera vaccinerade Humansera paneler till 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) virus efter inaktiverat influensa vaccinering5,17,18. Dock som har influensa virus fortsätta att förvärva mutationer som kan ändra antigenicitet och receptor bindande egenskaper av virus och orsaka antigendrift, kontinuerliga insatser krävs för att optimera befintliga influensa serologi analyser för att upprätthålla sensitivitet och specificitet krävs att karakterisera nya framväxande influensavirus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapportera någon intressekonflikt. Resultat och slutsatser i denna publikation är de av författarna och representerar inte nödvändigtvis åsikter Centers for Disease Control and Prevention och byråns finansiering.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Xiuhua Lu, Dr Feng Liu och Ms. Ashley Burroughs från influensa uppdelningen av CDC för kritisk granskning och hjälp i utarbetandet av detta manuskript. Vi tackar Dr. Adrian Reber från influensa Division av CDC för hans hjälp förbereda grafik av figur 3. Slutligen, vi tackar Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland för att ge MDCK-SIAT1 cellerna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine? Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).
  5. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1 2017-2018 (2017).
  6. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  7. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  8. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  9. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  12. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  13. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  14. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  15. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  16. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
  17. WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en 2015-2016 (2015).
  18. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1 2016-2017 (2016).

Tags

Infektionssjukdomar frågan 129 A(H3N2) influensa virus MDCK-SIAT1 mikroneutraliserings TCID neutraliserande antikropp immunitet
Mäta influensa neutraliserande antikroppen Svaren till A(H3N2) virus i Humansera av mikroneutraliserings-analyser med MDCK-SIAT1 celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson,… More

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson, S., Holiday, C., Levine, M. Z. Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells. J. Vis. Exp. (129), e56448, doi:10.3791/56448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter