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Biochemistry

Biotinylated सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स Intracellular प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

यह एक के लिए intracellular प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के आधार पर अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है बायोटिन-avidin pull-डाउन प्रणाली के संयोजन की नवीनता के साथ सेल-मर्मज्ञ अनुक्रम । मुख्य लाभ यह है कि लक्ष्य अनुक्रम सेल lysates के बजाय जीवित कोशिकाओं के साथ मशीन है और इसलिए बातचीत सेलुलर संदर्भ के भीतर हो जाएगा है ।

Abstract

यहाँ हम intracellular प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो व्यापक रूप से प्रयुक्त बायोटिन-avidin पुल-डाउन प्रणाली पर आधारित होता है. प्रस्तुत संशोधन में सेल-मर्मज्ञ दृश्यों के साथ इस तकनीक का संयोजन भी शामिल है । हम डिजाइन करने के लिए सेल-मर्मज्ञ चारा है कि कोशिकाओं के बजाय सेल lysates और इसलिए पाया बातचीत उन है कि intracellular संदर्भ के भीतर घटित प्रतिबिंबित करेंगे के साथ किया जा सकता है । Connexin43 (Cx43), एक प्रोटीन है कि अंतर जंक्शन चैनलों और hemichannels रूपों नीचे उच्च ग्रेड ग्लियोमास में विनियमित है । एमिनो एसिड 266-283 शामिल Cx43 क्षेत्र सी के oncogenic गतिविधि के निषेध के लिए जिंमेदार है तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में Src । यहां हम सेल मर्मज्ञ अनुक्रम के रूप में उपयोग जैसे, बायोटिन के रूप में पुल-टैग नीचे और Cx43 के क्षेत्र में एमिनो एसिड 266-283 लक्ष्य के रूप में शामिल करने के लिए कड़ी मेहनत-transfect मानव तंत्रिकाबंधार्बुद स्टेम सेल में intracellular बातचीत मिल के रूप में । प्रस्तावित विधि की सीमाओं में से एक यह है कि चारा के रूप में इस्तेमाल अणु को ठीक से गुना असफल हो सकता है और, नतीजतन, पाया बातचीत प्रभाव के साथ संबद्ध नहीं किया जा सकता है । हालांकि, इस विधि के संकेत transduction रास्ते में शामिल बातचीत के लिए विशेष रूप से दिलचस्प हो सकता है क्योंकि वे आम तौर पर आंतरिक रूप से परिक्रमा क्षेत्रों से बाहर किया जाता है और, इसलिए, वे एक का आदेश दिया तह की आवश्यकता नहीं है । इसके अतिरिक्त, प्रस्तावित पद्धति के फायदों में से एक यह है कि बातचीत पर प्रत्येक अवशेष की प्रासंगिकता का आसानी से अध्ययन किया जा सकता है. यह एक मॉड्यूलर प्रणाली है; इसलिए, अंय सेल-मर्मज्ञ अनुक्रम, अंय टैग, और अंय intracellular लक्ष्यों को नियोजित किया जा सकता है । अंत में, इस प्रोटोकॉल का दायरा अभी तक प्रोटीन से परे है प्रोटीन संपर्क क्योंकि इस प्रणाली को आरएनए अनुक्रम, नैनोकणों, वायरस या किसी भी अणु कि सेल-मर्मज्ञ दृश्यों के साथ transduced जा सकता है के रूप में अंय गैर सक्रिय कार्गो के लिए लागू किया जा सकता है और टैग नीचे खींचने के लिए जुड़े हुए कार्रवाई के अपने intracellular तंत्र का अध्ययन ।

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत सेलुलर प्रक्रियाओं की एक महान विविधता के लिए आवश्यक हैं । पूरी तरह से इन प्रक्रियाओं को समझने के लिए, जटिल intracellular वातावरण के भीतर प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए तरीकों की आवश्यकता है । एक प्रोटीन के संपर्क भागीदारों की पहचान करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है कि प्रोटीन या संबंध में चारा के रूप में प्रोटीन का एक हिस्सा के एक करनेवाला पेप्टाइड का उपयोग करने के लिए बाइंडिंग प्रोटीन का पता लगाने के बाद प्रयोगों नीचे । avidin-बायोटिन प्रणाली अक्सर avidin और बायोटिन1,2के बीच उच्च अपनत्व, विशिष्टता और स्थिर संपर्क के कारण किया जाता है । आमतौर पर, बायोटिन covalently चारा (प्रोटीन या पेप्टाइड) के लिए बाध्य है और सेल lysates के साथ मशीन की अवधि के बाद बातचीत की स्थापना की अनुमति देने के लिए, biotinylated अपने intracellular भागीदारों के लिए बाध्य चारा नीचे avidin या avidin के साथ खींचा है समर्थन मोतियों के साथ डेरिवेटिव संयुग्मित । फिर, चारा-प्रोटीन बातचीत धोने, रेफरेंस के बाद पता चला रहे हैं, और पश्चिमी ब्लाट द्वारा पीछा denaturing ट्रो द्वारा विश्लेषण । इस तकनीक की समस्याओं में से एक यह है कि ब्याज और उसके intracellular भागीदारों के प्रोटीन के बीच बातचीत सेलुलर संदर्भ के बाहर जगह ले जा रहे हैं । यह संकेत transduction रास्ते में शामिल बातचीत के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि वे विशिष्ट intracellular स्थानों में जगह ले, वे क्षणिक है और वे आम तौर पर नहीं प्रचुर मात्रा में प्रोटीन द्वारा किए जाते हैं । इसलिए, सेल lysates के भीतर इन बातचीत अंय अधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन या प्रोटीन है कि आमतौर पर करीब निकटता में नहीं है द्वारा नकाबपोश किया जा सकता है ।

सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (CPPs) छोटे पेप्टाइड्स (≤ ४० अमीनो एसिड), cationic अमीनो एसिड है कि लगभग किसी भी सेल में अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के परिवहन में सक्षम हैं द्वारा ज्यादातर बना रहे हैं3. प्रोटीन, प्लाज्मिड डीएनए, सिरना, वायरस, इमेजिंग एजेंटों, और विभिंन नैनोकणों के रूप में कार्गो CPPs के लिए संयुग्मित किया गया है और कुशलतापूर्वक4,5आंतरिक । इस परिवहन क्षमता के कारण वे भी प्रोटीन transduction डोमेन (PTDs), झिल्ली translocating अनुक्रम (MTSs), और ट्रोजन पेप्टाइड्स के रूप में जाना जाता है । CPPs के अलावा, जैसे एचआईवी transactivator प्रोटीन से जैसे पेप्टाइड6 सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है में से एक है 7,8,9. जैसे एक nonapeptide है जिसमें 6 arginine और 2 lysine अवशेष होते हैं और फलस्वरूप अत्यधिक cationic होता है । प्रतिस्थापन के अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि जैसे की शुद्ध सकारात्मक प्रभारी युकेरियोटिक कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली और उसके बाद के internalization10के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के लिए आवश्यक है । इसी तरह अन्य CPPs के लिए, सकारात्मक चार्ज जैसे दृढ़ता से विभिन्न नकारात्मक आरोप कोशिका झिल्ली के extracellular सतह पर मौजूद प्रजातियों के लिए electrostatically बांध, लिपिड सिर समूहों सहित, नच और proteoglycans3 , 10. cytosol में तुरंत मुक्त हो जाने के लिए अपने intracellular भागीदारों तक पहुंचने के लिए, जैसे सक्रिय कार्गो ।

यहाँ हम एक तरीका है कि intracellular बातचीत का अध्ययन करने के लिए बायोटिन के साथ गूंथना CPP को जोड़ती वर्तमान. उद्देश्य करने के लिए और बायोटिन करने के लिए लक्ष्य के लिए अणु से इनकार करके सेल मर्मज्ञ चारा डिजाइन करने के लिए है । इस प्रस्ताव का मुख्य लाभ यह है कि चारा और उसके भागीदारों के बीच बातचीत अपने सेलुलर संदर्भ के भीतर जगह ले जाएगा । इस विधि की प्रभावकारिता दिखाने के लिए हम चारा के रूप में इस्तेमाल किया प्रोटीन Cx43 के एक छोटे अनुक्रम है कि आद्य oncogene सी के साथ intracellularly बातचीत करने के लिए सूचित किया गया है-Src11,12,13। Cx43 एक अभिंन झिल्ली प्रोटीन है कि व्यापक रूप से14astrocytes में व्यक्त की है और नीचे है उच्च ग्रेड ग्लियोमास में विनियमित, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सबसे आम घातक ट्यूमर15,16,17 ,18. यह पहले से दिखाया गया है कि Cx43 क्षेत्र है कि सी के साथ बातचीत-Src (मानव Cx43 में एमिनो एसिड 266-283; Pubmed: P17302) जैसे (जैसे-Cx43266-283) से जुड़े सी-Srcin तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं और तंत्रिकाबंधार्बुद स्टेम सेल (GSCs)19,20,21के oncogenic गतिविधि रोकता है । intracellular चारा डिजाइन करने के लिए, Cx43266-283 एन-टर्मिनस (जैसे-Cx43266-283) और सी पर बायोटिन के लिए-टर्मिनस (जैसे-Cx43266-283-बी) में करने के लिए जुड़े हुए है । इस रणनीति का सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है चूहे तंत्रिकाबंधार्बुद सी 6 सेल लाइन में सी-Src, सी-टर्मिनल Src कळेनासे (सीएसके) और फॉस्फेट और tensin homolog (PTEN) intracellular के इस क्षेत्र के Cx43 भागीदारों के रूप में पहचान करने के लिए20। यहां, हम इस विधि का वर्णन मानव GSCs में अपनी प्रभावकारिता का परीक्षण, जो बहुत तंत्रिकाबंधार्बुद चिकित्सा के लिए प्रासंगिक हैं, लेकिन बहुत मुश्किल से transfect के लिए गैर स्टेम तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं ।

Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रिया Salamanca विश्वविद्यालय में किए गए ।

1. कोशिकाओं

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले दो दिन, आवश्यक घनत्व पर कोशिकाओं थाली प्रयोग के दिन धाराप्रवाह होना करने के लिए । कोशिकाओं की कुप्पी या प्लेटों में प्लेटें. हालांकि, प्रोटीन निकासी प्लेटों से आसान हो जाएगा । यह प्रयोग प्रति शर्त के लिए १५० सेमी2 की ७८ सेमी2 या 2 कुप्पी के कम से कम 4 प्लेटें तैयार करने के लिए सुविधाजनक है, सुनिश्चित करें कि परिणाम के अनुरूप हैं ।
  2. इस अध्ययन में, प्लेट मानव G166 GSCs की 4 कुप्पी में १५० cm2, RHB में कल्चर्ड-एक स्टेम सेल मीडियम 2% B27, 1% N2, 20 एनजी/एमएल EGF और बी-FGF के साथ पूरक के रूप में पोलार्ड एट अल.22द्वारा वर्णित । बारात जब संगम पर पहुँची थी. उदाहरण के लिए, जब 5 x 106 G166 कोशिकाओं को एक १५० सेमी2 कुप्पी में चढ़ाया गया था, वे चढ़ाना के बाद 2 दिन संसाधित किया गया ।

2. Biotinylated CPPs

  1. 30 एस के लिए ८२०० एक्स जी में lyophilized biotinylated CPPs (BCPPs) युक्त शीशियों, ढक्कन पर शेष पाउडर के कुछ से बचने के लिए । यह सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण BCPP शामिल करें कि प्राप्त इंटरैक्शन लक्ष्य अनुक्रम के विशिष्ट हैं. इस अध्ययन में, नियंत्रण BCPP था जैसे-बायोटिन (जैसे-बी) और उपचार BCPP था जैसे-Cx43266-283-b । अंय नियंत्रणों ऐसे जैसे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है तले या बायोटिन के लिए टुकड़े बांड रूपांतरित हुआ ।
  2. निर्माता द्वारा दर्शाई गई स्टॉक समाधान के लिए इसी संस्कृति माध्यम में BCPPs को भंग करना; उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम/एमएल BCPP के एक शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए GSCs के इलाज के लिए GSC संस्कृति माध्यम के ०.५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए 1 BCPP की मिलीग्राम युक्त एक शीशी । भंवर और यकीन है कि पेप्टाइड अच्छी तरह से भंग कर रहा है बनाते हैं ।

3. ट्यूबों

नोट: धारा 7 में आवश्यक शर्त के अनुसार कम से कम बारह १.५ मिलीलीटर ट्यूबों तैयार करें ।

  1. शर्त के अनुसार पहले 3 ट्यूबों मार्क । वे ६.४ चरण में प्राप्त सेलुलर lysates की कुल मात्रा होगा ।
  2. मार्क एक शर्त प्रति 3 ट्यूबों में । इन ट्यूबों lysing के बाद प्राप्त पहली supernatants होगा और सेलुलर lysates, ७.२ कदम कताई ।
  3. शर्त प्रति 3 ट्यूबों में एक बी मार्क । इन ट्यूबों में पहले supernatants का छोटा aliquot होगा । ये lysates चरण ७.३ में पश्चिमी ब्लाट नमूनों के रूप में काम करेगा ।
  4. शर्त प्रति 3 ट्यूबों में एक सी मार्क । इन ट्यूबों supernatants NeutrAvidin, कदम ७.७ के साथ नीचे पुल के बाद प्राप्त होगा ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है मामले में पश्चिमी ब्लाट प्रोटीन के लिए कोई संकेत नहीं दिखाया, प्रोटीन का अर्थ नीचे खींच नहीं थे या प्रक्रिया के कुछ कदम पर खो गए थे । यदि इस स्थिति थे, इस प्रक्रिया को दोहराने के लिए नीचे प्रोटीन खींच ।

4. BCPPs के साथ सेलुलर उपचार

  1. संस्कृति माध्यम महाप्राण ।
  2. ताजा मध्यम के छोटे से संभव मात्रा में BCPPs मशीन समय के अनुसार गर्मी के लिए आवश्यक माध्यम की इसी मात्रा बदलें । यह बहुत महत्वपूर्ण है कि किसी भी मामले में, मध्यम पूरी तरह से प्लेट की पूरी सतह/इतनी है कि कोशिकाओं को शुष्क नहीं है, उदाहरण के लिए, एक 30 मिनट की मशीन के लिए १५० सेमी2 प्रति 6 मिलीलीटर ।
  3. सेल संस्कृतियों के लिए BCPP के शेयर समाधान की मात्रा में जोड़ें एकाग्रता है कि प्रभावी साबित किया गया है तक पहुंचने के लिए । इस अध्ययन में ५० µ मीटर ताट-Cx43266-283-बी को कम GSC प्रसार सिद्ध किया गया है.
    1. इसलिए, जोड़ें ९२.८ µ एल के 2 मिलीग्राम/एमएल जैसे-Cx43266-283-b (मेगावाट = 3723.34 g/) प्रति मिलीलीटर संस्कृति माध्यम की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ५० µ m ताट-Cx43266-283-b. जोड़ा जा करने के लिए वॉल्यूम नियंत्रण पेप्टाइड्स, एक ही अंतिम वॉल्यूम के लिए संस्कृति माध्यम के साथ पूरा करने के लिए भिन्न है । उदाहरण के लिए, ४९.१ µ l ताट-बी (मेगावाट = 1914.31 g/मोल) से अधिक ४३.७ µ l GSC माध्यम संस्कृति माध्यम के प्रति मिलीलीटर जोड़ा गया ५० µ एम जैसे की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त बी ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर मशीन में कोशिकाओं के लिए 30 मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि BCPP और उसके intracellular भागीदारों के बीच बातचीत जगह ले लो । यदि बातचीत अब लेता है, अब समय के लिए गर्मी या समय समायोजित करने के मामले में प्रयोग एक बार पाठ्यक्रम के शामिल थे । इसके अलावा, ब्याज की बातचीत को बढ़ावा दिया जा सकता है या अलग intracellular संकेत मार्ग उत्तेजक द्वारा रोका ।

5. बफ़र्स और समाधान ।

  1. तैयार करें पंजाब पीएच ७.४:१३६ mM NaCl; २.७ मिमी KCl; ७.८ मि ना2HPO4· 2H2हे; १.७ मिमी KH2पीओ4.
  2. प्रोटीन lysis बफर तैयार करें: 20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.०), १३७ मिमी NaCl, 1% IGEPAL, उपयोग करने से पहले, निम्न जोड़ें: 1/100 (v/v) चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल, 1 मिमी सोडियम फ्लोराइड, 1 मिमी Phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF) और ०.१ मिमी सोडियम orthovanadate.
  3. Laemmli बफ़र तैयार करें: (4x: ०.१८ m Tris-HCl pH ६.८; 5 एम ग्लिसरॉल; ३.७% एसडीएस (p/v); ०.६ m β-mercaptoethanol या 9 mM डीटीटी; ०.०४% (v/v) bromophenol नीला (BB)).

6. प्रोटीन निष्कर्षण

नोट: प्रोटीन निष्कर्षण पहले वर्णित के रूप में किया गया था20,23। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्रिया के इस पूरे खंड बाहर ले ।

  1. कल्चरल मीडियम को पूरी तरह से महाप्राण ।
  2. धो 3 एक्स 10 मिलीलीटर बर्फ के साथ ठंडा फॉस्फेट खारा (पंजाब) प्रति १५० cm2 बहुत ध्यान से सेल टुकड़ी से बचने के लिए ।
  3. सेल lysate प्राप्त करने के लिए, १५० cm2 प्रति lysis बफ़र के 3 मिलीलीटर जोड़ें और एक सेल खुरचने का उपयोग करके सतह को अच्छी तरह से नोच लें । प्लेट झुकने के बारे में ४५ डिग्री करने के लिए आसान बनाने के लिए उनके इसी ट्यूबों में सेल lysates इकट्ठा करेंगे ।
  4. तीन १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में ट्यूब प्रति सेलुलर lysate की 1 मिलीलीटर डालो । इन ट्यूबों शर्त और चरण ३.१ में इंगित के रूप में प्रतिकृति के साथ चिह्नित किया जाएगा ।

7. पुल-डाउन

  1. १.५ एमएल ट्यूबों में ११,००० x जी के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
  2. supernatants को नए ट्यूबों (A) में स्थानांतरित करें ।
  3. अलग ट्यूबों के लिए शर्त प्रति इस supernatant के एक aliquot ले लो (ख), यानी ५० µ एल ट्यूब प्रति । 4x Laemmli बफर जोड़ें (lysate के ५० µ एल के लिए १६.६ µ एल) और पर फ्रीज-20 ° c । ये lysates सामांय पश्चिमी दाग नमूनों के रूप में काम करेंगे ।
  4. Homogenize बहुत अच्छी तरह से कोमल मिलाते हुए NeutrAvidin Agarose. उनके व्यास को बढाने और मोतियों की pipetting में सुधार के पिपेट सुझावों के नुस्खे को काट लीजिये.
(क) ट्यूबों में सेल lysate की NeutrAvidin Agarose प्रति एमएल के ५० µ एल जोड़ें ।
  • बहुत कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी NeutrAvidin BCPPs उनके intracellular भागीदारों के लिए बाध्य के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देने के लिए ।
  • 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक प्रोटीन के साथ NeutrAvidin के परिसर में इकट्ठा ।
  • ध्यान से supernatants निकालें और उंहें साफ ट्यूबों (सी) के लिए स्थानांतरण । उंहें रखने के मामले में पुल के नीचे सफल नहीं है उंहें इस्तेमाल करते हैं ।
  • धुलाई कदम: छर्रों के लिए ताजा lysis बफर जोड़ें (ट्यूबों एक), उलटा द्वारा reसस्पेंड और ७.६ कदम दोहराने) और ७.७) 5 अधिक बार के लिए । इन सभी supernatants को छोड दिया जा सकता है ।
  • supernatants निकालें और वांछित अंतिम मात्रा (४० µ एल प्रति १.५ एमएल ट्यूब के लिए 2x Laemmli बफर जोड़ें १५० सेमी2 से प्राप्त छर्रों के लिए-धाराप्रवाह कोशिकाओं की कुप्पी) ।
  • 5 मिनट के लिए १०० ° c पर Elute प्रोटीन के बीच बातचीत अलग करने के लिए और 30 एस के लिए ८,२०० x g पर गोली NeutrAvidin मोतियों के लिए ।
  • supernatants ले लो, असंबद्ध प्रोटीन युक्त, केशिका युक्तियां के साथ नई ट्यूबों (डी) के लिए । मोतियों को मामले में दोहराते हुए रखा जा सकता है रेफरेंस स्टेप्स की आवश्यकता है ।
    नोट: supernatants (ट्यूब्स डी) अब पश्चिमी दाग में लोड किया जा करने के लिए या-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करने के लिए तैयार हैं ।

    • 8. वेस्टर्न ब्लाटर

    नोट: पश्चिमी सोख्ता पहले वर्णित के रूप में किया गया था24।

    1. बीआईएस पर प्रति लेन प्रत्येक नमूने के बराबर मात्रा लोड-Tris (4-12%) एक Midi-सेल ट्रो प्रणाली में midigels.
    2. Transblot प्रोटीन एक nitrocellulose नियमित स्टैक में एक सूखी सोख्ता प्रणाली का उपयोग कर ।
    3. 10 मिनट के लिए 10% Ponceau के साथ झिल्ली दाग ।
    4. TTBS के 5 मिलीलीटर के साथ झिल्ली 3 x 5 मिनट धो लें ।
    5. TTBS में 7% दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक 1 एच के लिए ट्यूबों या छोटे बक्से में कोमल मिलाते के साथ । सुनिश्चित करें कि उपयोग की मात्रा झिल्ली को कवर करने के लिए पर्याप्त है और है कि वे सूखी नहीं है, यानी पूरे मिडी झिल्ली प्रति ४० मिलीलीटर.
    6. TTBS के 5 मिलीलीटर के साथ 3 एक्स 5 मिनट धो लें ।
    7. कोमल झटकों के साथ ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    8. TTBS के 5 मिलीलीटर के साथ 3 एक्स 5 मिनट धो लें ।
    9. 1 एच के लिए TTBS में संवाददाता peroxidase-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर झिल्ली की मशीन ।
    10. TTBS के 5 मिलीलीटर के साथ 3 एक्स 5 मिनट धो लें ।
    11. एक chemiluminescence प्रणाली में एक chemiluminescent सब्सट्रेट के साथ विकसित करना ।

    9. समस्या का समाधान

    1. अगर पश्चिमी दाग किसी भी नमूने के विकास के बाद सभी प्रोटीन के लिए कोई संकेत नहीं दिखाया, Ponceau की जांच करें ।
      नोट: Ponceau में झिल्ली भरी गलियों के साथ अपरिभाषित और कई बैंड दिखाना चाहिए । यदि बैंड बहुत ध्यान देने योग्य नहीं हैं, लोड प्रोटीन की मात्रा पर्याप्त नहीं हो सकता है या स्थानांतरण गलत तरीके से चला गया हो सकता है । पश्चिमी दाग को दोहराने पर विचार करें ।
    2. अगर किसी भी लेन में Ponceau झिल्ली में सब पर कोई दाग है, (सी) ट्यूबों में कदम ७.४ से पूरी प्रक्रिया को दोहराने ।
    3. अगर पश्चिमी दाग एक प्रोटीन संकेत के विकास के बाद बहुत कमजोर है, लेकिन Ponceau प्रोटीन दिखाया, फिर से लंबे समय के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली गर्मी । यदि संकेत अभी भी नहीं बल्कि कमजोर है, कमरे के तापमान पर फिर से गर्मी ।

    10. अंय तकनीकों इस अनुच्छेद में इस्तेमाल किया

    1. Immunocytochemistry ऑफ BCPPs
      1. 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक करें (०.२ एमएल प्रति cm2) के लिए 20 मिनट ।
      2. पंजाब के साथ 3x 5 मिनट धो लें (प्रति cm2०.२ मिलीलीटर) ।
      3. लागू करने के लिए इसी एंटीबॉडी (कम-से ०.१५ मिलीलीटर प्रति सेमी2) एंटीबॉडी समाधान में पतला है अपने प्रोटीन के खिलाफ अपने ब्याज पर रात भर में 4 ° c ।
      4. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (सेमी प्रति ०.१५ मिलीलीटर) के साथ मशीन ।
      5. दोहराएँ कदम 10.1.2-10.1.4 ब्याज की अपने प्रोटीन के खिलाफ अन्य एंटीबॉडी के साथ. माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए अलग प्राथमिक एंटीबॉडी या एक ही तरंग दैर्ध्य fluorophores के लिए एक ही प्रजाति का उपयोग करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
      6. माउंट antifade एजेंट (सेमी2प्रति ०.००५ मिलीलीटर) का उपयोग कर कोशिकाओं ।
      7. एक प्रतिदीप्ति एक डिजिटल कैमरे से जुड़े माइक्रोस्कोप पर विश्लेषण ।
    2. MTT परख
      1. संस्कृति 24-अच्छी तरह से प्लेटों में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं ।
      2. ७५ के लिए अंधेरे में कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम के ०.१५ मिलीलीटर के साथ मिनट की मशीन प्रति सेमी2 जिसमें ०.५ मिलीग्राम/एमएल MTT ।
      3. मध्यम और हल्के झटकों के साथ dimethyl sulfoxide (सेमी प्रति ०.२५ मिलीलीटर) के साथ अंधेरे में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन महाप्राण ।
      4. एक microplate पाठक का उपयोग ५७० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य में अवशोषक उपाय ।

    Representative Results

    intracellular बातचीत का अध्ययन करने के लिए BCPPs का उपयोग करने से पहले, यह BCPP के साथ प्राप्त परिणामों को मान्य करने के लिए BCPP बनाम CPP के प्रभाव की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके फलस्वरूप, अध्ययन करने के लिए कि बायोटिन का समावेश लक्ष्य अनुक्रम की गतिविधि को संशोधित करता है, हम पहले जैसे के प्रभाव का विश्लेषण किया-Cx43266-283-बी के साथ तुलना-Cx43266-283 पर G166 GSCs आकृति विज्ञान. ऐसा करने के लिए हमने उपचार के २४ ज के बाद दो cytoskeletal प्रोटीन, एफ-actin और α-tubulin के कुछ इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषणों का प्रदर्शन किया. चित्रा 1 से पता चलता है कि G166 GSCs की उपस्थिति में ५० µ m ताट-Cx43266-283 या जैसे-Cx43266-283-बी एक और अधिक गोल आकार प्राप्त करने के लिए लंबी और विस्तारित सेलुलर लंबे समय तक नियंत्रण में दिखाया गया (जैसे या जैसे-ख). वास्तव में, चित्र 1b से पता चलता है कि actin रेशा ज्यादातर actin नेटवर्क के रूप में इकट्ठे होते हैं, जब कोशिकाओं जैसे-Cx43266-283 या जैसे-Cx43266-283-बी के साथ इलाज किया गया, जबकि वे नियंत्रण कोशिकाओं में अधिक actin बंडलों फार्म (जैसे के साथ इलाज या ताट-ब)२५. इसके विपरीत, α-tubulin वितरण भिन्न स्थितियों के बीच भिन्न नहीं है । इन परिणामों से पता चला कि बायोटिन की उपस्थिति G166 GSCs की आकृति विज्ञान पर लक्ष्य अनुक्रम के प्रभाव को संशोधित नहीं किया । पिछले अध्ययन में20,21, हमें पता चला कि जैसे-Cx43266-283 कम G166 GSCs प्रसार । इस अध्ययन में, हम की जांच की है कि जैसे-Cx43266-283-B-Cx43266-283जैसे जैसे विकास में एक ही प्रभाव डालती है । ऐसा करने के लिए, हम उपचार के ७२ ज के बाद MTT परख द्वारा G166 GSCs प्रसार का विश्लेषण किया । MTT परख कोशिका चयापचय गतिविधि का आकलन करने के लिए एक वर्णमिति परख है । MTT णड (पी) एच oxidoreductase एंजाइमों mitochondria में मौजूद व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को दर्शाती द्वारा metabolized है । चित्रा 2 से पता चलता है कि G166 GSCs कोशिका व्यवहार्यता में कमी काफी अलग नहीं है जब कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया ५० µ m ताट-Cx43266-283 या ५० µ m ताट-Cx43266-283-बी. दरअसल, दोनों काफी कम G166 GSCs प्रसार के रूप में नियंत्रण की तुलना में, जैसे या जैसे-बी ।

    एक बार जब हम पुष्टि की कि G166 GSCs में हमारे लक्ष्य अनुक्रम के प्रभाव (जैसे-Cx43266-283) सी पर बायोटिन के शामिल किए जाने से संशोधित नहीं किया गया था-टर्मिनस (जैसे-Cx43266-283-B), हम इस अनुक्रम के intracellular भागीदारों की जांच इस अध्ययन (चित्रा 3) में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद । क्योंकि caveolae जैसे internalization26के तंत्र में शामिल किया गया है, हम खींच-चढ़ाव में caveolin-1 (Cav-1) की उपस्थिति का विश्लेषण । पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 4) से पता चला है कि जैसे-बी और जैसे-Cx43266-283-बी Cav-1 के साथ बातचीत । हालांकि, जैसे की क्षमता-Cx43266-283-b भर्ती करने के लिए c-Src, PTEN और सीएसके से मजबूत है कि जैसे के साथ पाया-b. फोकल आसंजन कळेनासे (FAK) सी-Src कि Cx43 के साथ बातचीत नहीं दिखाया गया है की एक सब्सट्रेट है । वास्तव में, FAK या तो जैसे-ख या जैसे-Cx43266-283-b के साथ कोई महत्वपूर्ण बातचीत नहीं दिखा था ।

    जैसे-Cx43266-283-बी और सी-Src, G166 GSCs के बीच बातचीत की पुष्टि करने के लिए ५० µ एम जैसे-Cx43266-283-बी के साथ मशीन 30 मिनट के लिए और उनके स्थानीयकरण के द्वारा फ्लोरोसेंट streptavidin के साथ पीछा किया गया था फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5 ). हमारे परिणामों से पता चला कि जैसे-Cx43266-283-B के intracellular वितरण प्लाज्मा झिल्ली के करीब है (phosphatidylserine धुंधला द्वारा दिखाया गया है) और सी के साथ मैच-Src । वास्तव में, सह स्थानीयकरण विश्लेषण को जैसे-Cx43266-283-B और मर्ज छवि में c-Src के बीच सह-स्थानीयकरण (सफेद) के कुछ बिंदुओं का पता चला । नतीजतन, फोकल माइक्रोस्कोपी अध्ययन BCPP पुल नीचे इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि करें ।

    Figure 1
    चित्रा 1: GSC आकृति विज्ञान पर BCPP और CPP का प्रभाव.
    G166 GSCs एक कम घनत्व पर चढ़ाया गया (2 x 104 कोशिकाओं/सेमी2) और के बाद 24 वे ५० µ एम नियंत्रण CPP (जैसे) के साथ मशीन थे, नियंत्रण BCPP (ताट-बी), उपचार CPP (ताट-Cx43266-283) या उपचार BCPP (ताट-Cx43266-283-बी) . a) F-actin (red), α-tubulin (हरा) और विलयन + DAPI immunostaining एक ही क्षेत्र के G166 GSCs आकृतिक दिखा रहा है । पट्टियां = ५० µm । ख) f-actin immunostaining के विभिंन वितरण दिखा रहा है G166 GSCs में ५० µ एम नियंत्रण CPP (जैसे) के साथ 24 घंटे के लिए मशीन के बाद एफ-actin या नियंत्रण BCPP (जैसे-बी) के साथ तुलना में ५० µ m उपचार CPP (जैसे-Cx43266-283) या BCPP (जैसे-Cx43 266-283-B). सलाखों = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 2
    चित्रा 2: GSC व्यवहार्यता पर BCPP और CPP का प्रभाव ।
    G166 GSCs 24-multiwell प्लेटों में ५५०० कोशिकाओं/सेमी2 पर चढ़ाया गया और ५० µ मीटर नियंत्रण पेप्टाइड्स के साथ मशीन, CPP (जैसे) या BCPP (जैसे-b), या ५० µ m उपचार पेप्टाइड्स, CPP (जैसे-Cx43266-283) या BCPP (जैसे-Cx43266-283-बी). सेल व्यवहार्यता ७२ एच के बाद एक MTT परख का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । परिणाम MTT absorbances के रूप में व्यक्त कर रहे हैं और कम से कम 3 प्रयोगों का मतलब ± s.e.m. (+ + पी ˂ 0.01 बनाम नियंत्रण कर रहे हैं । * * p ˂ 0.01, * * * p ˂ 0.001 vs जैसे या ताट-बी; वन-तरफ़ा ANOVA withTukey पद-परीक्षण) । ध्यान दें कि वहां CPPs बनाम BCPPs के प्रभाव के बीच महत्वपूर्ण मतभेद नहीं हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्र 3: प्रोटोकॉल आरेख ।
    कदम द्वारा कदम प्रक्रिया के चित्रमय चित्रण के रूप में खंड में वर्णित "प्रोटोकॉल", BCPPs की मशीन से जब तक eluted BCPPs और उनके बातचीत प्रोटीन प्राप्त किया गया । 1) के लिए वांछित एकाग्रता पर BCPPs के साथ संस्कृति कोशिकाओं को मशीन आवश्यक समय । 2) मशीन के दौरान, BCPPs आंतरिक और वे अपने intracellular भागीदारों के साथ बातचीत कर रहे हैं । 3) बर्फ ठंडा पंजाब के साथ बर्फ पर कोशिकाओं को तीन बार धो लें । 4) लाइसे कोशिकाओं प्रोटीन निकालने के लिए । 5) स्थानांतरण सेल lysates ट्यूबों के लिए ।6) 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ११००० x g पर स्पिन । 7) नई ट्यूबों के लिए supernatants स्थानांतरण (क) और lysates के एक छोटे aliquot ट्यूब में नियमित रूप से पश्चिमी दाग नमूनों के रूप में प्रक्रिया (ख) रखो । 8) NeutrAvidin Agarose मोती reसस्पेंड और प्रत्येक ट्यूब एक कट पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए ५० µ एल जोड़ें । 9) धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए मिलाते के साथ मशीन NeutrAvidin agarose मोती BCPPs और उनके भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं । 10) ३००० एक्स जी में 1 मिनट के लिए स्पिन biotinylated चारा और उनके बातचीत प्रोटीन उंहें बाध्य के साथ मोतियों की गोली । 11) नई ट्यूबों के लिए supernatants स्थानांतरण (सी) और उंहें रखने के मामले में पुल के नीचे का उपयोग करने के लिए दोहराया जाना चाहिए । 12) ताजा lysis बफर के साथ पांच बार गोली धो, उलटा द्वारा reसस्पेंड, ३००० x जी पर 1 मिनट के लिए स्पिन और supernatant त्यागें । 13) सभी supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें । 14) 4x Laemmli बफर की वांछित मात्रा जोड़ें और 5 मिनट के लिए १०० ° c पर प्रोटीन elute) 30 एस के लिए ८२०० x g पर स्पिन मोतियों की गोली के लिए । 16) eluted प्रोटीन नई ट्यूबों (डी) के लिए केशिका युक्तियां के साथ supernatant में पाया स्थानांतरण । 17) पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए जैल पर लोड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: जैसे की intracellular बातचीत का अध्ययन-Cx43266-283-G166 GSCs में बी खींच द्वारा पश्चिमी दाग के बाद नीचे ।
    G166 GSCs के साथ ५० µ m ताट-बी या ताट-Cx43266-283-बी. 30 मिनट के बाद कोशिकाओं लीजड थे और जैसे-बी या जैसे-Cx43266-283-उनके intracellular भागीदारों के लिए संलग्न बी नीचे NeutrAvidin मोतियों के साथ खींच लिया गया । eluted प्रोटीन लोड और FAK, सी Src, CSK, PTEN और Cav-1 के स्तर का अध्ययन करने के लिए पश्चिमी दाग से विश्लेषण किया गया । ध्यान दें कि Cav-1 दोनों जैसे-b और जैसे-Cx43266-283-b के साथ इंटरैक्ट करता है, सी-Src, PTEN और सीएसके के साथ तरजीही बातचीत-Cx43266-283-b और FAK के साथ किसी भी बातचीत नहीं दिखा था या तो जैसे-b या जैसे-Cx43266-283-b. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    Figure 5
    चित्रा 5: जैसे की पुष्टि-Cx43266-283-फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा G166 GSCs में बी intracellular बातचीत.
    G166 GSCs ५० µ m जैसे-Cx43266-283-बी के साथ मशीन थे । 30 मिनट के बाद, कोशिकाओं को ठीक किया गया और जैसे information-Cx43266-283-B के साथ Cy2-Streptavidin (green), c-Src द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस (लाल) और phosphatidylserine वी (नीला) नोट-Cx43266-283-B और c-Src के बीच सह स्थानीयकरण (सफेद) के कुछ बिंदुओं को मर्ज छवियों में प्लाज्मा झिल्ली के पास । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Discussion

    प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कई तरीके हैं । इस अध्ययन में प्रस्तुत विधि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया बायोटिन-avidin pull-डाउन प्रणाली है जिसमें एक biotinylated चारा सेल lysates के साथ मशीन है बातचीत की स्थापना की अनुमति पर आधारित है । इस अध्ययन में प्रस्तुत संशोधन में कोशिका मर्मज्ञ दृश्यों के साथ इस तकनीक का संयोजन भी शामिल है. हम सेल-मर्मज्ञ चारा है कि कोशिकाओं के बजाय सेल lysates रहने और इसलिए पाया बातचीत उन है कि सेलुलर संदर्भ के भीतर हुई प्रतिबिंबित करेगा के साथ हो सकता है मशीन डिजाइन करने का प्रस्ताव ।

    यहां हम सेल मर्मज्ञ अनुक्रम के रूप में उपयोग जैसे, बायोटिन के रूप में खींच-टैग और Cx43 के क्षेत्र एमिनो एसिड 266-283 के बीच शामिल करने के लक्ष्य के रूप में मानव GSCs में intracellular बातचीत मिल । Cx43 और सी के बीच बातचीत के लिए संरचनात्मक आधार-Src अच्छी तरह से जाना जाता है11,12। यह एक महत्वपूर्ण बातचीत है क्योंकि यह सी के oncogenic गतिविधि तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में24,13Src रोकता है । वास्तव में, CPPs युक्त इस क्षेत्र (जैसे-Cx43266-283) तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं पर Cx43 के antioncogenic गुणों की नकल19,20,21। चूहे तंत्रिकाबंधार्बुद सी 6 कोशिकाओं में, तंत्र जिसके द्वारा जैसे जैसे-Cx43266-283 रोकता सी-src अपने अंतर्जात अवरोधकों के साथ एक साथ सी src की भर्ती भी शामिल है सीएसके और PTEN20। यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि GSCs तंत्रिकाबंधार्बुद चिकित्सा में एक लक्ष्य के रूप में बहुत दिलचस्प हैं, क्योंकि वे एक उपजनसंख्या है कि पारंपरिक उपचार के लिए प्रतिरोधी है और इसलिए इस घातक मस्तिष्क ट्यूमर की पुनरावृत्ति के लिए जिंमेदार का गठन27। इसके अलावा, वे कड़ी मेहनत कर रहे है transfect कोशिकाओं और इसलिए intracellular बातचीत के अध्ययन और अधिक कठिन हो जाता है । CPPs तेजी से और कुशलता से intracellular बातचीत के अध्ययन के लिए उनके उपयोग के पक्ष में19 GSCs में आंतरिक रूप से कर रहे हैं । इस अध्ययन में, बायोटिन से जुड़े CPPs का उपयोग कर हम सी के साथ Cx43266-283 अनुक्रम की बातचीत की पुष्टि करें अपने अंतर्जात अवरोधकों सीएसके और मानव GSCs में PTEN के साथ साथ Src ।

    यह विधि अति क्रियाशील यौगिकों के intracellular तंत्र का अध्ययन करने के लिए बहुत शक्तिशाली है । हालांकि, यह बहुत महत्वपूर्ण है पुष्टि करने के लिए कि biotinylated कोशिका मर्मज्ञ चारा के जैविक प्रभाव है कि गैर biotinylated एक के साथ प्राप्त से अलग नहीं है । इस चरण के लिए सक्रिय यौगिक के प्रभाव के साथ पाया बातचीत सहयोगी की आवश्यकता है । इसके अलावा, यौगिक की स्थिरता, अपने संभावित क्षरण के रूप में अच्छी तरह से अपनी संभव विषाक्तता के रूप में, सावधानी से परीक्षण किया जाना चाहिए और प्रयोग की योजना बनाने से पहले खाते में ले लिया । प्रस्तुत उदाहरण में, G166 मानव GSCs पर जैसे-Cx43266-283 के विरोधी प्रफलन प्रभाव पहले से20प्रलेखित किया गया है । इस अध्ययन में, हम पुष्टि करते है कि जैसे-Cx43266-283-बी और जैसे-Cx43266-283 के विरोधी प्रफलन प्रभाव बहुत समान है । इसके अलावा, सेलुलर आकृति विज्ञान के विश्लेषण से पता चला कि α-tubulin और एफ-actin वितरण G166 GSCs के साथ इलाज में बहुत समान है-Cx43266-283-B या जैसे-Cx43266-283। कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सी पर बायोटिन का समावेश-जैसे-Cx43266-283 पर इस परिसर के प्रभाव मानव GSCs पर संशोधित नहीं किया । हालांकि, अगर बायोटिन सक्रिय अणु के प्रभाव को संशोधित करेगा, प्रोटीन शुद्धि के लिए अंय टैग इस तरह के ध्वज octapeptide (DYKDDDDK)28के रूप में परीक्षण किया जा सकता है, मानव इंफ्लूएंजा hemagglutinin-व्युत्पंन टैग हा (YPYDVPDYA) या glutathione एस-ट्रांस्फ़्रेज़ (जीएसटी)29. इसी तरह, अगर जैसे ब्याज के सेल जनसंख्या लक्ष्य नहीं करता है, अंय ऐसे penetratin, MPG के रूप में, (एक समीक्षा के लिए सेल मर्मज्ञ दृश्यों,30देखें) या सेल विशिष्ट अनुक्रम31इस्तेमाल किया जा सकता है ।

    प्रोटीन है कि विशेष रूप से लक्ष्य अनुक्रम के साथ बातचीत का अध्ययन करने के अलावा, आदर्श रूप में, प्रोटीन की उपस्थिति है कि दोनों नियंत्रण और लक्ष्य अनुक्रम और प्रोटीन के साथ बातचीत है कि उनके साथ बातचीत नहीं करते हैं, के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, होना चाहिए संबोधित. इस अर्थ में, हमने Cav-1 को नियंत्रण और इलाज की स्थिति में पाया, सुझाव दिया कि caveolae को internalization के तंत्र में शामिल किया गया है, क्योंकि इसे पहले26दिखाया गया है । इसके अलावा, FAK, जो सी के साथ बातचीत करता है-Src लेकिन Cx43 सी टर्मिनल के साथ बातचीत करने के लिए नहीं माना जाता है, दोनों नियंत्रण और इलाज की स्थिति में अनुपस्थित था । इन परिणामों जैसे-Cx43266-283-B, c-Src, सीएसके और PTEN के बीच बातचीत की विशिष्टता को सुदृढ़ । इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए, फोकल माइक्रोस्कोप के लिए बातचीत प्रोटीन के वितरण कल्पना और उनके सह स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार, हमने पाया कि जैसे-Cx43266-283-B और c-Src प्रदर्शन एक समान intracellular वितरण के कुछ बिंदुओं के साथ सह-स्थानीयकरण के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि के प्रयोगों के नीचे खींचो । वास्तव में, जैसे-Cx43266-283-B के करीब वितरित प्लाज्मा झिल्ली का सुझाव है कि कार्गो, इस अध्ययन में Cx43266-283, इसके intracellular भागीदारों के लिए अणु निर्देशन ।

    प्रस्तावित विधि की सीमाओं में से एक यह है कि चारा के रूप में इस्तेमाल अणु को ठीक से गुना असफल हो सकता है और अपेक्षित प्रभाव नहीं पाया जाएगा । इस स्थिति में, पाया गया बातचीत प्रभाव से संबद्ध नहीं किया जा सका । हालांकि, इस विधि संकेत transduction रास्ते में शामिल बातचीत के लिए विशेष रूप से दिलचस्प हो सकता है क्योंकि वे आम तौर पर आंतरिक रूप से परिक्रमा क्षेत्रों से बाहर किया जाता है३२ और इसलिए वे एक का आदेश दिया तह की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, प्रस्तावित विधि के लाभों में से एक है कि बातचीत के समय पाठ्यक्रम का पालन किया जा सकता है, जो क्षणिक बातचीत के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है । इसके अलावा, बातचीत पर प्रत्येक अवशेष की प्रासंगिकता आसानी से अध्ययन किया जा सकता है । दरअसल, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन पर posttranslational संशोधनों की प्रासंगिकता का अध्ययन करना संभव है, उदाहरण के लिए, serine या threonine के लिए ग्लूटामेट की phosphomimetic प्रतिस्थापन के द्वारा । इसी तरह, फेनिलएलनिन के लिए alanine या tyrosine के लिए serine या threonine के प्रतिस्थापन गैर-phosphorylatable serine, threonine या tyrosine के प्रभाव का परीक्षण करने की अनुमति देताहै ।phospho-tyrosine की नकल करने के लिए, सबसे सटीक तरीका p-Tyr३३के लिए Tyr का प्रतिस्थापन है ।

    अंत में, इस प्रोटोकॉल का दायरा अभी तक प्रोटीन से परे है प्रोटीन संपर्क क्योंकि इस प्रणाली को आरएनए अनुक्रम, नैनोकणों, वायरस या अंय अणुओं है कि CPP के साथ बायोटिन और transduced से इनकार किया जा सकता अध्ययन के रूप में अंय सक्रिय कार्गो के लिए लागू किया जा सकता है उनके intracellular तंत्र की कार्रवाई की ।

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम CPPs और J.C. Arévalo के डिजाइन के साथ उनकी मदद के लिए एम नैतिकता और जे ब्रावो धंयवाद पुल डाउन प्रोटोकॉल के साथ उनकी मदद के लिए । हम टी. डेल Rey की तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं । यह काम Ministerio de Economía y Competitividad, स्पेन द्वारा समर्थित किया गया था; फेडर BFU2015-70040-R, जंटा de Castilla y León, स्पेन; फेडर SA026U16 व Fundación रामोन Areces. एम. Jaraíz-Rodríguez और ए. गोंजालेज-Sánchez जंटा de Castilla y León और यूरोपीय सामाजिक निधि से एक फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

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    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

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