Summary
우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.
Abstract
많은 뛰어난 발전 질량 분석 (MS)에서 만들어진-proteomics, 액체 크로마토그래피 (LC)에 특정 기술 진보와 함께 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)을 isobaric 라벨 멀티플렉싱 용량 결합을 기반으로. 여기, 우리는 광범위 한 LC/LC-MS/MS 플랫폼, 그리고 정확 하 게 전체 proteomes을 quantitate 후 MS 전산 간섭 보정 10-플렉스 연동 대량 태그 (TMT) 라벨을 결합 하는 깊은 단백질 프로 파일링 프로토콜을 소개 합니다. 다음과 같은 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜: 단백질 추출 및 소화, TMT 라벨, 2 차원 (2D) LC, 고해상도 질량 분석 및 전산 데이터 처리. 품질 관리 단계는 문제 해결 및 실험적인 변화를 평가 합니다. 포유류 샘플에서 10000 개 이상의 단백질이 프로토콜 자신 있게 quantitated 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 사소한 변화를 가진 포스트 번역 상 수정 정량에도 적용할 수 있습니다. 다중화, 강력한 방법이 다양 한 세포 배양, 동물의 조직, 그리고 인간의 임상 들을 포함 하 여 복잡 한 샘플에서에서 proteomic 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 기술의 발전은 생물 학적 시스템을 연구 하 고 인간의 질병에 대 한 새로운 풍경에 이르렀다. 이 게놈, transcriptome, 프로테옴, 대사체, 및 유형 될 다른 분자 시스템의 측정의 많은 허용 하고있다. 질량 분석 (MS) 분석 화학에서 가장 중요 한 방법 중 하나 이며 proteomics에의 응용 인간 게놈 시퀀싱 후 급속 하 게 확장 했다. 프로 테오 믹스 분야에서 지난 몇 년 동안 MS 기반 정량 분석, isobaric 라벨 및 멀티플렉싱 계측 뿐만 아니라 광범위 한 액체 크로마토그래피와 결합 하는 기능을 포함 하 여 주요 기술 발전을 굴복 했다 진보, 더 빨리, 더 정확한 측정을 위해 필요한 적은 샘플 자료 허용. 양이 많은 proteomics 단백질과 posttranslational 수정 매우 복잡 한 생물 학적 샘플1,2,,34 에 수천 수만의 프로 파일링을 위한 주류 접근 되고있다 , 5 , 6.
멀티플렉스 isobaric 라벨 isobaric 태그 등 상대 및 절대 정량 (즉, iTRAQ) 및 탠덤 질량 태그 (TMT) MS는 크게 샘플 처리량 향상 방법과 단일에서 분석할 수 있는 샘플 수를 증가 실험1,6,,78. 다른 MS 기반 정량 방법과 함께 레이블 없는 정량 등 안정 동위 원소는 proteomics에 이러한 기술의 잠재력 세포 배양 (즉, 단기), 아미노산 라벨 필드는 상당한9 10,11. 예를 들어 방송 통신 방법 10 단백질 샘플 10 플렉스 시 약을 사용 하 여 1 실험에 함께 분석을 허용 한다. 이러한 구조적으로 동일 TMT 태그 같은 전체 질량, 하지만 무거운 동위 원소는 차동 상대 정량 함으로써 각 태그의 MS/MS 조각화 동안 독특한 기자 이온 인 탄소 또는 질소 원자에 배포 10 샘플 사이. 방송 통신 전략 생물 학적 경로, 질병의 진행 및 세포질 과정12,,1314에 정기적으로 적용 됩니다.
실질적인 기술 향상 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 시스템, LC 분판와 정량 정확도 희생 하지 않고도 단백질 식별을 최대화 하기 위해 MS 매개 변수 향상 했습니다. 에 2 차원 높은 직교로 분리 기술에 의해 펩 티 드의 첫 번째 차원 분리는이 유형의20최대 결과 달성 하기 위해 샷건 proteomics 방법에 중요 합니다. 높은 pH 반전 단계 액체 착 색 인쇄기 (RPLC)에 기존의 강한 이온-교환 크로마토그래피20보다 더 나은 성능을 제공 합니다. 분석 동적 범위와 단백질 범위 개선 높은 pH RPLC 낮은 pH RPLC의 두 번째 차원, 결합 될 때, 전체 프로테옴 분석15 를 수행할 때 표현한 단백질의 대량을 식별 하는 기능 결과 16,,1718. 기타 기술 진보 작은 C18 입자 (1.9 µ m)를 포함 하 고 긴 열 (~ 1 m)19를 확장. 또한, 다른 주목할 만한 개선 빠른 스캔 속도, 향상 된 감도 및 해상도20, MS 데이터 마이닝21에 대 한 정교한 생물 정보학 파이프라인 질량 분석기의 새 버전을 포함합니다.
여기, 우리는 실험을 통해 품질 관리 메커니즘에 집중 하면서 감도 처리량을 개선 하기 위해 수정 최신 방법론을 통합 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 포함 단백질 추출 및 소화, TMT 10-플렉스 라벨, 기본적인 pH 및 산 성 pH RPLC 분류, 고해상도 MS 검출 및 MS 데이터 처리 (그림 1). 또한, 우리는 문제 해결 하 고 실험적인 변화를 평가 하기 위한 여러 가지 품질 관리 단계를 구현 합니다. 이 상세한 프로토콜 연구원은 새로운 분야를 정기적으로 확인 하 고 정확 하 게는 lysate에서 단백질의 수천을 quantitate 도움을 것입니다 또는 조직.
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Protocol
주의: 사용 하기 전에 모든 관련 안전 데이터 시트 (즉, MSDS)를 참조 하십시오. 이 프로토콜을 수행할 때 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하십시오.
참고: TMT 10-플렉스 isobaric 라벨 시 약 세트 10 샘플의 프로테옴 정량이이 프로토콜에 사용 됩니다.
1. 준비의 세포/조직
참고: 최소한의 시간에 그들의 원래 생물 학적 상태에서 단백질을 계속 낮은 온도에서 샘플을 수집 하는 것이 중요.
- 세척 부착 세포 (예를들면, HEK 293 세포) 얼음의 10 mL로 두 번 10 cm 접시에 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 긁 고 1 mL의 PBS에 셀 (2 ~ 10 6 셀 x)를 수집 합니다. 1.5 mL 튜브에 전송 하 고 세포까지-80 ° C에서 4 ° C. 저장소 셀 알갱이에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리 후 PBS를 제거.
참고: 파일럿 실험 종종 단백질 수율 검사를 수행 합니다. 단백질의 약 1 밀리 그램 추출 될 수 있다 또는 15 cm 접시 10 x 10 6 포유류 세포에서 80% 합류와. - 또는 직접 접시 세척 후 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 그들의 접시에 부착 세포를 lyse. 1.5 mL 튜브에 lysates를 수집 하 고 사용 프로토콜 설명 단계 2.5.
- 수집 정지 15 mL 튜브, 두 번 세척에에서 얼음 차가운 PBS의 10 mL, 1.5 mL 튜브로 전송할 전지와 PBS를 제거 하려면 600 x g에서 원심. 세포의 용 해 버퍼 재료의 원하는 농도 유지 하기 위해 완전히 세척 단계에서 PBS를 제거 합니다. 세포까지-80 ° C에서 셀 펠 릿 저장.
- 수집 하 고 조직을 신속 하 게 무게. 조직에서에서 계속 액체 질소 해 부 및 저장 후 즉시-80 ° c.
참고: 조직의 단백질 수확량은 약 5% ~ 10%의 조직 무게 - 동질적인 조직 크기와 10 샘플에 대 한 해부학 영역을 사용 하 여 샘플이 감소. 단백질 정량 및 다운스트림 데이터 분석에 영향을 미치는 매우 풍부한 혈액 단백질을 피하기 위해 얼음 차가운 PBS의 1 mL로 두 번 샘플을 rinsing 하 여 혈액 오염 제거.
2. 단백질 추출, 품질 관리 부 럽, 솔루션에서 소화 및 펩 티 드 담
참고: 줄이기 위해 필수적 이다 TMT 표시 된 샘플의 풀링 하기 전에 어떤 단계 동안 동일한 방식으로 샘플 10의 각 처리 변형.
- 세포의 용 해 버퍼 (50 mM HEPES [pH 8.5], 8 M 요소, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate) 실험의 날.
참고: 샘플 세포 중 일부 단백질 변성에 영향을 미치는 단백질 소화 효율.
참고: 해제 신선한 요소 버퍼 인공 화학 수정 (즉, 단백질 carbamylation)를 소개 하 고 식별 하는 펩 티 드의 수에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 상당한 볼륨을 차지 하는 우 레 아 (요소의 100 mg 솔루션에서 ~ 73 µ L을 차지).
참고: 다른 정확한 기준을 사용할 수 있습니다. 단백질 농도 또한 핸드폰 번호 또는 조직 가중치 추정 수 있습니다. 단백질 (100 µ g/샘플)의 1 밀리 그램을 권장 되지만 분석 단백질 (10 µ g/샘플)의 작은 100 µ g으로 수행할 수 있습니다.
참고: 비효율적인 트립 신 소화 될 수 있는 요소는 pH 문제, 비활성 트립 신, 또는 기판에 효소의 부적당 한 비율의 사용.
참고: 경우의 수는 분열을 놓친은 > 10%, 그것은 불완전 한 트립 신 소화를 나타낼 수 있습니다. 이 부정적인 다운스트림 결과 영향을 것입니다. 이것은 중요 한 품질 관리 (QC) 단계.
3. TMT 라벨의 펩 티 드
참고: 모든 샘플 완전히 TMT 시 약에 의해 표시 확인 하는 것이 중요. 여러 요인 (예, TMT 시 약 사용의 금액, pH 값, 단백질 정량의 정확도) TMT 부정적인 모든 다운스트림 결과 변경 효율 라벨에 영향을 미칠 수.
50 mM HEPES buffer (pH 8.5)의 50 µ L에서- 각 reconstitute
- desalted 펩 티 드 샘플. 산도 확인 하 고 그것은 7과 8 사이 확인.
참고: 샘플 라벨 효율에 영향을 미칠 것 이다 염 단계 후 완전히 건조 하지 경우 산 성 수. - 단계 3.3에에서 설명 된 대로 테스트에 대 한 후속 TMT 라벨 효율, 레이블이 각 샘플의 ~ 1 µ g를 유지.
- 무수 ACN 시 약 TMT를 해산 하 고 펩 티 드 샘플 제조 업체에 따라 라벨 ' s 지시. 1 헤에 대 한 실시간에 시 약을 품 어
- 제조 업체에 따라 포함 된 크로마토그래피 미디어 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 각 TMT 레이블-레이블 없는 샘플의 염 ~ 1 µ g에 의해 QC TMT 라벨 효율 테스트를 수행 ' s 프로토콜. LC-MS/양 여 TMT 분류, 레이블이 없는 샘플 분석
참고: LC-MS/MS 매개 변수는 그라데이션 10 분은 예외 섹션 5에서와 같이 - 레이블이 펩 티 드를 보장 완전 한 라벨 효율 ( 그림 2) 표시 샘플에서 검색 되지 않습니다 수 있도록 원시 데이터를 검사 합니다. 6 ~ 10 라벨 효율성을 확인 하기 위해 별도 펩 티 드에 대 한이.
- 담금질 5 %hydroxylamine 4 µ L을 추가 하 여 반응 하 고 15 분에 대 한 품 어
- 혼합 각 TMT 표시 된 샘플의 작고 동등한 볼륨 (2 µ L) 약 수 있습니다. Desalt 임베디드 크로마토그래피 미디어 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여. 3.4 단계에서 설명한 대로 LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다. 점프 소프트웨어 프로그램 (오픈 소스 데이터베이스 검색 알고리즘을 펩 티 드와 단백질의 목록에 탠덤 MS raw 파일을 변환)를 사용 하 여 모든 10 샘플의 상대적 농도 비율의 TMT 태그 농도 의해 결정 확인 펩 티 드.
참고: QC 섞은 비율 테스트는 최종 풀링 하기 전에 동등한 혼합에 대 한 정확한 비율을 결정 하는 데 도움이, 농도 변경 됩니다 고 단백질 정량 단계 되지 않을 수 있습니다 항상 정확한 pipetting 오류가 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 3.5 단계에서 설명한 대로 최종 믹스 사용 10 샘플의 각각의 금액 모두 동등한 비율에는 보장 하는 가장 좋은 방법은. - 모든 10 샘플에서 1:1 비율을 달성 하는 데 필요한 횟수 만큼 반복 합니다.
- 동등 하 게 섞은 비율 테스트의 결과 따라 10 샘플 혼합. 기준으로 최저 농도와 예제를 사용 하 여 다른 9 샘플의 볼륨 조정.
- 담 여 풀링된 TMT 표시 된 샘플의 냉각 반응의 부산물 제거.
- 워시 1 mL 고체 상 추출 카트리지 50 mg와 1/0.25 mL 메탄올의 열당 매를 포함 하는 100 µ g 샘플을 사용 하는 경우. 씻어 0.5 µ-60 g 용량 C18 스핀 열으로 1/0.25 mL 60%의 ACN/0.1% TFA 10 µ g 샘플을 사용 하는 경우. 500 x g 30에 열 원심 s.
- Centrifuging 500 x g 30에 의해 0.5 mL 0.1 %TFA 제거와 열 평형 s.
- 샘플 열에 로드 하 고 3 분 또는 때까지 모든 샘플의 열 통과 100 x g에서 원심 분리 하 여 바인딩합니다.
- 0.5 mL 0.1%의 추가 열을 30 500 x g에서 원심 분리기 TFA s.
- 추가 125 µ L 60%의 각 열에 ACN/0.1% TFA 고 3 분 모두 솔루션의 열 통과 확인을 위한 100 x g에서 centrifuging 의해 elute.
- 건조 진공 집중 장치에서 eluents. 샘플 튜브에서 완전히 건조 하 고 더 액체 남아 확인 하십시오. 추가 분석까지-80 ° C에서 저장소.
4. 광범위 한 고해상도, 기본적인 pH LC Prefractionation
- 세트 2 연결된 C18 열 브리지 에틸렌 하이브리드 입자 (4.6 m m x 25 cm, 50 cm 총, 3.5 µ m 입자 크기)를 포함 하 고 위한 microliter 흐름 고성능 LC 펌프를 사용 하 여 분별 법.
참고: 2 열 사용 펩 티 드 부하 증가 하 고 반드시 크로마토그래피를 개선 하지 않습니다. 포함 된 샘플에 대 한 ≤ 펩 티 드의 200 µ g, 1 열이 충분. - 세척 (10 m m 염화 편대, pH 8.0) 300 µ L 각의 메탄올, 물, 그리고 버퍼 A의 후속 추가 100 µ L 루프.
- 똑같이 혼합된 소 프로 파 놀, 메탄올, ACN, 및 물 100 µ L 열 세척 하 고 95% 버퍼 2 h. A 열 equilibrate
- Solubilize 버퍼 A. 확인 샘플 pH 8.0 ~은의 65 µ L에서 desalted 풀링된 TMT 표시 된 펩 티 드 샘플. 아직도 산 성를 사용 하 여 수산화 암모늄 pH 8.0 조정.
- Fractionate 샘플 버퍼 B 다음 그라디언트를 사용 하 여 (버퍼 더하기 90 %ACN): 15 분 동안 15% ~ 20%, 20% ~ 35 %100 분, 및 30 분에 대 한 35% ~ 50% 설정 수집 분수를 분수 수집기 로딩 시간을 포함 한 모든 2 분. 0.4 mL/min 흐름 속도 설정. 대표적인 크로마 참조 29 및 그림 1을 참조 하십시오.
- 80 분수의 총을 수집 하 고 완벽 한 건조에 진공 집중으로 40 분수 (모든 다른 분수) 건조.
- LC-MS/MS 분석을 위한 40 말린된 샘플을 사용 하 여.
- LC-MS/MS 매우 깊은 프로테옴 범위를 달성 하 여 모든 80 분수 분석.
5. LC-MS/MS 준비 및 매개 변수
참고: TMT에 기반 정량, 펩 티 드 이온 isobaric 고 MS1 스캔에서 1 질량으로 나타납니다. 그러나, 그들은 있다 quantitated 기자 이온 (10 독특한 기자 이온)의 강도 따라 MS/MS 스캔에서 펩 티 드 이온 높은 에너지 충돌 분리 (HCD)와 조각화 되었습니다 후. TMT 기자 이온 비율 TMT 표시 된 이온 24의 공동 차입에서 억제 될 수 있습니다. 이온 격리 창 25, 가스 단계 정화 26, MultiNotch MS3 방법 27 또는 다차원 LC와 긴 그라디언트 (4-8 h) 광범위 한 분류를 축소 28 가지 대체 방법을.
- 팩 75 µ m 내경 (ID) 빈 1.9 µ m 40 c m 길이 (~1.3 µ L 침대 볼륨) 30 C18 수 지의 열.
- 는 Backpressure을 통해 매우 높은 압력의 압력 방지 나비 포트폴리오 히터 65 ° C에서 열 열 액체 크로마토그래피 (UPLC) 시스템입니다. 2 ~ 3 배 온 열 침대 길이가 열 되도록 나비 히터에서 열을 코일. 히터는 히터 내부 온도 센서에 테이프 주의 안쪽 열 테이프.
참고: 나비 포트폴리오 히터는 탑재 하 고 악기의 XYZ 단계에 연결 된 플 렉 시 유리의 맞춤 조각에 녹화. - 준비는 (3% 디 메 틸 sulfoxide 및 0.2% 개미 산 성)를 버퍼링 하 고 B 버퍼 (버퍼 더하기 67 %ACN) 95% 버퍼 B. 철저 하 게 열을 씻어 다음, 완전히 열 95% 버퍼 A에에서 (적어도 3 열 볼륨) equilibrate. ~0.25 µ L/분의 유량을 사용 하 여 280 320 바의 배 압
- 100을 실행 하 여 LC-MS/MS 시스템의 품질을 검토 쥐 두뇌 펩 티 드 (또는 우리의 선택의 표준) TMT 표시 된 샘플을 분석 하기 전에 두 번의 ng. 자주 높은-품질 데이터 수집을 위해 다음 매개 변수를 확인 하십시오: MS 신호 강도 (사이 e8, e9 기본 피크 강도 대 한) 조사 MS/MS 스펙트럼 (y와 b 이온의 좋은 표현), 최대 폭 (12 월 22 일 s), 전반적인 보존 기간, 품질 LC 시스템 압력 (압력 상승 > 50 바 나타냅니다 더러운 열 또는 막힌된 미터 팁), 그리고 실행 실행 가능한 가변성 (동일한 봉우리 이어야 한다 < 30 s 실행 사이의).
참고: 10 플렉스 TMT 시 약 (6.32 mDa 차이)의 근처 isobaric 기자 이온을 해결 하려면 MS/MS 해상도 400 m/z에 30000 이상 설정 되어야 합니다. HCD 일반적으로 사용 됩니다 TMT10 플렉스 기자 이온 조각화로 이온 함정 악기에 충돌 유도 된 분리 (CID)에 적용 되는 1 / 3 규칙 적용 되지 않습니다. - 클린 MS 악기를 정기적으로 보정 하 고 신선한 LC 버퍼를 사용 하 여 시스템 성능을 향상.
- 5%에서 기본적인 pH 분리에서 말린된 펩 티 드 reconstitute TFA.
- ~0.2 µ g 흐르는 5% 버퍼 대답 하는 동안 열에 로드
- Elute 버퍼 B 150 분의 45%에 15%와 함께. 시작 지점으로 다음 그라디언트 사용: 시간 0, 버퍼 B 5%; 시간 2, 버퍼 B 15%; 135, 버퍼 B 45%를 시간, 145, 버퍼 B 70%; 그리고 시간 150, 버퍼 B 95%. 기본 피크 chromatograms를 검토 한 후 약간 초기 및 런타임에 기본 pH RPLC 분수에 대 한 그라디언트를 조정.
- 이온 트랩 질량 분석기 (400-1600 m/z; 60000; 1 x 10 6 자동 이득 제어 (AGC) 대상; 50 최대 이온 시간; 확인과 중심 모드)에서 조사 스캔 데이터 종속 모드에서 질량 분석기를 작동합니다. 20 MS/MS 고해상도 스캔 (60000 해상도, 1 x 10 5 AGC 대상, ~ 100 ms 최대 이온, 35 HCD 정규화 충돌 에너지, 0.4 m/z 격리 창, 시간과 20 s 동적 제외) 수행.
참고: 전자 이동 분리 (ETD)은 권장 되지 않습니다 TMT10 플렉스 시 약 ETD 분열 사이트 HCD에서 다르기 때문에 기자 이온 오버랩의 결과. 또한, ETD은 효과적으로 HCD tryptic 펩 티 드 일반적으로 + 2 충전된 상태, 생성 및 ETD 높은 충전 상태에서 더 효율적입니다 때문에.
6. MS 데이터 분석
참고: 점프 소프트웨어 프로그램과 데이터 분석 설명. 그러나 다른 상업적으로 사용할 수 또는 무료 프로그램과 데이터 분석을 수행 하는,.
- 태그 기반 하이브리드와 질량 분석기에서 프로세스 raw 파일 검색 엔진 점프 21, 패턴 기반 데이터베이스 검색 및 태그 기반 드 노 보 시퀀싱 민감도 특이성을 개선 하기 위해 결합 하.
- 변환 mzXML 원시 데이터 형식과 MS2 스펙트럼 틀린 발견 비율 (FDR) 계산 대상 미끼 UniProt 인간의 데이터베이스 (또는 다른 적절 한 종의 데이터베이스)에 대 한 검색.
- 수행 전조와 조각 이온을 위한 10 ppm 질량 허용 오차를 사용 하 여 검색 합니다. 2 최대 놓친된 분열, 펩 티 드, 당 3 최대 수정 사이트와 , b 및 점수는 펩 티 드 y 이온의 할당 완전히 tryptic 제한에 다른 검색 매개 변수를 설정 합니다. Lys 잔류물 및 N termini에 TMT 태그 정적 수정 설정 (+229.162 Da) 그리고 Cys의 잔류물의 carbamidomethylation (+57.021 다). 메트로 산화를 포함 하도록 동적 수정 설정 (+15.994 Da), 샘플 처리에서 발생 하는 일반적인 펩 티 드 아티팩트입니다.
- 다음 필터 데이터 기준: 7 아미노산 펩타이드 최소 길이, m/z 정확도 (예, 5 ppm), 및 일치 점수 (J 점수와 deltaCn). 펩 티 드는 펩 티 드 길이, trypticity에 따라 그룹화 하 고 충전 상태.
- 점수와 일치 하 여 필터링의 추가 수준을 사용 하 여 단백질을 루즈벨트 1% 감소. 단일 스펙트럼 수로 확인 된 단백질 필요 높은 일치 점수.
- 펩 티 드 단백질 가족의 여러 구성원에 의해 공유 클러스터 일치 단백질 회원 1 그룹에 대 한.
참고: 간결 원칙에 따라 그룹으로 표시 됩니다 할당 된 펩 티 드의 가장 높은 번호와 단백질 및 다른 단백질에 독특한 펩 티 드 1 일치. - 점프 소프트웨어 제품군에 내장 된 프로그램을 사용 하 여 모든 일치 펩 티 드 스펙트럼 일치 (Psm)에 걸쳐 기자 이온 수를 요약 하 여 단백질을 quantitate.
- 각 PSM 허용, 추출 및 라벨 시 약 및 글로벌 PSM 정량 데이터에서 계산 된 로드 바이어스의 동위 원소 분포에 따라 방송 통신 기자 이온 농도 수정. 정량 중 낮은 강도와 높은 잡음 레벨 사용자 정의 임계값과 Psm를 필터링.
- 상대 신호 각 기자 이온 사이의 모든 10 기자 이온의 평균을 계산합니다. 합계는 Psm의 상대적인 신호 확인 된 단백질에 대 한. 해당 단백질에 상위 3 Psm의 평균된 기자 이온 강도 곱하여 절대 신호에 상대적인 신호 변환.
- 후 MS 계산 방법을 사용 하 여 간섭 문제 해결. Y 1 이온 강도 기자 이온 강도에 비례, 깨끗 한 검사에서 선형 관계를 계산와 시끄러운 스캔 23에 오염 된 y1ion 강도에서 간섭 레벨을 파생.
참고: TMT 표시 tryptic 펩 티 드에 대 한 K-TMT와 R 잔류물의 2 종류가 y 1 이온 (376.27574 Da와 175.11895 다, 각각) MS2 검사에. 경우에 1 y 1 이온 감지 되 고 식별 된 펩 티 드와 일치 하는는 MS2 깨끗 한 스캔 ( 그림 3A)으로 간주 됩니다. 두 y1ions 검색 되는 MS2 시끄러운 스캔 하다. - 는 단백질 정량 값 추가 분석을 위해 스프 레트 시트 소프트웨어 프로그램에 내보냅니다. 인덱스도 비교 또는 분석의 차이 사용 하 여 차동 표현 단백질 확인.
7. MS 데이터 유효성 검사
참고: MS 데이터의 품질을 평가 하 시간이 걸리는 생물학 실험을 진행 하기 전에 적어도 1 방법의 유효성 검사를 수행.
- 수동으로 펩 티 드 순서 및 방송 통신 기자 이온 정량 확인 하는 관심사의 단백질의 MS/MS 스펙트럼 검사.
- MS 결과 확인 하려면 단백질 정량 데이터를 알려진 사용.
- 항 체 기반 접근 방식 (예를 들어, weste 확인 단백질 변화rn 오 점 및 immunohistochemistry 분석).
- 화학적 관심의 펩 티 드를 합성 하 고 네이티브 펩 티 드의 id를 확인 하려면 내부로 표준 사용.
참고: 해당 MS/MS 패턴 및 LC-MS/MS 동안 보존 기간 동일 해야 합니다. - 타겟된 MS 방식으로 단백질 변화를 확인 합니다.
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Representative Results
우리는 pre-MS 분류, MS 설정 및 post-MS 수정23를 포함 하 여 3 주요 프로토콜 단계에서 비율 압축의 효과 체계적으로 분석 하는 앞에서 설명한 간 종 펩 티 드 믹스를 사용. Pre-MS 분류 평가 되었고 기본적인 pH RPLC의 조합 및 산 성 pH RPLC 사용 하 여 최적화 된. Post-MS 분석만 종의 펩 티 드로 간주 됐다. 이 간섭 모델 LC/LC-MS/MS, MS2 격리 창, 온라인 액정 해상도, 로드 양의 온라인 산 성 pH RPLC, 및 오프 라인 높은 pH RPLC의 해상도 포함 하 여 매개 변수를 검사 하는을 사용 하는 우리 (참조 그림 3 참조 29)입니다.
오프 라인 LC 중 해상도 변경, 우리 320 조각으로 isobaric 레이블이 펩 티 드를 분리 하 고 분리 전원 조정 하려면 함께 선택한 분수 합니다. 오프 라인 액정 해상도 간섭 레벨을 모니터링 하는 동안 수집 된 일부 하위 집합 (1, 5, 10, 20, 40, 80, 및 320)의 수를 사용 하 여 테스트 되었습니다. 우리는 간섭 수준 발견 점차적으로 16.4%에서 2.8%로 감소, 다소 오프 라인 LC 별거 동안 그 광범위 한 분류를 나타내는 공동 펩 티 드 방출의 문제를 완화 했지만 완전히 제거 할 수는 합니다.
다음으로, 우리는 간섭에 MS2 격리 창의 효과 평가. 우리는 실험적으로 방해 했다 이전 연구29,30와 격리 창의 크기에 대략 비례 결정 됩니다. 예를 들어 4-fold 차이 창 크기 (1.6 0.4 다)의 결과 ~ 유추 수준 (14.4% 3.7%)의 4-fold 차이. 우리는 또한 MS 분석에 대 한 열의에 최적의 로드 금액을 결정 하 고 더 방해를 부정 하는이 정보를 사용. 우리는 적절 한 양의 샘플을 로드 하 여 3.3%로 9.4%에서 방해를 감소. 너무 많은 샘플을 로드 이어질 피크31 을 확대 하 고 따라서 감소 단백질 정량 정확도 결과 간섭 레벨을 올릴 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 그라디언트 길이 (1, 2, 및 4 h)를 변경 하 고 긴 열 (~ 45 cm)를 사용 하 여 온라인 RPLC 해상도 최적화. 우리는 4-h 그라데이션 거의 (0.4%)까지 간섭 제거 하지만 악기 시간 추가 발견. 최적화 된 매개 변수 공개 좁은 격리 창 (0.4 다), ~ 100 ng 샘플의 열, 그리고 간부의 분류 (x 2 h, 3.3 일 ~ 40)에 로드 된. 우리는 또한 그는 post-MS 교정 컴퓨터 기반 전략을 사용 하 여 우리가 개선 양적 정밀 (그림 3B) 단백질 비율을 결정할 때 보였다.
우리의 결과의 사용 최적화 LC MS 매개 변수 및 post-MS 교정 철저 한 proteomic 프로필을 제공할 수 있으며 사실상 종종 단백질 정량 isobaric 라벨 기술에 의해 생산 되는 간섭 제거를 나타냅니다.
그림 1: TMT-LC/LC-MS/양 전체 프로테옴 프로 파일링 분석의 계획 10 생물 학적 샘플 lysed, 소화, 되었고 10 다른 TMT 태그, 오프 라인 기본 pH 역 상 액체 크로마토그래피 (LC)에 의해 동등 하 게, 풀링된 및으로 분류 한 80 분수와 함께 표시. 모든 다른 분수 신랄 한 RPLC 구분 추가 되었고 온라인 고해상도 질량 분석기로 분석. MS/MS raw 파일 처리 되었고 펩 티 드 및 단백질 식별 Uniprot 데이터베이스에 대 한 검색. 단백질은 TMT 태그의 상대적 강도 따라 quantitated 했다. 마지막으로, 확인 및 quantitated 단백질 통합 데이터 분석을 위해 제출 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 방송 통신 효율 시험 라벨. TMT 레이블이 모두 LC-MS/MS TMT 효율 라벨 검사를 별도로 분석 했다 그들의 해당 샘플을 레이블 없음. 전체 TMT 라벨에 대 한 (A) 레이블이 펩타이드 피크는 완전히 TMT 표시 된 펩 티 드 레이블된 샘플에만 반면 분류 샘플, (B)에서 결 석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: MS 데이터 수집 후 간섭 제거를 위한 전산 접근. (A) 모든 MS2 검사 깨끗 한 (왼쪽된 패널)와 시끄러운 스캔 (오른쪽 패널)로 분할 되었다. 시끄러운 검사 전시 두 y1 이온의 K와 R (대상 펩 티 드와 펩 티 드를 오염 하는에서 다른 사람에서 1). (B) 대장균 펩 티 드 했다 개별적으로 3 다른 TMT 시 약으로 분류 하 고 1: 3에서 풀링된: 10 비율. 약 20-fold 더 많은 쥐 펩 티 드 배경으로 추가 되었다. 3 그룹에 대장균 펩 티 드의 총계 상대 농도 y1 이온 기반 보정 TMT 기반 정량에 대 한 더 정확 하 게 밝혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여러 출판물12,,1314,32에서에서 성공적으로 구현 되었습니다는 10-플렉스 isobaric 라벨 전략으로 단백질의 정량에 대 한 높은 처리 프로토콜 설명 . 이 프로토콜에서 우리 1 실험에서 최대 10 다른 생물학 단백질 견본을 분석할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 식별 하 고 높은 자신감을가지고 잘 10000 단백질을 quantitate 수 있습니다. Isobaric 라벨은 단백질을 quantitate에 효과적인 기술, 비록 양적 부정확성으로 이어질 수 있는 비율 압축에 의해 제한 됩니다. LC/LC의 최적화와 함께 y1 이온 기반 post-MS 교정, MS/MS 설정 등 다양 한 전략을 사용 하 여 우리의 프로토콜 효과적으로 대부분의 간섭 효과 제거 하 고 따라서 상당히의 정밀도 향상 단백질 정량입니다.
단백질 정량, 여러 가지 방법으로 프로그램 기능 점프 제품군에 대 한 우리는 공급 업체에서 제공한 인증서에서 보고 된 값에서 약간 다릅니다 구입한 시 약의 모든 배치를 위한 동위 원소 불순물 측정. 측정된 동위 원소 불순물 점프 소프트웨어에서 기자 이온의 농도 수정 하는 데 사용 됩니다. 단백질은 일반적으로 이온화 효율 등의 여러 요인에 의해 영향을 다양 한 절대 농도와 많은 Psm으로 quantitated 됩니다. 요인의 영향 알려져, 때문에 질량 스펙트럼 TMT 분석 결과에서 기자 이온의 상대적인 나타났는데만 공개. 기자 이온의 상대적인 나타났는데 모든 10 기자 들의 평균 강도 의해 각 기자 이온의 강도 나누어 계산 됩니다. 최고의 대표는 단백질의 "절대 신호"를 제공 하려면 우리 단백질에서 높은 절대 농도와 3 Psm의 상대 농도의 평균와 절대 추정 하 강한 절대 강도의 평균 계산 단백질의 신호입니다. 우리는 리 스케일링으로 이러한 단계를 정의. Y1 교정은 어떤 사건 분석;에 보편적으로 적용 되 그러나, 어떤 경우에 우리가 수 정정 하지 펩 티 드에 대 한 y1 이온을 포함 하는 MS/MS 스펙트럼으로. 그러나, 우리는 스펙트럼의 ~ 90%는 리 신과 아르기닌에서 y1 이온 발견. 공동 식별 된 펩 티 드로 같은 C 맨끝 잔류물을 펩 티 드 방출로 인 한 간섭에 대 한 보상, 예상된 간섭 레벨 본질적으로 두 배로 되었고 교정에 사용. 이 가정은 우리는 우리가 y1 K R 포함 펩 티 드에 대 한 동일한 강도 레벨을 관찰 하는 수많은 방송 통신 실험을 통해 수집 된 경험적 증거에 근거 했다.
방해는 우리가 MS3 multinotch 접근 등이 프로토콜에서 설명 된 다른 많은 방법으로 줄일 수 있습니다. 이러한 메서드의 모든 유효 하 고 그들의 개인적인 장점을. 궁극적으로, 사용 하는 방법론 등 요인의 수에 따라 다릅니다에 국한 되지 않는 샘플 금액, 악기 여부 (즉, 악기 종류 및 샘플을 분석 하는 데 필요한 시간), 원하는 결과 (즉, 수의 식별 하는 단백질의 경우) 및 정량 정확도 필요.
가장 정확한 결과 보장 하기 위해, 그것은 프로토콜에 걸쳐 품질 관리 단계를 주의 하는 것이 중요입니다. 이러한 샘플 (예를 들면, 아미노산 분석을 겪고 있다 BSA), 정량에 대 한 정확한 표준을 사용 하 여 포함 TMT 시 약의 라벨 효율 테스트, 트립 신 소화의 효율을 결정, 프리 믹스 비율 테스트 수행 에 모든 10 샘플의 동등한 혼합 어떤 로드 바이어스를 해결 하기 위해 소프트웨어를 사용 하 여 확인 합니다. 알려진된 단백질 또는 여러 단백질 것으로 예상 된다 개별 샘플 사이 식 변화를 전시 하는 경우에 이러한 변화는 검출 될 수 있다을 확인 초기 세포 세포의 용 해 후 서쪽 오 점 분석을 수행 하기 위해 중요 하다. 이렇게 하면 샘플 테스트를 생물학을 대표 하 고 전체 방송 통신 프로토콜 수행 하기 전에 시간, 돈 및 노력을 저장. 경우 특정 샘플 특정 protein(s)를 표현 하지, 그것은 또한 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 세포의 용 해 프로토콜 계속 하기 전에 후 그들의 부재를 확인 하는 것이 중요. 프리 믹스 비율 테스트는 대부분 단백질 10 생물 학적 샘플에서 변경 되지 것으로 예상 된다 때 사용 됩니다. 우리 또한 알려진된 오염 단백질, keratins, 등 그들은 부정적인 우리의 교정 미치지 않을 제거 합니다. 우리의 정량 pipetting 오류, 등에서 발생 한 모든 오류에 대 한 해결 방법입니다. 가능 하면 우리는 특히 오류를 줄이기 위해 5 µ L 보다 큰 피 펫 볼륨을 사용 합니다. 우리는 우리가 정확한 1:1 혼합 얻을 수 있도록이 섞은 테스트의 여러 라운드를 수행. 그것은 주의 우리 않았다 때 수행 하지 섞은 비율 시험의이 유형은 immunoprecipitation 샘플을 사용 하 여 프로토콜에 대 한 우리가 변경 하려면 단백질의 큰 비율을 예상 하는 것이 중요. 이러한 경우에 섞은 테스트 결과 왜곡 것 이다. 이것은 또한 적어도 1 10 샘플의 단백질 표정 (빈 벡터, 프로테아좀 억제, 등) 같은 경우에 크게 달라질 것으로 예상 된다 어떤 실험의 사실,이 좋습니다 복제를 사용 하 여 정량 촉진 하 통계입니다. 일반적으로 이러한 유형의 샘플에 대 한 복제 3을 수행을 권장 합니다. 궁극적으로, 복제의 수는 각 샘플의 예상된 변화 기반으로 합니다.
일부 조정와 함께이 강력한 프로토콜 사용할 수 있습니다 일반적인 proteomic 파이프라인으로 단백질, 단백질 경로, 질병의 진행, 그리고 다른 생물 학적 기능을 조사. 여기에 제시 된 프로토콜 깊은 단백질 범위 정량화 동안 비율 억제를 완화 하는 강력한 기법을 제공 합니다. 사소한 수정이 프로토콜 quantitate acetylation33,34, ubiquitination, 등 인 산화 단백질 posttranslational 수정에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이러한 유형의 포괄적인 proteomics 프로젝트 유전체학, transcriptomics, 그리고 생물 학적 시스템을 이해 하 고 분자 메커니즘의 새로운 발견을 용이 하 게 하는 시스템 생물학 접근에 대 한 대사체학와 통합 될 수 있다 생체, 그리고 치료 대상 질환13,28,35,36,,3738에.
우리가 정확 하 게 전체 셀 또는 조직 lysates에서 10000 이상의 단백질을 quantitating 하는 방법을 설명 했다. 우리는 많은 생물 학적 시스템에 광범위 하 게 적용할 수 있도록이 메서드를 기대 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 모든 다른 연구소 및 시설 회원을 도움이 토론에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 부분적으로 지원 되었다 NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, 및 ALSAC 부여. MS 분석 세인트 주드 어린이 연구 병원 Proteomics 시설, 보건원 암 센터 지원 그랜트 P30CA021765에 의해 부분적으로 지원 되는에서 수행 되었다. 저자에 대 한 원고를 편집 도움말 Nisha Badders 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
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