Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

Dette er en protokoll for å studere intracellulær protein-protein interaksjoner basert på biotin-avidin rullegardinmenyen system med nyheten av kombinerer celle-gjennomtrengende sekvenser. Hovedfordelen er at målet sekvensen er ruges med levende celler i stedet for cellen lysates og derfor samspillet skjer innen mobilnettet sammenheng.

Abstract

Her presenterer vi en protokoll for å studere intracellulær protein-protein interaksjoner som er basert på brukte biotin-avidin rullegardinmenyen systemet. Modifikasjonen presentert inkluderer kombinasjonen av denne teknikken med celle-gjennomtrengende sekvenser. Vi foreslår å designe celle-gjennomtrengende agn som kan være inkubert med levende celler i stedet for cellen lysates og derfor samhandlingene funnet gjenspeiler de som oppstår i intracellulær konteksten. Connexin43 (Cx43), et protein som danner gapet krysset kanaler og hemichannels er ned-regulert i høyverdig gliomas. Cx43 regionen bestående av aminosyrer 266-283 er ansvarlig for hemming av kreftfremkallende aktiviteten til c-Src i glioma celler. Her bruker vi TAT som cellen-gjennomtrengende sekvens, biotin rullegardin koden og regionen Cx43 består mellom aminosyrer 266-283 som mål å finne intracellulær interaksjoner i stamceller vanskelig å transfect human glioma. En av begrensningene i den foreslåtte metoden er at molekylet brukt som agn kan mislykkes å kaste riktig og følgelig, interaksjoner fant ikke kunne være knyttet til effekten. Men kan denne metoden være spesielt interessant for samhandlingene involvert i signaltransduksjon trasé fordi de er vanligvis utført av egentlig uordnede regioner og, derfor de ikke krever en bestilte folding. I tillegg er en av fordelene med den foreslåtte metoden at relevansen av hver rester på samspillet kan studeres lett. Dette er et modulært system; Derfor kan andre celle-gjennomtrengende sekvenser, andre koder og andre intracellulær mål anvendes. Til slutt, omfanget av denne protokollen er langt utover protein-protein samhandling fordi dette systemet kan brukes på andre bioaktive laster som RNA sekvenser, nanopartikler, virus eller et molekyl som kan være transduced med celle-gjennomtrengende sekvenser og smeltet på rullegardinmenyen koder å studere deres intracellulær virkningsmekanismen.

Introduction

Protein-protein interaksjoner er avgjørende for et stort utvalg av cellulære prosesser. Å fullt ut forstå disse prosessene, er metoder for å identifisere protein interaksjoner i komplekse intracellulær miljøet nødvendig. En av de mest brukte metodene for å identifisere samhandling partnere av et protein er å bruke det proteinet eller et mimetic peptid av en del av at protein som agn affinitet rullegardin eksperimenter etterfulgt av gjenkjenning av bindende proteiner. Avidin-biotin systemet brukes ofte høy affinitet, spesifisitet og stabil interaksjon mellom avidin og biotin1,2. Vanligvis biotin er covalently bundet til agn (protein eller peptid) og etter en periode med inkubering med cellen lysates å tillate etablering av interaksjoner, biotinylated agn bundet til partnerne intracellulære trekkes med avidin eller avidin derivater konjugert med støtte perler. Deretter er agn-protein interaksjoner oppdaget etter vask, elueringsrør og analyse av denaturing geleelektroforese etterfulgt av Western blot. Et av problemene med denne teknikken er at samspillet mellom protein av interesse og intracellulær partnere tar sted enhetskontroll mobilnettet. Dette er spesielt viktig for samhandlinger som er involvert i signaltransduksjon trasé fordi de finner sted på bestemte intracellulær steder, de er forbigående og de er vanligvis utført av ikke rikelig proteiner. Derfor i celle lysates kan disse interaksjoner være maskert av andre mer rikelig proteiner eller proteiner som vanligvis ikke er i nærheten.

Celle-gjennomtrengende peptider (CPPs) er kort peptider (≤40 aminosyrer), består hovedsakelig av kationisk aminosyrer som er i stand til å transportere en rekke molekyler i nesten hvilken som helst celle3. Lastene som proteiner, plasmider DNA, siRNA, virus, tenkelig agenter og ulike nanopartikler har vært konjugert til CPPs og effektivt internalisert4,5. På grunn av denne transport evnen er de også kjent som protein signaltransduksjon domener (PTDs) og membran translocating sekvenser (MTSs) trojanske peptider. Blant CPPs, TAT peptid fra HIV transactivator protein TAT6 har vært en av de mest studerte 7,8,9. TAT er en nonapeptide som inneholder 6 arginine og 2 lysin rester og derfor er svært kationisk. Substitusjon studier har vist at netto positiv anklagen om TAT er nødvendig for elektrostatisk interaksjon med plasma membraner eukaryote celler og dens påfølgende internalisering10. Tilsvarende til andre CPPs binder positivt ladet TAT sterkt elektrostatisk til ulike negativt ladet arter tilstede på ekstracellulære overflaten av celle membraner, inkludert lipid hodet grupper, glykoproteiner og proteoglycans3 , 10. bioaktive lastene fraktet med TAT bli umiddelbart gratis i stoffer å nå sine intracellulær partnere.

Her presenterer vi en metode som kombinerer TAT CPP med biotin å studere intracellulær interaksjoner. Målet er å designe celle-gjennomtrengende agn kombinerer mål biomolecule TAT og biotin. Den største fordelen med dette forslaget er at samspillet mellom agnet og partnerne vil finne sted innen mobilnettet konteksten. Viser effekten av denne metoden vi brukt som agn en liten sekvens av protein Cx43 som har blitt rapportert å samhandle intracellulært med13c-Src11,12,proto-oncogene. Cx43 er en integrert membran protein som uttrykkes mye astrocyttene og14og er ned-regulert i høyverdig gliomas, den vanligste ondartet svulsten i sentralnervesystemet15,16,17 ,18. Det har vært tidligere vist at regionen Cx43 som samhandler med c-Src (aminosyrer 266-283 i menneskelig Cx43; PubMed: P17302) smeltet til TAT (TAT-Cx43266-283) hemmer kreftfremkallende aktiviteten til c-Srcin glioma celler og glioma stamceller (GSCs)19,20,21. Hvis du vil utforme intracellulær agn, Cx43266-283 har blitt smeltet TAT på N-terminus (TAT-Cx43266-283) og biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283- B). Denne strategien har blitt brukt i rotte glioma C6 celle linje for å identifisere c-Src, c-terminalen Src kinase (CSK) og fosfatase og tensin homolog (PTEN) som intracellulær partnere i dette området av Cx4320. Her beskriver vi denne metoden testing effekt i menneskelige GSCs, som er svært relevant for glioma behandling, men mye vanskeligere å transfect enn ikke-stammen glioma celler.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført ved Universitetet i Salamanca.

1. celler

  1. To dager før du starter prosedyren plate cellene på nødvendige tetthet skal confluent dagen for eksperimentet. Plate cellene i flasker eller plater. Men blir protein utvinning enklere fra platene. Det er praktisk å forberede minst 4 plater av 78 cm2 eller 2 flasker av 150 cm2 per betingelse per forsøk, å sikre at resultatene er konsistente.
  2. I denne studien plate menneskelig G166 GSCs i 4 flasker av 150 cm2, kultivert RHB-en stilk cellen medium med 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF og b-FGF som beskrevet av Pollard et al.22. Prosessen når samløpet ble nådd. For eksempel når 5 x 106 G166 celler var belagt i en 150 cm2 kolbe, ble de behandlet 2 dager etter plating.

2. Biotinylated CPPs

  1. Spin hetteglass med lyofilisert biotinylated CPPs (BCPPs) på 8200 x g for 30 s, for å unngå noen av pulver på lokket. Inkluder en kontroll BCPP å være sikker på at samspillet funnet er bestemt av målet sekvensen. I denne studien var kontrollen BCPP TAT-biotin (TAT-B) og behandling BCPP var TAT-Cx43266-283- B. Andre kontroller kan brukes som TAT smeltet kryptert eller mutert fragmenter bånd til biotin.
  2. Oppløse BCPPs i tilsvarende kultur medium lager løsningen angitt av produsenten; for eksempel, for å få en lagerløsning 2 mg/ml BCPP å behandle GSCs legge til 0,5 mL GSC kultur medium en flaske som inneholder 1 mg av BCPP. Vortex og sikre peptid er godt oppløst.

3. rør

Merk: Forberede minst tolv 1,5 mL rør per betingelse kreves i § 7.

  1. Merke første 3 rørene per betingelse. De vil ha det totale volumet av mobilnettet lysates fikk i trinn 6.4.
  2. Merk en i 3 rør per betingelse. Disse rørene får de første supernatants innhentet etter lysing og spinning i cellular lysates, trinn 7.2.
  3. Merk en B i 3 rør per betingelse. Disse rørene har en liten aliquot av de første supernatants. Disse lysates vil tjene som Western blot prøvene i trinn 7.3.
  4. Merk en C i 3 rør per betingelse. Disse rørene har supernatants fått etter rullegardinmenyen med NeutrAvidin, trinn 7.7.
    Merk: Dette er viktig i tilfelle Western blot viste ikke noe signal på proteiner, betyr proteiner ikke ble trukket ned eller gikk tapt på noen trinn i prosedyren. Dette var situasjonen, gjenta prosessen å trekke ned proteiner.

4. cellular behandling med BCPPs

  1. Sug opp kultur medium.
  2. Erstatt det tilsvarende volumet av frisk medium nødvendig å ruge BCPPs i minste mulige volumet av middels ifølge inkubasjon times. Det er svært viktig at uansett medium dekker helt hele overflaten av platen/kolbe slik at cellene ikke tørr ut, for eksempel 6 mL per 150 cm2 for en 30 min inkubasjon.
  3. Legge til volumet av lager løsning av BCPP i cellekulturer nå konsentrasjonen som har vist seg for å være effektive. I denne studien 50 µM TAT-Cx43266-283har -B vist seg for å redusere GSC spredning.
    1. Derfor legge til 92.8 µL av 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) per mL kultur medium å få en endelig konsentrasjon av 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Hvis volumet som skal legges til for kontroll peptider, komplett med kultur medium til samme siste volum. For eksempel 49.1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) pluss 43.7 µL GSC medium ble lagt per mL kultur medium å få en endelig konsentrasjon av 50 µM TAT-B.
  4. Plasser cellene i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 i 30 min å sørge for at samspillet mellom BCPP og partnerne intracellulær skje. Hvis samhandlingen tar lengre tid, ruge over lengre tid eller justere ganger i tilfelle eksperimentet besto av en tid-kurs. Samspillet av interesse kan i tillegg forfremmet eller ved stimulerende forskjellige intracellulær signalveier.

5. buffere og løsninger.

  1. Forberede PBS pH 7.4: 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4.
  2. Forberede protein lyseringsbuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, før å bruke, legge til følgende: 1/100 (v/v) Protease Inhibitor Cocktail, 1 mM natrium fluor, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) og 0,1 mM natrium orthovanadate.
  3. Forberede Laemmli buffer: (4 x: 0,18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glyserol; 3,7% SDS (p/v), 0.6 M β-mercaptoethanol eller 9 mM DTT; 0,04% (v/v) bromophenol blå (BB)).

6. protein utvinning

Merk: Protein utvinning ble utført som beskrevet tidligere20,23. Utføre denne hele delen av prosedyren på 4 ° C.

  1. Sug opp kultur medium helt.
  2. Vask 3 x 10 mL med iskald fosfat bufret saltvann (PBS) per 150 cm2 nøye for å unngå celle avdeling.
  3. For å få cellen lysate, Legg 3 mL lyseringsbuffer per 150 cm2 og grundig skrape overflaten ved hjelp av en celle skraper. Vippe plate/kolbe til rundt 45 grader gjør enklere å samle celle lysates i sine tilsvarende rør.
  4. Hell 1 mL av mobilnettet lysate per rør i tre 1,5 mL rør. Disse rørene merkes med tilstanden og gjenskape som angitt i trinn 3.1.

7. rullegardin

  1. Sentrifuge 1,5 mL rør 11.000 x g i 10 min på 4 ° C.
  2. Overføring av supernatants til nye rør (A).
  3. Ta en aliquot av denne nedbryting per betingelse til forskjellige rør (B), dvs. 50 µL per rør. Legge til 4 x Laemmli buffer (16,6 µL for 50 µL av lysate) og fryse på 20 ° C. Disse lysates vil tjene som vanlig Western blot prøver.
  4. Homogenize godt NeutrAvidin Agarose av mild risting. Kuttet tips av pipette-tips for å øke deres diameter og forbedre pipettering av perler.
Legge til 50 µL av NeutrAvidin Agarose per mL av celle lysate i (A) rør.
  • Ruge på 4 ° C over natten med svært milde risting for å tillate NeutrAvidin å samhandle med BCPPs bundet til deres intracellulær partnere.
  • Sentrifuge 3000 x g for 1 min på 4 ° C å samle komplekset av NeutrAvidin med proteiner.
  • Nøye fjerne supernatants og overføre dem til ren rør (C). Holde dem å bruke dem i tilfelle rullegardinmenyen ikke er vellykket.
  • Vask trinn: legge til frisk lyseringsbuffer pellets (rør A), resuspend av inversjon og Gjenta trinnene 7.6) og 7,7) for 5 ganger. Alle disse supernatants kan bli forkastet.
  • Fjerne supernatants og legge 2 x Laemmli buffer til ønsket endelige volum (40 µL per 1,5 mL tube for pellets innhentet fra 150 cm2 flasker av confluent celler).
  • Elute ved 100 ° C i 5 min til å distansere samspillet mellom proteiner og sentrifuge for 30 s 8200 x g til pellets NeutrAvidin perler.
  • Ta supernatants, som inneholder dissosiert proteiner, kapillære tips til nye rør (D). Perlene kan holdes i tilfelle gjentatte elueringsrør trinn kreves.
    Merk: Supernatants (rør D) er nå klar til å lastes inn i Western blot eller fryse på 20 ° C.

    • 8. Western Blot

    Merk: Vestlige blotting ble utført som beskrevet tidligere24.

    1. Laste inn tilsvarende volum av hver prøve per kjørefelt på Bis-Tris (4-12%) midigels i en Midi-celle geleelektroforese systemet.
    2. Transblot proteiner med en tørr blotting system i en nitrocellulose vanlige stabel.
    3. Stain membranen med 10% Ponceau i 10 min.
    4. Vask membraner 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    5. Blokkere membraner med 7% melk i TTBS 1t med mild skjelver i rør eller små bokser. Kontroller at volumet brukes er nok til å dekke membraner og at de ikke tørr, dvs 40 mL per hele midi membran.
    6. Vask 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    7. Ruge over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot protein rundt med mild risting.
    8. Vask 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    9. Inkuber membranen ved romtemperatur med korrespondent peroxidase-konjugerte sekundære antistoffer i TTBS 1t.
    10. Vask 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    11. Utvikle med en chemiluminescent underlaget i et chemiluminescence system.

    9. problemløsning

    1. Hvis etter å utvikle Western blot noen av prøvene viste ingen signal for proteiner, sjekk Ponceau.
      Merk: Membranen i Ponceau skal vise udefinert og mange band langs banene lastet. Hvis feltene ikke er veldig merkbar, antall proteiner lastet kanskje ikke være nok eller overføring kan ha blitt feilaktig. Vurdere gjentatte Western blot.
    2. Hvis det er ingen flekker i Ponceau membranen i noen lane, gjenta hele fra trinn 7.4 i (C) rør.
    3. Hvis etter å utvikle Western blot et protein signal er veldig svak, men Ponceau viste proteiner, ruge igjen membranen med primære antistoffer for lengre tid. Hvis signalet fortsatt er temmelig svak, ruge igjen ved romtemperatur.

    10. andre teknikker brukes i denne artikkelen

    1. Immunocytochemistry av BCPPs
      1. Ordne celler i 4% paraformaldehyde (0,2 mL per cm2) for 20 min.
      2. Vask 3 x 5 min med PBS (0,2 mL per cm2).
      3. Bruke tilsvarende antistoffer (minst 0,15 mL per cm2) fortynnet i antistoff løsning på produsentens angitte konsentrasjon mot protein rundt overnatting på 4 ° C.
      4. Inkuber med et fluorophore-konjugerte sekundære antistoff (0,15 mL per cm2) for 2 timer ved romtemperatur.
      5. Gjenta trinn 10.1.2-10.1.4 med andre antistoffer mot din proteiner av interesse. Pass på at du ikke bruker samme art for ulike primære antistoffer eller samme bølgelengde fluorophores for sekundære antistoffer.
      6. Montere cellene med antifade reagensen (0.005 mL per cm2).
      7. Analysere på fluorescens mikroskop koblet til et digitalt kamera.
    2. MTT analysen
      1. Kultur cellene på 37 ° C i 24-og plater.
      2. Inkuber cellene i mørket 75 min med 0,15 mL av kultur medium per cm2 inneholder 0,5 mg/mL MTT.
      3. Sug opp mediet og ruge celler for 10 min i mørket med dimethyl sulfoxide (0,25 mL per cm2) med mild risting.
      4. Måle absorbans ved en bølgelengde på 570 nm likner en microplate.

    Representative Results

    Før du bruker BCPPs for å studere intracellulær interaksjon, er det avgjørende å sammenligne effekten av BCPP vs CPP å validere resultatene med BCPP. Derfor for å studere om inkludering av biotin endrer aktiviteten til målet sekvensen, vi først analysert effekten av TAT-Cx43266-283- B sammenlignet med TAT-Cx43266-283 på G166 GSCs morfologi. Gjør utført vi noen immunofluorescence analyser av to cellen cytoskjelett proteiner, F-utgangen og α-tubulin etter 24 timer for behandling. Figur 1 viser at G166 GSCs i nærvær av 50 µM TAT-Cx43266-283 og TAT-Cx43266-283- B erverve en mer avrundet form sammenlignet de avlange og utvidet mobilnettet forlengelser vises i kontrollene (TAT eller TAT-B). Faktisk figur 1b viser at utgangen filamenter er hovedsakelig samlet som begrepsordbok nettverk når cellene ble behandlet med TAT-Cx43266-283 og TAT-Cx43266-283- B mens de danner mer begrepsordbok bunter i kontroll cellene (behandlet med TAT eller TAT-B)25. Derimot varierer α-tubulin distribusjon ikke mellom de ulike forholdene. Disse resultatene viste at tilstedeværelsen av biotin ikke endret effekten av målet rekkefølgen på morfologi av G166 GSCs. I tidligere studier20,21viste vi at TAT-Cx43266-283 redusert G166 GSCs spredning. I denne studien vi undersøkt om TAT-Cx43266-283- B har samme effekt i veksten som TAT-Cx43266-283. Gjør analyserte vi G166 GSCs spredning av MTT analysen etter 72 h behandling. MTT analysen er en kolorimetrisk analysen for å vurdere celle metabolsk aktivitet. MTT metaboliseres NAD (P) H oxidoreductase enzymer i mitokondrier gjenspeiler antall levedyktig celler. Figur 2 viser at reduksjonen i G166 GSCs celle levedyktighet ikke er vesentlig annerledes når celler ble behandlet med 50 µM TAT-Cx43266-283 eller 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Faktisk redusert både betydelig G166 GSCs spredning i forhold til kontrollen, TAT eller TAT-B.

    Når vi bekreftet at effekten av våre mål rekkefølgen G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) ikke ble endret av inkluderingen av biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283- B), vi undersøkt intracellulær partnere i denne sekvensen følger protokollen beskrevet i denne studien (Figur 3). Fordi caveolae har vært involvert i mekanisme TAT internalisering26, analyserte vi tilstedeværelsen av caveolin-1 (Cav-1) i rullegardinlistene. Western blot analyse (Figur 4) viste at TAT-B og TAT-Cx43266-283- B samhandle med Cav-1. Men muligheten for TAT-Cx43266-283- B rekruttere c-Src, PTEN og CSK er sterkere enn med TAT-B. Fokal vedheft kinase (FAK) er et medium av c-Src som ikke har vist seg å samhandle med Cx43. Faktisk FAK ikke viser betydelig interaksjon med TAT-B eller TAT-Cx43266-283- B.

    Å bekrefte samspillet mellom TAT-Cx43266-283- B og c-Src, G166 GSCs ble inkubert med 50 µM TAT-Cx43266-283- B for 30 min og deres lokalisering ble fulgt med fluorescerende streptavidin av AC confocal mikroskopi (figur 5 ). Resultatene viste at intracellulær fordelingen av TAT-Cx43266-283- B ligger plasma membranen (vist ved fosfatidylserin flekker) og samsvarer med av c-Src. Faktisk co lokalisering analyser avslørt noen punkter av co lokalisering (hvit) mellom TAT-Cx43266-283- B og c-Src i flettingen bildet. Følgelig bekrefter AC confocal mikroskopi studier resultatene med BCPP rullegardin protokollen beskrevet i denne studien.

    Figure 1
    Figur 1: Effekten av BCPP og CPP på GSC morfologi.
    G166 GSCs var belagt på lav tetthet (2 x 104 celler / cm2) og etter 24 h de ble inkubert med 50 µM kontroll CPP (TAT), BCPP (TAT-B), behandling CPP (TAT-Cx43266-283) eller behandling BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-utgangen (rød), α-tubulin (grønn) og flettede + DAPI immunostai-i feltet viser G166 GSCs morfologi. Barer = 50 µm. b) F-utgangen immunostaining viser ulike fordelingen av F-utgangen i G166 GSCs etter inkubasjon 24 h med 50 µM kontrollere CPP (TAT) eller kontrollere BCPP (TAT-B) sammenlignet med 50 µM behandling CPP (TAT-Cx43266-283) eller BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2: Effekten av BCPP og CPP på GSC levedyktighet.
    G166 GSCs var belagt på 5500 celler/cm2 i 24-multiwell plater og inkubert med 50 µM kontroll peptider, CPP (TAT) eller BCPP (TAT-B), eller 50 µM behandling peptider, CPP (TAT-Cx43266-283) eller BCPP (TAT-Cx43266-283- B). Cellen levedyktigheten ble analysert ved hjelp av en MTT-analysen etter 72 h. Resultatene er uttrykt som MTT absorbances og er gjennomsnittlig ± s.e.m. minst 3 eksperimenter (++ p˂0.01 vs kontroll. ** p˂0.01, *** p˂0.001 vs TAT eller TAT-B, enveis ANOVA withTukey etter testing). Merk at det ikke er signifikante forskjeller mellom effekten av CPPs vs BCPPs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3: Protokollen diagrammet.
    Trinnvis grafisk fremstilling av prosedyren som er beskrevet i delen "Protocol", fra inkubasjon i BCPPs til de eluted BCPPs og deres samspill proteiner var obtained.1) ruge kultur celler med BCPPs på ønsket konsentrasjonen for den tiden. 2) under incubation, BCPPs er internalisert og de samhandler med intracellulære partnerne. 3) vask cellene tre ganger på isen med iskald PBS. 4) lyse cellene å ekstra proteiner. 5) overføre celle lysates til rør.6) spinne 11000 x g i 10 min på 4 ° C. 7) overføre supernatants til nye rør (A) og holde en liten aliquot av lysates å behandle som vanlig Western blot prøver rør (B). 8) resuspend NeutrAvidin Agarose perler og legge til 50 µL hver rør en med et kutt pipette tips. 9) ruge med forsiktig risting 12 h på 4 ° C å tillate NeutrAvidin agarose perler å samhandle med BCPPs og deres partnere. 10) spinn for 1 min 3000 x g til pellets perler med biotinylated agn og deres samspill proteiner bundet til dem. 11) overføre supernatants til nye rør (C) og holde dem til bruk i tilfelle rullegardinmenyen må gjentas. 12) vaske pellet fem ganger med frisk lyseringsbuffer, resuspend av inversjon, spinn for 1 min 3000 x g og forkaste nedbryting. 13) fjerne alle nedbryting nøye. 14) Legg det ønskede volumet av 4 x Laemmli buffer og elute proteiner ved 100 ° C i 5 min. 15) Spin 8200 x g for 30 å pellets perler. 16) overføre eluted proteiner som finnes i nedbryting kapillær tips til nye rør (D). 17) laste inn gels for Western blot analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4: Studere intracellulær samhandling TAT-Cx43266-283- B i G166 GSCs av rullegardinmenyen etterfulgt av Western blot.
    G166 GSCs ble inkubert med 50 µM TAT-B eller TAT-Cx43266-283- B. Etter 30 min cellene var lysed og TAT-B eller TAT-Cx43266-283ble -B knyttet til samarbeidspartnerne intracellulær trukket med NeutrAvidin perler. Eluted proteiner ble lastet og analysert ved Western blot å studere nivåer av FAK, c-Src, CSK, PTEN og Cav-1. Note det Cav-1 samhandler med både TAT-B og TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN og CSK samhandle fortrinnsvis med TAT-Cx43266-283- B og FAK viste ikke interaksjon med TAT-B eller TAT-Cx43266-283-B. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5: Bekreftelse av TAT-Cx43266-283- B intracellulær interaksjoner i G166 GSCs av AC confocal mikroskopi.
    G166 GSCs ble inkubert med 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Etter 30 min, celler var fast og behandlet for å lokalisere TAT-Cx43266-283- B med Cy2-Streptavidin (grønn), c-Src immunofluorescence (rød) og fosfatidylserin med annexin V (blå). Vær oppmerksom på noen punkter av co lokalisering (hvit) mellom TAT-Cx43266-283- B og c-Src nær plasma membranen i flettingen bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    Det er mange metoder å studere protein-protein interaksjoner. Metoden presentert i denne studien er basert på brukte biotin-avidin rullegardinmenyen system der en biotinylated agn er ruges med cellen lysates tillate etableringen av samhandlinger. Endring i denne studien omfatter kombinasjonen av denne teknikken med celle-gjennomtrengende sekvenser. Vi foreslår å designe celle-gjennomtrengende agn som kan være inkubert med levende celler i stedet for cellen lysates og derfor samhandlingene funnet gjenspeiler de som skjedde i mobilnettet konteksten.

    Her bruker vi TAT som cellen-gjennomtrengende sekvens, biotin rullegardin koden og regionen Cx43 består mellom aminosyrer 266-283 som mål å finne intracellulær interaksjoner i human GSCs. Strukturelle grunnlaget for samspillet mellom Cx43 og c-Src er kjente11,12. Dette er en viktig samhandling fordi den hemmer kreftfremkallende aktiviteten til c-Src i glioma celler24,13. Faktisk etterligne CPPs som inneholder denne regionen (TAT-Cx43266-283) antioncogenic egenskapene til Cx43 på glioma celler19,20,21. I rotte glioma C6 celler inkluderer mekanismen som hemmer TAT-Cx43266-283 c-Src rekruttering av c-Src med den endogene hemmere CSK og PTEN20. Det bør nevnes at GSCs er svært interessant som et mål i glioma terapi, fordi de utgjør en subpopulasjon som er motstandsdyktig mot konvensjonelle behandlinger og derfor ansvarlig for gjentakelse av denne ondartet hjernen svulster27. Videre, de er vanskelig å transfect celler og derfor studiet av intracellulær interaksjoner blir vanskeligere. CPPs er raskt og effektivt internalisert i GSCs19 favoriserer deres bruk for studiet av intracellulær interaksjoner. I denne studien, bruker CPPs smeltet til biotin bekrefter vi samspillet av Cx43266-283 sekvensen med c-Src sammen med sin endogene hemmere CSK og PTEN i menneskelig GSCs.

    Denne metoden er veldig kraftig å studere intracellulær mekanismen av bioaktive forbindelser. Imidlertid er det svært viktig å bekrefte at den biologiske effekten av biotinylated celle gjennomtrengende agn ikke er forskjellig fra med ikke-biotinylated en. Dette trinnet er nødvendig for å knytte samhandlingene med effekten av bioaktive sammensatte. Stabiliteten av sammensatt, dens mulig nedbrytning av proteaser samt dens mulige toksisitet, bør i tillegg testes nøye og tatt i betraktning før du planlegger eksperimentet. I eksemplet presentert har anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283 på G166 menneskelige GSCs vært tidligere dokumenterte20. I denne studien vi bekrefte at anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283- B og TAT-Cx43266-283 er svært like. I tillegg analyse av mobilnettet morfologi avslørt at α-tubulin og F-utgangen distribusjon er svært like i G166 GSCs behandlet med TAT-Cx43266-283- B eller med TAT-Cx43266-283. Til sammen indikerer disse resultatene at inkludering av biotin på c-terminus av TAT-Cx43266-283 ikke endret effekten av dette sammensatte på menneskelige GSCs. Men hvis biotin ville endre effekten av bioaktive molekylet, kan andre koder for protein rensing testes, som det FLAGGET octapeptide (DYKDDDDK)28, menneskelig influensa hemagglutinin-avledet koden HA (YPYDVPDYA) eller glutation S-transferase (GST)29. Tilsvarende hvis TAT ikke mot befolkningen celle rundt, andre celle gjennomtrengende sekvenser, slik som penetratin, MPG (for en vurdering, se30) eller cellen bestemt sekvenser kan brukte31.

    I tillegg til studien proteiner som spesielt samhandler med målet sekvensen, ideelt bør proteiner som samhandler med både kontrollen og målet sekvens og proteiner som ikke samarbeide med dem, som positive og negative kontroller, være adressert. I denne forstand, vi fant Cav-1 i kontrollen og behandlet situasjonen antyder at caveolae har vært involvert i mekanisme internalisering, som det har vært tidligere vist26. Videre FAK, som samhandler med c-Src, men skal ikke samhandle med Cx43 c-terminalen var fraværende i både kontroll og behandlet situasjonen. Disse resultatene forsterke spesifisiteten av samspillet mellom TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK og PTEN. For å bekrefte resultatene med denne protokollen, kan AC confocal mikroskopi brukes å visualisere fordelingen av samspill proteiner og studere deres co lokalisering. Derfor fant vi at TAT-Cx43266-283- B og c-Src utstillingen en lignende intracellulær distribusjon med punkter av co lokalisering bekrefte resultatene oppnådd med rullegardin eksperimenter. Faktisk, TAT-Cx43266-283- B distribueres nær plasma membranen antyder at Last, i denne studien Cx43266-283, leder molekylet til partnerne intracellulær.

    En av begrensningene i den foreslåtte metoden er at molekylet brukt som agn kan mislykkes å kaste riktig og forventede effekter ikke ville ble funnet. I denne situasjonen kan samhandlingene funnet ikke knyttes til effekten. Men kan denne metoden være spesielt interessant for samhandlingene involvert i signaltransduksjon trasé fordi de er vanligvis utført av egentlig uordnede regioner32 og derfor de ikke krever en bestilte folding. I tillegg er en av fordelene med den foreslåtte metoden at time course of samspillet kan følges, som er spesielt relevant for forbigående interaksjoner. Videre kan relevansen av hver rester på samspillet lett studeres. Det er faktisk mulig å studere relevansen av posttranslational modifikasjoner på protein-protein interaksjon, for eksempel ved phosphomimetic substitusjon av glutamat serine eller threonin. Tilsvarende kan substitusjon av serine eller threonin for alanin eller tyrosin for fenylalanin teste effekten av ikke-phosphorylatable serine, threonin eller tyrosin.Den mest nøyaktige måten er for å etterligne phospho-tyrosin, substitusjon av Tyr for p-Tyr33.

    Til slutt, omfanget av denne protokollen er langt utover protein-protein samhandling fordi dette systemet kan brukes på andre bioaktive laster som RNA sekvenser, nanopartikler, virus eller andre molekyler som kan del biotin og transduced med CPP å studere deres intracellulær virkningsmekanismen.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Vi takker M. Morales og J. Bravo for deres hjelp med utforming av CPPs og JC Arévalo for hans hjelp med rullegardin-protokollen. Vi er takknemlige for teknisk assistanse av T. del Rey. Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economía y Competitividad, Spania. FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spania. Ble tildelt und SA026U16 og Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez og A. González-Sánchez er mottakere av et fellesskap fra Junta de Castilla y León og European Social Fund.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

    Tags

    Biokjemi problemet 130 TAT Biotin-avidin celle-gjennomtrengende peptider rullegardinmenyen Intracellular interaksjoner Western blot Protein-protein interaksjoner
    Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Jaraíz-Rodríguez, M.,… More

    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter