Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering
Summary
Vi presenterer en protokoll for nøyaktig quantitate proteiner med isobar merking, omfattende fraksjoneres, Bioinformatikk verktøy og kvalitet skritt i kombinasjon med flytende kromatografi interfaced til en høy oppløsning masse spectrometer.
Abstract
Mange eksepsjonelle fremskritt har blitt gjort i massespektrometri (MS)-basert Proteomikk, med bestemte tekniske fremskritt i flytende kromatografi (Langbane) koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og isobar merking multipleksing kapasitet. Her introduserer vi en dyp-Proteomikk profilering protokoll som kombinerer 10-plex tandem masse tag (TMT) merkingsteknikker med en omfattende LC/LC–MS-/ MS plattform og etter MS databehandlingsressurs støy korreksjon til nøyaktig quantitate hele proteomes. Denne protokollen omfatter følgende hovedtrinn: protein utvinning og fordøyelsen, TMT merking, 2-dimensjonal (2D) LC, høyoppløselig massespektrometri og beregningsorientert databehandling. Kvalitetskontroll trinn er inkludert for feilsøking og evaluere eksperimentell variasjoner. Mer enn 10.000 proteiner i pattedyr prøver kan være trygt quantitated med denne protokollen. Denne protokollen kan også brukes på kvantifisering av innlegg translasjonsforskning endringer med mindre endringer. Denne multiplekset, robust metoden gir et kraftig verktøy for proteomic analyse i en rekke komplekse eksempler, inkludert cellekultur, dyr vev og menneskelige kliniske prøver.
Introduction
Fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi har ført til et nytt landskap for å studere biologiske systemer og menneskelig sykdom. Dette har tillatt en rekke målinger av genomet, transcriptome, proteom, metabolome og andre molekylære systemer bli håndgripelig. Massespektrometri (MS) er en av de mest følsomme metodene i analytisk kjemi, og dens anvendelse i Proteomikk har ekspandert etter sekvensering av det menneskelige genomet. I feltet Proteomikk har de siste årene gitt store tekniske fremskritt i baserte kvantitative analyser, inkludert isobar merking og multipleksing evne kombinert med omfattende flytende Ture, i tillegg til instrumentering fremskritt, slik at for raskere og mer presise målinger med mindre utvalg materialer kreves. Kvantitativ Proteomikk har blitt en mainstream tilnærming for profilering titusenvis av proteiner og posttranslational endringer i svært komplekse biologiske prøver1,2,3,4 , 5 , 6.
Multiplex isobar merking metoder som isobar koden for relative og absolutte kvantifisering (dvs., iTRAQ) og tandem masse tag (TMT) MS har kraftig forbedret utvalg ytelse og økt antall eksempler som kan analyseres i en enkelt eksperiment1,6,7,8. Sammen med andre baserte kvantifisering metoder, for eksempel etikett-fri kvantifisering og stabil isotop merking med aminosyrer i cellekultur (dvs.SILAC), potensialet i disse teknikkene i Proteomikk er feltet betydelig9 ,10,11. For eksempel tillater metoden TMT 10 protein prøver skal analyseres sammen i 1 eksperiment ved hjelp av 10-plex reagenser. Disse strukturelt identiske TMT koder har samme totale massen, men tung isotoper er ulikt fordelt på karbon eller nitrogen-atomer, noe som resulterer i en unik reporter ion under MS-/ MS fragmentering av hver kode, og dermed muliggjør relativ kvantifisering mellom 10 prøvene. TMT strategien brukes rutinemessig studere biologiske banene og sykdomsprogresjon cellulære prosesser12,13,14.
Tekniske forbedringer har forbedret flytende kromatografi (Langbane)-MS-/ MS systemer, både LC separasjoner og MS parametere, for å maksimere protein identifikasjon uten å ofre kvantifisering nøyaktighet. Første dimensjon utskillelse av peptider ved en separasjon teknikk med høy orthogonality til den andre dimensjonen er avgjørende i denne typen hagle Proteomikk metode for å oppnå maksimale resultater20. Høy pH reverseres-fase flytende kromatografi (RPLC) gir bedre ytelse enn konvensjonelle sterk cation exchange kromatografi20. Høy pH RPLC er kombinert med en andre dimensjon av lav-pH RPLC, er både analytisk dynamisk område og protein dekning forbedret, resulterer i evnen til å identifisere mesteparten av uttrykt proteiner under hele-proteom analyser15 ,16,17,18. Andre tekniske fremskritt inkluderer små C18 partikler (1,9 µm) og utvidet lang kolonne (~ 1 m)19. Videre inkluderer andre kjente forbedringer nye versjoner av masse spektrometre med rask skanning priser, fingerfølsomhet og oppløsning20og sofistikert bioinformatikk rørledninger for MS data mining21.
Her beskriver vi en detaljert protokoll som inneholder de nyeste metodikkene med endringer for å forbedre både følsomhet og gjennomstrømning, mens fokus på kvalitet kontrollmekanismer hele eksperimentet. Protokollen inneholder protein utvinning og fordøyelsen, TMT 10-plex merking, grunnleggende pH og syre pH RPLC fraksjoneres, høy oppløsning MS oppdagelsen, og MS behandling (figur 1). Videre implementere vi flere kvalitetskontroll trinn for feilsøking og evaluering av eksperimentell variasjoner. Denne detaljerte protokollen er ment å hjelpe forskere nye feltet rutinemessig identifisere og nøyaktig quantitate tusenvis av proteiner fra en lysate eller vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en høy gjennomstrømming protokoll for kvantifisering av proteiner med en 10-plex isobar merking strategi, som har blitt implementert med hell i flere publikasjoner12,13,14,32 . I denne protokollen, kan vi analysere opptil 10 ulike biologiske protein prøver i 1 eksperiment. Rutinemessig kan vi identifisere og quantitate godt over 10.000 proteiner med høy visshet. Selv om isobar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker alle andre lab og anlegget medlemmer for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble delvis støttet av NI H gir R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 og ALSAC. MS analysen ble utført i St. Jude Children’s Research Hospital Proteomikk anlegget, støttes delvis av NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Forfatterne takker Nisha Badders for hjelp med redigering manuskriptet.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
