Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

Dette er en protokol til at studere intracellulær protein-protein interaktioner baseret på biotin-begærlighed pull-down system med nyhed om at kombinere celle-gennemtrængende sekvenser. Den største fordel er, at målet sekvens er inkuberes med levende celler i stedet for cellelysater og derfor interaktioner vil opstå inden for den trådløse forbindelse.

Abstract

Her præsenterer vi en protokol for at studere intracellulær protein-protein interaktioner, der er baseret på den udbredte biotin-begærlighed pull-down system. Ændringen forelægges omfatter kombinationen af denne teknik med celle-gennemtrængende sekvenser. Vi foreslår at designe celle-gennemtrængende lokkemad, der kan sættes i varmeskab med levende celler i stedet for cellelysater og derfor interaktioner fundet vil afspejle dem, der opstår i den intracellulære kontekst. Connexin43 (Cx43), et protein, der danner gap junction kanaler og hemichannels er nedreguleret i high-grade gliomer. Regionen Cx43 bestående af aminosyrer 266-283 er ansvarlig for hæmning af det muterede aktivitet af c-Src i gliom celler. Her bruger vi TAT som celle-gennemtrængende sekvens, biotin som pull-down tag og regionen i Cx43 består mellem aminosyrer 266-283 som mål at finde intracellulære interaktioner i de svære at transfect menneskelige gliom stamceller. En af begrænsningerne i den foreslåede metode er, at molekylet brugt som agn kunne undlade at folde ordentligt, og derfor, interaktioner findes ikke kunne være forbundet med virkningen. Men denne metode kan være særligt interessant for de interaktioner, der er involveret i signaltransduktionsveje fordi de normalt er som uløseligt uordnede regioner og, derfor, de ikke kræver en bestilt foldning. En af fordelene ved den foreslåede metode er desuden, at relevansen af hver rester på samspillet kan studeres nemt. Dette er et modulopbygget system; Derfor kan andre celle-gennemtrængende sekvenser, andre tags og andre intracellulære mål være ansat. Endelig, anvendelsesområdet for denne protokol er langt ud over protein-protein interaktion, fordi dette system kan anvendes til andre bioaktive laster såsom RNA sekvenser, nanopartikler, vira eller ethvert molekyle, der kan være transduced med celle-gennemtrængende sekvenser og smeltet til pull-down tags at studere deres intracellulære virkningsmekanisme.

Introduction

Protein-protein interaktioner er afgørende for en lang række cellulære processer. Fuldt ud at forstå disse processer, er metoder til at identificere protein interaktioner i de komplekse intracellulære miljø påkrævet. En af de mest anvendte metoder til at identificere interaktion partnere et protein er at bruge dette protein eller en mimetiske peptid af en del af dette protein som agn i affinitet pull-down eksperimenter efterfulgt af påvisning af bindende proteiner. Avidin-biotin system bruges ofte på grund af høj affinitet, specificitet og stabil interaktion mellem begærlighed og biotin1,2. Normalt, biotin er kovalent bundet til agn (protein eller peptid) og efter en periode med inkubering med cellelysater at tillade oprettelsen af interaktioner, biotinylated agn bundet til sin intracellulære partnere er trukket med begærlighed eller begærlighed derivater konjugeret med støtte perler. Derefter, agn-protein interaktioner er opdaget efter vask, eluering og analyse af denatureringen elektroforese efterfulgt af vestlige skamplet. Et af problemerne med denne teknik er, at interaktioner mellem protein af interesse og dens intracellulære partnere finder sted uden for den trådløse forbindelse. Dette er især vigtigt for de interaktioner, der er involveret i signaltransduktionsveje fordi de finder sted i specifikke intracellulære steder, de er forbigående og de er typisk udført af ikke rigelige proteiner. Derfor, inden for cellelysater disse interaktioner kan være maskeret af andre mere rigelige proteiner eller af proteiner, der normalt ikke er tæt på.

Celle-gennemtrængende peptider (CPPs) er korte peptider (≤40 aminosyrer), sammensat primært af kationiske aminosyrer, der er i stand til at transportere en bred vifte af molekyler i næsten enhver celle3. Laster såsom proteiner, plasmid DNA, siRNA, vira, imaging agenter og forskellige nanopartikler har været konjugeret med CPPs og effektivt internaliseret4,5. På grund af denne transport af evne er de også kendt som protein transduktion domæner (PTDs), membran translocating sekvenser (MTSs) og Trojan peptider. Blandt CPPs studerede TAT peptid fra HIV transaktivatoren protein TAT6 har været en af de mest udbredte 7,8,9. TAT er en nonapeptide, der indeholder 6 arginin og 2 lysin restkoncentrationer og er derfor yderst kationiske. Substitution undersøgelser har vist, at den netto positiv ladning af TAT er nødvendige for elektrostatiske interaktion med plasma membraner af eukaryote celler og dens efterfølgende internalisering10. På samme måde til andre CPPs binder positivt ladede TAT kraftigt elektrostatisk til de forskellige negativt ladede arter til stede i den ekstracellulære overflade af cellemembraner, herunder lipid hoved grupper, glykoproteiner og proteoglycaner3 , 10. de bioaktive ladninger transporteres af TAT bliver straks gratis i cytosol at nå deres intracellulære partnere.

Her præsenterer vi en metode, der kombinerer TAT CPP med biotin at studere intracellulære interaktioner. Målet er at designe celle-gennemtrængende lokkemad ved at fusionere target biomolekyle TAT og biotin. Den største fordel ved dette forslag er, at samspillet mellem agn og dens partnere vil finde sted inden for den trådløse forbindelse. For at vise effektiviteten af denne metode brugt vi som agn en lille sekvens af protein Cx43, der er blevet rapporteret at interagere intracellulært med proto-oncogene c-Src11,12,13. Cx43 er en integreret membran protein, der er meget til udtryk i astrocytter14og er nedreguleret i high-grade gliomer, den mest almindelige ondartet svulst af det centrale nervesystem15,16,17 ,18. Det er tidligere vist, at regionen Cx43, der interagerer med c-Src (aminosyrer 266-283 i menneskelig Cx43; PubMed: P17302) smeltet til TAT (TAT-Cx43266-283) hæmmer de muterede aktivitet af c-Srcin gliom celler og gliom stilk celler (GSCs)19,20,21. Cx43266-283 for at designe den intracellulære agn, har været smeltet TAT på N-terminus (TAT-Cx43266-283) og biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283- B). Denne strategi er brugt med succes i rotte gliom C6 cellelinie for at identificere c-Src, c-terminale Src kinase (CSK) og fosfatase og tensin homolog (PT) som intracellulære partnere i denne region af Cx4320. Her beskriver vi denne metode teste dens effektivitet i menneskelig GSCs, som er meget relevante for gliom terapi men meget sværere at transfect end ikke-stamceller gliom celler.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev foretaget på universitetet i Salamanca.

1. cellerne

  1. To dage før du begynder proceduren, plade cellerne i den krævede massefylde forudsættes at være sammenflydende dagen af forsøget. Plade celler i kolber eller plader. Protein udvinding vil dog lettere fra plader. Det er bekvemt at forberede mindst 4 plader af 78 cm2 eller 2 flasker af 150 cm2 pr. betingelse pr. eksperiment, være sikker på, at resultaterne er konsistente.
  2. I denne undersøgelse, plade menneskelige G166 GSCs i 4 flasker af 150 cm2, kulturperler i RHB-en stamcelle medium suppleret med 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF og b-FGF som beskrevet af Pollard et al.22. Processen når sammenløbet blev nået. For eksempel, når 5 x 106 G166 celler blev forgyldt i et 150 cm2 kolbe, blev de behandlet 2 dage efter plating.

2. Biotinylated CPPs

  1. Spin hætteglas indeholdende den frysetørrede biotinylated CPPs (BCPPs) på 8200 x g for 30 s, for at undgå nogle af pulveret resterende på låget. Omfatte en kontrol BCPP at være sikker på at de interaktioner, der er fundet er bestemt af target sekvens. I denne undersøgelse, var kontrol BCPP TAT-biotin (TAT-B) og behandling BCPP var TAT-Cx43266-283- B. Andre kontrolelementer kan bruges som TAT sammenvoksede til røræg eller muterede fragmenter bond til biotin.
  2. Opløs BCPPs i den tilsvarende næringssubstrat til stamopløsningen angivet af fabrikanten; for eksempel, for at opnå en stamopløsning af 2 mg/mL BCPP at behandle GSCs tilføje 0,5 mL af GSR næringssubstratet til ét hætteglas indeholdende 1 mg af BCPP. Vortex og sørg for, at peptid er godt opløst.

3. rør

Bemærk: Forberede mindst tolv 1,5 mL reagensglas pr. betingelse kræves i afsnit 7.

  1. Mark de første 3 rør pr. betingelse. De vil have det samlede volumen af cellulære lysates fremstillet i trin 6.4.
  2. Markere et A i 3 rør pr. betingelse. Disse rør vil have de første analysere fremstillet efter lysing og spinning det cellulære lysates, trin 7.2.
  3. Markere et B i 3 rør pr. betingelse. Disse rør vil have en lille alikvot af de første supernatanter. Disse lysates vil tjene som de vestlige skamplet prøver i trin 7.3.
  4. Markere en C i 3 rør pr. betingelse. Disse rør skal analysere fremstillet efter pull-ned med NeutrAvidin, trin 7.7.
    Bemærk: Dette er vigtigt i tilfælde af den vestlige skamplet viste ikke noget signal for proteiner, hvilket betyder proteinerne ikke blev trukket eller gik tabt på nogle trin i proceduren. Hvis dette var situationen, Gentag processen med at trække ned i proteiner.

4. cellulære behandling med BCPPs

  1. Opsug næringssubstratet.
  2. Udskift de tilsvarende volumen af friske medium skal inkuberes BCPPs i den mindste muligt mængden af medium ifølge inkubation times. Det er meget vigtigt, at i hvert fald medium dækker helt hele overfladen af pladen/kolbe således at cellerne ikke tørre ud, eksempelvis 6 mL pr. 150 cm2 for en 30 min inkubation.
  3. Tilføje volumen af stamopløsningen af BCPP til cellekulturer at nå frem til den koncentration, som har vist sig for at være effektiv. I denne undersøgelse 50 µM TAT-Cx43266-283har -B vist sig for at reducere GSR spredning.
    1. Derfor, tilføje 92.8 µL af 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) pr. mL af næringssubstratet at opnå en endelig koncentration på 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Hvis lydstyrken skal tilføjes er forskellig for kontrol peptider, komplet med næringssubstratet op til det samme endelige rumfang. For eksempel, 49.1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) plus 43,7 µL GSR medium blev tilføjet pr. mL af næringssubstratet at opnå en endelig koncentration på 50 µM TAT-B.
  4. Marker cellerne i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 min for at sikre, at samspillet mellem BCPP og dens intracellulære partnere finder sted. Hvis interaktionen tager længere tid, inkuberes i længere tid eller justere gange i tilfælde af eksperimentet bestod af et tidsforløb. Derudover kan samspillet mellem interesse forfremmet eller forhindret ved at stimulere forskellige intracellulær signalering veje.

5. buffere og løsninger.

  1. Forberede PBS pH 7,4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.
  2. Forberede protein lysisbuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, før du bruger, skal du tilføje følgende: 1: 100 (v/v) Protease hæmmer Cocktail, 1 mM natriumfluorid, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluorid (PMSF) og 0,1 mM natrium orthovanadate.
  3. Forberede Laemmli buffer: (4 x: 0.18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glycerol; 3,7% SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoethanol eller 9 mM DTT; 0,04% (v/v) bromophenol blå (BB)).

6. protein udvinding

Bemærk: Protein udvinding blev udført som tidligere beskrevet20,23. Udføre dette hele afsnit af proceduren ved 4 ° C.

  1. Opsug næringssubstratet helt.
  2. Vask 3 x 10 mL med iskold phosphat bufferet saltvand (PBS) pr. 150 cm2 meget omhyggeligt for at undgå celle detachement.
  3. For at opnå den celle lysate, tilsættes 3 mL lysisbuffer pr. 150 cm2 og grundigt skrabe overfladen ved hjælp af en celle skraber. Vippe plade/kolben til omkring 45 grader vil gøre lettere at samle cellelysater i deres tilsvarende rør.
  4. Hæld 1 mL af cellulære lysate pr tube i tre 1,5 mL reagensglas. Disse rør vil blive markeret med betingelsen og kopiere som angivet i trin 3.1.

7. pull-down

  1. Centrifugeres 1,5 mL rør på 11.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
  2. Overføre analysere nye rør (A).
  3. Tage en alikvot af denne supernatanten pr. betingelse til forskellige rør (B), dvs. 50 µL pr. rør. Tilføj 4 x Laemmli buffer (16,6 µL til 50 µL af lysate) og fryse ved-20 ° C. Disse lysates vil tjene som sædvanlig vestlige skamplet prøver.
  4. Omrystes godt NeutrAvidin Agarosen af blid ryster. Skær spidsen af pipetten tips til at øge deres diameter og forbedre Pipettering af perlerne.
Tilsæt 50 µL af NeutrAvidin Agarosen pr. mL af celle lysate i (A) rør.
  • Der inkuberes ved 4 ° C natten over med meget blid ryste for at tillade NeutrAvidin at interagere med BCPPs bundet til deres intracellulære partnere.
  • Der centrifugeres ved 3.000 x g i 1 min. ved 4 ° C til at indsamle komplekset af NeutrAvidin med proteiner.
  • Forsigtigt fjerne analysere og overføre dem til ren rør (C). Holde dem til at bruge dem i tilfælde af pull-down ikke er vellykket.
  • Vask trin: tilføje frisk lysisbuffer til pellets (rør A), resuspend ved inversion og Gentag trin 7.6) og 7,7) for 5 flere gange. Alle disse supernatanter kan kasseres.
  • Fjerne analysere og tilføje 2 x Laemmli buffer til det ønskede endelige rumfang (40 µL pr. 1,5 mL tube for pellets fremstillet af 150 cm2 flasker af sammenflydende celler).
  • Elueres ved 100 ° C i 5 min at adskille interaktionerne mellem proteiner og centrifugeres i 30 s på 8.200 x g at sammenpresse NeutrAvidin perler.
  • Tage supernatanter, der indeholder de dissocierede proteiner med kapillar tips til nye rør (D). Perlerne kan holdes i tilfælde af gentagne eluering trin er påkrævet.
    Bemærk: Analysere (rør D) er nu klar til at blive lastet i vestlige skamplet eller at fryse ved-20 ° C.

    • 8. vestlige skamplet

    Bemærk: Western blotting blev udført som tidligere beskrevet24.

    1. Indlæse svarer til mængden af hver prøve pr. vognbane på Bis-Tris (4-12%) midigels i et Midi-celle elektroforese System.
    2. Transblot proteiner ved hjælp af en tør blotting system i en nitrocellulose regelmæssig stak.
    3. Pletten membran med 10% Ponceau i 10 min.
    4. Vask membraner 3 x 5 min. med 5 mL af TTBS.
    5. Blokere membraner med 7% mælk i TTBS for 1 h med blid ryster i rør eller små kasser. Sørg for den anvendte mængde er nok til at dække membraner og at de ikke tør, dvs 40 mL pr. hele midi membran.
    6. Vask 3 x 5 min. med 5 mL af TTBS.
    7. Der inkuberes natten over ved 4 ° C med det primære antistof mod protein af interesse med blid ryster.
    8. Vask 3 x 5 min. med 5 mL af TTBS.
    9. Inkuber membran ved stuetemperatur med den korrespondent peroxidase-konjugeret sekundær antistof i TTBS for 1 h.
    10. Vask 3 x 5 min. med 5 mL af TTBS.
    11. Udvikle med en kemiluminescens substrat i et chemiluminescence system.

    9. problemløsning

    1. Hvis efter at udvikle Western blot nogen af prøverne viste intet signal overhovedet for proteiner, kontrollere Ponceau.
      Bemærk: Membran i Ponceau bør vise udefineret og talrige bands langs banerne indlæst. Hvis bandene ikke er meget mærkbar, mængden af proteiner indlæses muligvis ikke nok eller overførslen kan være gået forkert. Overveje at gentage den vestlige skamplet.
    2. Hvis der er ingen pletter på alle i Ponceau membran i enhver lane, Gentag hele proceduren fra trin 7.4 i (C) rør.
    3. Hvis efter at have udviklet den vestlige skamplet et protein signal er meget svagt, men Ponceau viste proteiner Inkuber igen membran med det primære antistof i længere tid. Hvis signalet er stadig ret svag, Ruger igen ved stuetemperatur.

    10. andre teknikker som anvendes i denne artikel

    1. Immuncytokemi af BCPPs
      1. Fix celler i 4% PARAFORMALDEHYD (0,2 mL per cm2) i 20 min.
      2. Vask 3 x 5 min. med PBS (0,2 mL per cm2).
      3. Anvende den tilsvarende antistof (mindst 0,15 mL per cm2) fortyndet i antistof løsning på producentens maalte koncentration mod din protein af interesse natten over ved 4 ° C.
      4. Inkuber med fluorophore-konjugeret sekundær antistof (0,15 mL per cm2) i 2 timer ved stuetemperatur.
      5. Gentag trinene 10.1.2-10.1.4 med andre antistoffer mod din proteiner af interesse. Vær omhyggelig med ikke at bruge samme art til forskellige primære antistoffer eller samme bølgelængde fluorophores for sekundære antistoffer.
      6. Montere cellerne ved hjælp af det antifade reagens (0,005 mL per cm2).
      7. Analysere på et fluorescens mikroskop tilsluttet et digitalt kamera.
    2. MTT assay
      1. Kultur celler ved 37 ° C i 24-godt plader.
      2. Inkuber celler i mørke i 75 min. med 0,15 mL af næringssubstratet per cm2 indeholder 0,5 mg/mL MTT.
      3. Opsug mediet og inkuberes celler i 10 min. i mørke med dimethylsulfoxid (0,25 mL per cm2) med mild ryster.
      4. Absorbansen måles ved en bølgelængde på 570 nm med en mikrotiterplade læser.

    Representative Results

    Før du bruger BCPPs til at studere intracellulære interaktion, er det kritisk at sammenligne effekten af BCPP vs CPP til validering af de opnåede resultater med BCPP. Derfor, for at undersøge om optagelsen af biotin ændrer aktiviteten af target sekvens, vi først analyseres effekten af TAT-Cx43266-283- B sammenlignet med TAT-Cx43266-283 på G166 GSCs morfologi. Det gør udført vi nogle immunofluorescens analyser af to cytoskeletal proteiner, F-actin og α-tubulin efter 24 timer behandling. Figur 1 viser, at G166 GSCs 50 µM TAT-Cx43266-283 eller TAT-Cx43266-283- B erhverve en mere afrundet form i forhold til de aflange og udvidet cellulære forlængelser vist i kontrolelementer (TAT eller TAT-B). Faktisk figur 1b viser, at actin filamenter samles for det meste som actin netværk, når cellerne blev behandlet med TAT-Cx43266-283 eller TAT-Cx43266-283- B mens de danner flere actin bundter i kontrol celler (behandlet med TAT eller TAT-B)25. Derimod varierer α-tubulin distribution ikke mellem de forskellige betingelser. Disse resultater viste, at tilstedeværelsen af biotin ikke ændrer effekten af target sekvens på morfologi af G166 GSCs. I tidligere undersøgelser20,21viste vi, at TAT-Cx43266-283 reduceret G166 GSCs spredning. I denne undersøgelse, vi undersøgt om TAT-Cx43266-283- B udøver de samme virkning i vækst som TAT-Cx43266-283. At gøre det, vi analyseret G166 GSCs spredning af MTT assay efter 72 h af behandling. MTT assay er en kolorimetrisk analyse til vurdering af celle metaboliske aktivitet. MTT metaboliseres af NAD (P) H oxidoreductase enzymer i mitochondrier afspejle antallet af levedygtige celler til stede. Figur 2 viser, at reduktionen i G166 GSCs celle levedygtighed ikke er signifikant forskellig når celler blev behandlet med 50 µM TAT-Cx43266-283 eller 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Ja, både betydeligt formindsket G166 GSCs spredning i forhold til kontrol, TAT eller TAT-B.

    Når vi bekræftet, at effekten af vores mål sekvens i G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) ikke blev ændret ved inddragelse af biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283- B), vi undersøgte de intracellulære partnere i denne sekvens følge protokollen beskrevet i denne undersøgelse (figur 3). Fordi caveolae har været involveret i mekanismen af TAT internalisering26, analyserede vi tilstedeværelsen af caveolin-1 (Cav-1) i pull-downs. Western blot analysen (figur 4) viste, at TAT-B og TAT-Cx43266-283- B interagere med Cav-1. Men evne til TAT-Cx43266-283- B at rekruttere c-Src, PT og CSK er stærkere end fundet med TAT-B. Fokale vedhæftning kinase (FAK) er et substrat i c-Src, der ikke har vist sig at interagere med Cx43. Faktisk, FAK ikke udviste nogen betydelig interaktion med enten TAT-B eller TAT-Cx43266-283- B.

    At bekræfte samspillet mellem TAT-Cx43266-283- B og c-Src, G166 GSCs blev inkuberet med 50 µM TAT-Cx43266-283- B for 30 min og deres lokalisering fulgte med fluorescerende streptavidin Konfokal mikroskopi (figur 5 ). Vores resultater viste, at den intracellulære distribution af TAT-Cx43266-283- B er tæt på plasma membran (vist af phosphatidylserin farvning) og kampe med de c-Src. Faktisk co lokalisering analyser viste nogle punkter af co lokalisering (hvid) mellem TAT-Cx43266-283- B og c-Src i Flet image. Derfor bekræfter konfokalmikroskopi undersøgelser de opnåede resultater med BCPP pull-down protokollen beskrevet i denne undersøgelse.

    Figure 1
    Figur 1: Effekt af BCPP og CPP på GSR morfologi.
    G166 GSCs var belagt med en lav tæthed (2 x 104 celler / cm2) og 24 h de blev inkuberet med 50 µM kontrol CPP (TAT), styre BCPP (TAT-B), CPP (TAT-Cx43266-283) eller behandling BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-actin (rød), α-tubulin (grøn) og flettede + DAPI immunfarvning af de samme felt viser G166 GSCs morfologi. Barer = 50 µm. b) F-actin immunfarvning viser den anderledes fordeling af F-actin i G166 GSCs efter inkubation i 24 timer med 50 µM styre CPP (TAT) eller BCPP (TAT-B) sammenlignet med 50 µM behandling CPP (TAT-Cx43266-283) eller BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2: Effekt af BCPP og CPP på GSR levedygtighed.
    G166 GSCs var belagt på 5500 celler/cm2 i 24-flerhuls plader og inkuberes med 50 µM kontrol peptider, CPP (TAT) eller BCPP (TAT-B), eller 50 µM behandling peptider, CPP (TAT-Cx43266-283) eller BCPP (TAT-Cx43266-283- B). Cellernes levedygtighed blev analyseret ved hjælp af en MTT assay efter 72 timer. Resultaterne udtrykkes som MTT absorptioner og er gennemsnit ± s.e.m. af mindst 3 eksperimenter (++ p˂0.01 vs kontrol. ** p˂0.01, *** p˂0.001 vs TAT eller TAT-B; en-vejs ANOVA withTukey post-test). Bemærk, at der ikke er væsentlige forskelle mellem virkningerne af CPPs vs BCPPs. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3: Protokol diagram.
    Trin for trin grafiske skildring af proceduren som beskrevet i afsnittet "Protokollen", fra inkubation af BCPPs indtil de eluted BCPPs og deres interagerende proteiner var obtained.1) inkuberes kultur celler med BCPPs på den ønskede koncentration for den krævede tid. 2) under inkubation, BCPPs er internaliseret og de interagerer med deres intracellulære partnere. 3) vaske cellerne tre gange på isen med iskold PBS. 4) lyse celler for at udtrække proteiner. 5) overføre cellelysater rør.6) spin på 11000 x g i 10 min. ved 4 ° C. 7) overførsel analysere nye rør (A) og holde en lille alikvot af lysates at behandle som regelmæssige Western blot prøver i tube (B). 8) resuspend NeutrAvidin Agarosen perler og tilsæt 50 µL til hver tube, en ved hjælp af en cut pipette tip. 9) inkuberes med forsigtigt ryste i 12 timer ved 4 ° C for at tillade NeutrAvidin Agarosen perler til at interagere med BCPPs og deres partnere. 10) spin for 1 min på 3000 x g at sammenpresse perler med biotinylated lokkemad og deres interagerende proteiner bundet til dem. 11) Overfør analysere nye rør (C) og holde dem til brug i tilfælde af pull-down skal gentages. 12) vaske pellet fem gange med frisk lysisbuffer, resuspend ved inversion, spin for 1 min på 3000 x g og supernatanten. 13) fjerne alle supernatanten omhyggeligt. 14) tilsættes den ønskede mængde af 4 x Laemmli buffer og elueres proteiner ved 100 ° C i 5 min. 15) Spin på 8200 x g for 30 s til pellet perlerne. 16) overføre de eluted proteiner, der findes i supernatanten med kapillar tips til nye rør (D). 17) belastning på gel til Western blot analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4: Undersøgelse af de intracellulære samspillet mellem TAT-Cx43266-283- B i G166 GSCs af pull-down efterfulgt af vestlige skamplet.
    G166 GSCs blev inkuberet med 50 µM TAT-B eller TAT-Cx43266-283- B. Efter 30 min. cellerne var mængden og TAT-B eller TAT-Cx43266-283blev -B knyttet til deres intracellulære partnere trukket med NeutrAvidin perler. Eluted proteiner var indlæses og analyseres af vestlige skamplet at studere niveauer af FAK, c-Src, CSK, PT og Cav-1. Bemærk at Cav-1 interagerer med begge TAT-B og TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PT og CSK interagere fortrinsvis med TAT-Cx43266-283- B og FAK ikke udviste nogen interaktion med enten TAT-B eller TAT-Cx43266-283-B. venligst Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5: Bekræftelse af TAT-Cx43266-283- B intracellulære interaktioner i G166 GSCs af Konfokal mikroskopi.
    G166 GSCs blev inkuberet med 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Efter 30 min, celler var fast og behandlet for at lokalisere TAT-Cx43266-283- B med Cy2-Streptavidin (grøn), c-Src ved immunofluorescens (rød) og phosphatidylserin med annexin V (blå). Bemærke nogle punkter af co lokalisering (hvid) mellem TAT-Cx43266-283- B og c-Src tæt på plasma membran i Flet billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    Der er mange metoder til at undersøge protein-protein interaktioner. Metoden i denne undersøgelse er baseret på den udbredte biotin-begærlighed pull-down system, hvor en biotinylated agn er inkuberes med cellelysater at tillade oprettelsen af interaktioner. Ændringen i denne undersøgelse omfatter kombinationen af denne teknik med celle-gennemtrængende sekvenser. Vi foreslår at designe celle-gennemtrængende lokkemad, der kan sættes i varmeskab med levende celler i stedet for cellelysater og derfor interaktioner fundet vil afspejle dem, der opstod inden for den trådløse forbindelse.

    Her bruger vi TAT som celle-gennemtrængende sekvens, biotin som pull-down tag og regionen i Cx43 består mellem aminosyrer 266-283 som mål at finde intracellulære interaktioner i menneskelige GSCs. Det strukturelle grundlag for samspillet mellem Cx43 og c-Src er velkendt11,12. Dette er et vigtigt samspil, fordi det hæmmer den muterede aktivitet af c-Src i gliom celler24,13. Faktisk, efterligne CPPs, der indeholder denne regionen (TAT-Cx43266-283) de antioncogenic egenskaber af Cx43 gliom celler19,20,21. I rotte gliom C6 celler omfatter den mekanisme, hvormed TAT-Cx43266-283 hæmmer c-Src ansættelse af c-Src sammen med sin endogene hæmmere CSK og PT20. Det bør nævnes, at GSCs er meget interessant som et mål i gliom terapi, fordi de udgør en delpopulation, der er resistente over for konventionelle behandlinger og derfor ansvarlig for en gentagelse af denne ondartede hjerne tumorer27. Endvidere, de er skrap til at transfect celler og derfor undersøgelse af intracellulære samspillet bliver vanskeligere. CPPs er hurtigt og effektivt internaliseret i GSCs19 begunstige deres brug for studiet af intracellulære interaktioner. I denne undersøgelse, ved hjælp af CPPs sammenvoksede til biotin vi bekræfte samspillet mellem Cx43266-283 sekvens med c-Src sammen med sin endogene hæmmere CSK og PT i menneskelige GSCs.

    Denne metode er meget effektive til at studere den intracellulære mekanisme af bioaktive stoffer. Det er dog meget vigtigt at bekræfte, at de biologiske virkninger af biotinylated celle gennemtrængende agn ikke er anderledes end der opnås med den ikke-biotinylated, en. Dette trin er forpligtet til at knytte de interaktioner, der er fundet med virkning af de bioaktive foderblandinger. Derudover bør stabiliteten af sammensat, samt dens mulige nedbrydning af proteaser som dets mulige giftighed, nøje testet og tages i betragtning før planlægningen eksperimentet. I eksemplet præsenteres, har TAT-Cx43266-283 anti-proliferativ påvirkning G166 menneskelige GSCs været tidligere dokumenteret20. I denne undersøgelse, vi bekræfte, at den anti-proliferative effekt af TAT-Cx43266-283- B og af TAT-Cx43266-283 er meget ens. Derudover analyse af cellulære morfologi viste, at α-tubulin og F-actin distribution er meget ens i G166 GSCs behandlet med TAT-Cx43266-283- B eller med TAT-Cx43266-283. Helt, disse resultater viser, at optagelsen af biotin på c-terminus af TAT-Cx43266-283 ikke ændre virkningerne af dette stof på menneskers GSCs. Men hvis biotin ville ændre virkningerne af de bioaktive molekyle, andre tags for protein oprensning kan testes, såsom FLAG octapeptide (DYKDDDDK)28, menneskelige influenza hemagglutinin-afledte tag HA (YPYDVPDYA) eller glutathion S-transferase (GST)29. Tilsvarende, hvis TAT ikke er rettet mod befolkningens celle af interesse, anden celle gennemtrængende sekvenser, såsom penetratin, MPG (for en anmeldelse, se30) eller celle specifikke sekvenser kan være brugt31.

    Ud over undersøgelsen proteiner, der specifikt interagerer med target sekvens, ideelt, bør tilstedeværelsen af proteiner, der interagerer med både kontrolelementet og target sekvens og proteiner, der ikke arbejder sammen med dem, som positive og negative kontroller, være adresseret. I denne forstand, vi fandt Cav-1 i kontrolelementet og behandlet situation, hvilket tyder på at caveolae har været involveret i mekanismen af internalisering, som det har tidligere været vist26. Derudover FAK, som interagerer med c-Src men formodes ikke for at interagere med Cx43 c-terminal, var fraværende i både kontrol- og behandlede situationen. Disse resultater styrke specificiteten af samspillet mellem TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK og pt. For at bekræfte de opnåede resultater med denne protokol, kan Konfokal mikroskopi bruges til at visualisere fordelingen af de interagerende proteiner og studere deres Co lokalisering. Vi fandt således, at TAT-Cx43266-283- B og c-Src udstille en lignende intracellulære distribution med nogle punkter af co lokalisering bekræfter resultaterne opnået med pull-down eksperimenter. I virkeligheden, TAT-Cx43266-283- B skal fordeles tæt ved plasma membran tyder på, at lasten, i denne undersøgelse Cx43266-283, dirigerer molekyle for sine intracellulære partnere.

    En af begrænsningerne i den foreslåede metode er, at molekylet brugt som agn kunne undlade at folde ordentligt og de forventede virkninger ikke ville findes. I denne situation kunne interaktioner findes ikke forbindes til effekten. Men denne metode kan være særligt interessant for de interaktioner, der er involveret i signaltransduktionsveje fordi de som regel er som uløseligt uordnede regioner32 og derfor de ikke kræver en bestilt foldning. Desuden er en af fordelene ved den foreslåede metode at tidsforløb af samspillet kan følges, som er særligt relevante for forbigående interaktioner. Derudover kan relevansen af hver rester på samspillet studeres nemt. Det er muligt at undersøge relevansen af posttranslationelle modifikationer på protein-protein interaktion, for eksempel ved phosphomimetic substitution af glutamat for Serin og Threonin. På samme måde, substitution af Serin og Threonin for alanin eller tyrosin for phenylalanin tillader test effekt af ikke-phosphorylatable Serin, threonin eller tyrosin.For at efterligne phospho-tyrosin, er den mest nøjagtige måde substitution af Tyr til p-Tyr33.

    Endelig, anvendelsesområdet for denne protokol er langt ud over protein-protein interaktion, fordi dette system kan anvendes til andre bioaktive laster såsom RNA sekvenser, nanopartikler, vira eller andre molekyler, der kan være smeltet til biotin og transduced med CPP at studere deres intracellulære virkningsmekanisme.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    Vi takker M. Morales og J. Bravo for deres hjælp med design af CPPs og J.C. Arévalo for hans hjælp med pull-down-protokollen. Vi er taknemmelige for den tekniske bistand fra T. del Rey. Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien; FEDER BFU2015-70040-Rasmussen, Junta de Castilla y León, Spanien; FEDER SA026U16 og Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez og A. González-Sánchez er modtagere af et stipendium fra Junta de Castilla y León og den Europæiske Socialfond.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

    Tags

    Biokemi spørgsmålet 130 TAT Biotin-begærlighed celle-gennemtrængende peptider Pull-down intracellulær interaktioner Protein-protein interaktioner vestlige skamplet
    Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Jaraíz-Rodríguez, M.,… More

    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter