פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת
Summary
אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.
Abstract
ההתקדמות חריגים רבים נעשו ספקטרומטריית (MS)-מבוסס פרוטאומיקס, עם התקדמות טכני מסוים כרומטוגרפיה נוזלית (LC) מצמידים טנדם ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS), קיבולת ריבוב תיוג isobaric. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול פרופיל עמוק-פרוטאומיקס, המשלבת 10-פלקס טנדם המוני תג (תורה מציון) תיוג עם נרחבת בפלטפורמות LC/LC-MS/MS, ו הפרעות חישובית MS שלאחר התיקון במדויק quantitate כל proteomes. פרוטוקול זה כולל את השלבים העיקריים הבאים: חלבון החילוץ, עיכול תורה מציון תיוג, LC (2D) 2-ממדי, ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, עיבוד נתונים חישובית. בקרת איכות צעדים כלולים עבור פתרון בעיות והערכת וריאציה ניסיוני. יותר מ-10,000 חלבונים בדגימות יונקים יכול להיות quantitated בביטחון עם פרוטוקול זה. פרוטוקול זה ניתן גם ליישם את כימות של שינויים פוסט translational עם שינויים קלים. שיטה זו מרובבת, חסון, מספקת כלי רב עוצמה לניתוח פרוטיאומיה מבנית במגוון דוגמאות מורכבות, לרבות תרבית תאים, רקמות חיות האדם דגימות קליניות.
Introduction
ההתקדמות בטכנולוגיית הדור הבא רצפי הובילו נוף חדש ללמוד מערכות ביולוגיות, מחלות אנושיות. זה מותר מספר גדול של מדידות של הגנום, transcriptome, פרוטאום, metabolome ומערכות אחרות מולקולרית להיות מוחשית. ספקטרומטר מסה (MS) היא אחת השיטות הרגישים ביותר ב כימיה אנליטית, היישום שלה ב פרוטאומיקס התרחב במהירות לאחר רצף הגנום האנושי. בשטח פרוטאומיקס, בשנים האחרונות הניבו הגדולות ההתקדמות הטכנית של מבוססי MS כמותני, כולל isobaric תיוג ריבוב יכולת בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית נרחב, בנוסף אינסטרומנטציה למתקדמים, ומאפשר למדידות מהר יותר, מדויק יותר עם פחות חומר מדגם הנדרש. פרוטאומיקס כמותיים הפכו בגישה הרגילה עבור פרופיל של עשרות אלפי חלבונים ושינויים posttranslational דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד1,2,3,4 , 5 , 6.
מרובבת שיטות תיוג isobaric כמו תג isobaric עבור כימות יחסיים ומוחלטים (קרי, iTRAQ) ותג המוני טנדם (תורה מציון) MS מאוד יש שיפור תפוקה של הדוגמה, הגדילה את מספר הדגימות מסוגל לנתח יחיד ניסוי1,–6,–7,–8. יחד עם שיטות אחרות מבוססות MS כימות, כגון כימות ללא תווית איזוטופ יציב תיוג עם חומצות אמינו בתרבות תא (קרי, SILAC), את הפוטנציאל של טכניקות אלה פרוטאומיקס השדה הוא ניכר9 ,10,11. לדוגמה, שיטת תורה מציון מאפשרת 10 דגימות חלבון כדי להיות מנותח יחד בניסוי 1 באמצעות ריאגנטים 10-פלקס. תגים זהים מבחינה מבנית אלה תורה מציון המסה הכוללת זהה, אך איזוטופים כבדים מופצים באופן שונה אטומי פחמן או חנקן, וכתוצאה מכך יון כתב ייחודי במהלך פיצול MS/MS של כל תג, ובעקבותיו כימות היחסי בין הדגימות 10. האסטרטגיה תורה מציון מוחל באופן שגרתי ללמוד מסלולים ביולוגיים, התקדמות המחלה, תהליכים תאיים12,13,14.
שיפורים טכניים ניכר לשיפור משמעותי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) – MS/MS מערכות, הן מבחינת LC הפרדות ופרמטרים MS, כדי למקסם את זיהוי חלבונים מבלי להתפשר על כימות דיוק. הראשון-ממד ההפרדה של פפטידים על ידי הטכניקה ההפרדה עם אורתוגונליות גבוהה למימד השני הוא קריטי בסוג זה של רובה פרוטאומיקס שיטה להשגת תוצאות מיטביות20. גבוהה pH הפוך-פאזי כרומטוגרפיה נוזלית (RPLC) מספק ביצועים טובים יותר מאשר קונבנציונאלי חזק-קטיון כרומטוגרפיה20. כאשר גבוהה pH RPLC משולב עם מימד נוסף של RPLC pH נמוך, טווח דינמי אנליטי וגם חלבון כיסוי משופרות, והתוצאה היא היכולת לזהות את עיקר החלבונים ביטוי בעת ביצוע ניתוחים כל-פרוטאום15 ,16,17,18. ההתקדמות הטכנית אחרים כוללים חלקיקים סי18 קטנים (1.9 מיקרומטר), מורחב זמן עמודה (~ 1 ז)19. יתר על כן, שיפורים בולטים אחרים כוללים גרסאות חדשות של ספקטרומטרים המוני עם המחירים סריקה מהירה, רגישות משופרת, רזולוציה20צינורות ביואינפורמטיקה מתוחכמים עבור כריית נתונים MS21.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט אשר משלבת את מתודולוגיות האחרונה עם שינויים לשיפור הרגישות והן תפוקת, תוך התמקדות במנגנוני בקרת איכות לאורך כל הניסוי. הפרוטוקול כולל מיצוי חלבונים, עיכול, תורה מציון 10-פלקס תיוג, pH בסיסי, חומצה pH RPLC fractionation, זיהוי MS ברזולוציה גבוהה עיבוד נתונים MS (איור 1). יתר על כן, אנו מיישמים מספר צעדים בקרת איכות על פתרון בעיות והערכת וריאציה ניסיוני. פרוטוקול מפורט זה נועד לסייע חוקרים חדשים לשדה באופן שגרתי לזהות במדויק quantitate אלפי חלבונים מן lysate או רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור כימות של חלבונים עם 10-פלקס isobaric תיוג אסטרטגיה, אשר יושמה בהצלחה מספר פרסומים12,13,14,32 . ב פרוטוקול זה, אנחנו ניתן לנתח דגימות חלבון ביולוגיים שונים עד 10 בניסוי 1. אנחנו באופן שגרתי ניתן ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה לכל החברים מעבדה ומתקני אחרים על דיון מועיל. עבודה זו מומן בחלקו על ידי ני H מעניקה R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ו- ALSAC. הניתוח MS בוצעה ב חולים פרוטאומיקס למחקר הילדים סנט ג’וד, חלקית נתמך על ידי מענק NIH סרטן מרכז תמיכה P30CA021765. המחברים מודים Badders נישה על לעזור עם עריכת כתב היד.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
