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Biochemistry

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Published: November 15, 2017 doi: 10.3791/56474
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1, 1, 2, 1,2
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

Summary

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Abstract

Foram feitos muitos avanços excepcionais em espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics, com progresso técnico particular em cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e capacidade de multiplexação rotulagem isobárica. Aqui, apresentamos um protocolo de perfil profundo-proteômica que combina 10-plex marca massa em tandem (TMT) rotulagem com uma extensa plataforma de LC/LC-MS/MS e interferência computacional pós-MS correção para dosar com precisão proteomes toda. Este protocolo inclui as seguintes etapas principais: extração de proteínas e digestão, TMT rotulagem 2-dimensional (2D) LC, espectrometria de massa de alta resolução e processamento de dados computacional. Etapas de controle de qualidade estão incluídas para solução de problemas e avaliando a variação experimental. Mais de 10.000 proteínas em amostras de mamíferos podem ser quantificadas com confiança com este protocolo. Este protocolo também pode ser aplicado para a quantificação de modificações borne-translational com pequenas alterações. Este método multiplexado, robusto fornece uma ferramenta poderosa para análise proteômica em uma variedade de amostras complexas, incluindo a cultura de células, tecidos animais e espécimes clínicos humanos.

Introduction

Avanços na tecnologia de sequenciamento de última geração têm levado a uma nova paisagem para o estudo de sistemas biológicos e doenças humanas. Isto tem permitido um grande número de medições do genoma, transcriptoma, proteoma, metabolome e outros sistemas moleculares para se tornar tangível. Espectrometria de massa (MS) é um dos métodos mais sensíveis em química analítica, e sua aplicação em proteômica expandiu-se rapidamente após o sequenciamento do genoma humano. No campo da proteômica, nos últimos anos produziram grandes avanços técnicos em análises quantitativas baseadas em MS, incluindo a rotulagem isobárica e multiplexação capacidade combinada com extensa cromatografia líquida, além de instrumentação avança, permitindo para medições mais precisas, mais rápidas, com menos material de amostra necessário. Proteómica quantitativa tornaram-se uma abordagem convencional para perfil de dezenas de milhares de proteínas e modificações posttranslational em amostras biológicas altamente complexo1,2,3,4 , 5 , 6.

Métodos de rotulagem isobárico multiplexados como tag isobárica para quantificação relativa e absoluta (ou seja, iTRAQ) e marca de massa em tandem (TMT) MS grandemente melhoraram a taxa de transferência de amostra e aumentou o número de amostras que podem ser analisados em um único experiência de7,1,6,8. Juntamente com outros métodos de quantificação com base em MS, como rótulo livre quantificação e isótopo estável, etiquetando com aminoácidos em cultura de células (ou seja, SILAC), o potencial destas técnicas na proteômica campo é considerável9 ,10,11. Por exemplo, o método TMT permite 10 amostras da proteína a ser analisados em conjunto em 1 experimento usando reagentes 10-plex. Essas tags TMT estruturalmente idênticos têm a mesma massa total, mas isótopos pesados são diferencialmente distribuídos nos átomos de carbono ou nitrogênio, resultando em um íon único repórter durante a fragmentação de MS/MS de cada marca, permitindo a quantificação relativa entre as 10 amostras. A estratégia TMT é rotineiramente aplicada para estudar processos celulares12,13,14, vias biológicas e progressão da doença.

Substanciais melhorias técnicas reforçar sistemas de cromatografia líquida (LC) – MS/MS, tanto em termos de separações de LC e parâmetros de MS, para maximizar a identificação da proteína sem sacrificar a precisão de quantificação. Primeira dimensão separação de peptídeos por uma técnica de separação com alta ortogonalidade para a segunda dimensão é fundamental neste tipo de método de proteomics espingarda para alcançar resultados máximos20. Cromatografia líquida de alta-pH fase reversa (SBST) fornece um melhor desempenho do que o de cromatografia de permuta catiónica forte convencional20. Quando alta-pH SBST é combinado com uma segunda dimensão da baixo-pH SBST, tanto a gama dinâmica analítica e a cobertura de proteína são melhoradas, resultando na capacidade de identificar a maior parte das proteínas expressas ao executar todo-proteome análises15 ,16,17,18. Outros avanços técnicos incluem pequenas partículas C18 (1,9 µm) e prolongado tempo de coluna (~ 1m)19. Além disso, outras melhorias notáveis incluem novas versões de espectrómetros de massa, com taxas de varredura rápida, melhorou a sensibilidade e resolução20e encanamentos de Bioinformática sofisticados para MS dados mineração21.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que incorpora as mais recentes metodologias com modificações para melhorar a sensibilidade e taxa de transferência, enquanto se concentra nos mecanismos de controle de qualidade durante todo o experimento. O protocolo inclui extração de proteínas e digestão, TMT 10-plex rotulagem pH básico e fracionamento de pH ácido SBST, deteção de MS de alta resolução e processamento de dados do MS (Figura 1). Além disso, implementamos várias medidas de controle de qualidade para solução de problemas e avaliando a variação experimental. Este protocolo detalhado destina-se a ajudar pesquisadores novo ao campo rotineiramente identificar e dosar com precisão milhares de proteínas de um lisado ou tecido.

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Protocol

atenção: favor consultar todas as folhas de dados de segurança relevantes (i.e., MSDS) antes do uso. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar este protocolo.

Nota: um conjunto de reagente TMT 10-plex rótulo isobárica é usado neste protocolo para a quantificação do proteome de 10 amostras.

1. preparação de tecidos/células

Nota: é fundamental para coletar amostras em tempo mínimo, em baixa temperatura para manter as proteínas no seu estado biológico original.

  1. Lavagem aderentes as células (por exemplo, células HEK 293) em uma placa de 10 cm duas vezes com 10ml de gelo frio fosfato salino (PBS). Raspar e coletar células (~ 2 x 10 6 células) em 1 mL de PBS. Transferir para tubos de 1,5 mL e remover PBS após centrifugação a 600 x g durante 5 min à 4 pelotas de células de C. loja °-80 ° c até Lise.
    Nota: Um experimento piloto é frequentemente realizado para examinar o rendimento de proteína. Cerca de 1 mg de proteínas podem ser extraído de 10 x 10 6 células de mamíferos ou de uma placa de 15 cm, com 80% confluência.
  2. Alternativamente, lyse pilhas aderentes em sua placa adicionando lise diretamente para a placa após a lavagem. Coletar lysates em tubos de 1,5 mL e use a descrição do protocolo na etapa 2.5.
  3. Coletar células de suspensão em tubos de 15 mL, lavar duas vezes com 10 mL de PBS frio gelo, transferir para tubos de 1,5 mL e centrifugar a x 600 g para remover PBS. Remova as etapas de lavagem completamente para manter a concentração desejada de ingredientes de tampão de Lise, PBS. Loja pelotas de célula a-80 ° C até Lise.
  4. Recolher e pesar tecidos rapidamente. Mantêm os tecidos em nitrogênio líquido imediatamente após dissecção e loja a -80 ° C.
    Nota: O rendimento de proteína dos tecidos é de cerca de 5% a 10% do peso do tecido
  5. usar tamanhos de tecido homogêneo e regiões anatômicas para as 10 amostras para reduzir a heterogeneidade da amostra. Eliminar a contaminação do sangue enxaguando amostras duas vezes com 1 mL de PBS frio de gelo para evitar proteínas altamente abundante sangue afetando a quantificação de proteínas e análise de dados downstream.

2. Extração de proteínas, controle de qualidade Western Bloting, digestão em solução e peptídeo dessalinização

Nota: manipulação de cada uma das 10 amostras da mesma maneira durante qualquer etapa antes que o pool de amostras TMT-etiquetado é essencial para reduzir variação.

  1. Fazer tampão de lise (50 mM HEPES [pH 8.5], ureia 8m e 0,5% de sódio Deoxycholate do) no dia do experimento.
    Nota: Desnaturação de proteína parcial durante lise amostra afeta a eficiência de digestão de proteínas.
  2. Add lise de buffer para que o rácio de reserva para o volume de amostra é 10:1 e ~ 20% do volume final de grânulos de vidro (0,5 mm de diâmetro) de aglomerados de células ou tecidos (por exemplo, volume 10: 1 relação entre buffer e amostras) para obter uma concentração final de proteína de 5 a 10 mg/mL. Manter todas as 10 amostras de mesma concentração, considerando o número de células utilizadas ou tecido peso de cada amostra.
  3. Manter concentração de ureia em 8 M pela adição de ureia sólida para a amostra. Lembre-se de considerar o volume do pellet de células ou tecidos ao calcular a quantidade de ureia sólida para adicionar à amostra para obter a concentração de 8 M.
    Nota: Un-fresco ureia buffer pode introduzir modificação química artificial (ou seja, carbamylation de proteína) e afetar negativamente o número de peptídeos identificados. Ureia ocupa um volume considerável (100 mg de ureia ocupa ~ 73 µ l de solução).
  4. Manter os detritos insolúveis no lisado para permitir a digestão de proteínas insolúveis 23.
  5. Lisar as amostras em um liquidificador a 4 ° C, a velocidade de 8 para 30 s, resto dos 5 s e repetir 5 vezes ou até que as amostras são homogeneizadas. As amostras também podem ser lysed num Vortex para 30 s à temperatura ambiente (RT) com um 30 s período no gelo para ~ 10 ciclos de refrigeração. Ajustar as condições de Lise conforme necessário, dependendo do tipo de amostra.
  6. Mistura o lisado poço sem centrifugação e 2 pequenas alíquotas (~ 15 µ l cada). Use 1 alíquota a concentração de proteína de medida e 1 alíquota para executar a validação de controle positivo, realizando análise ocidental do borrão. Manter a restante grande alíquota para análise proteômica.
    7. Concentração de proteína de medida por um ensaio de quantificação de proteína padrão ou um manchado de Coomassie curto de sódio Dodecil sulfato gel de poliacrilamida (10%) 22 com albumina de soro bovino (BSA) como um padrão de
  7. . Use um padrão de BSA com um alto grau de precisão de concentração conhecida. Para atingir o mais alto nível de precisão, realizar a análise de aminoácidos da norma BSA.
    Nota: Outros padrões precisos podem estar disponíveis. As concentrações de proteína também podem ser estimadas pelo número de células ou tecidos pesos. Embora recomenda-se 1 mg de proteína (100 µ g/amostra), a análise pode ser realizada com menos de 100 µ g de proteína (10 µ g/amostra).
  8. Adicionar 100% acetonitrila (ACN) a obter uma concentração final de 10% do Grupo ACN e LysC protease com uma enzima-substrato para relação de 1: 100 (w/w) para digerir proteínas sob altamente desnaturação condições em RT para h 2 1. Adicionar ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 1 mM para reduzir as ligações dissulfureto em proteínas e incubar durante 1 h. digestão LysC executar em uma concentração final de ureia de 7.2 M.
  9. Diluir as amostras de 2 M de ureia com 50 mM HEPES (pH 8,5) e ainda mais digerir amostras com tripsina em RT para 3h ou durante a noite em uma tripsina a proporção de proteína de 01:50 (w/w). Uso aproximadamente 2 µ g de tripsina de 100 µ g de proteína e tripsina concentração de aproximadamente 10 ng / µ l.
    Nota: Fatores que podem levar a digestão do trypsin ineficiente são questões de pH, tripsina inativa ou o uso de uma relação inadequada da enzima ao substrato.
  10. Adicionar TDT para produzir 1 mM e reduzir ainda mais os peptídeos para 2h no RT.
  11. Add iodoacetamide (IAA) para alcançar a 10 mM. Incubar a RT por 30 min no escuro para alquilação Cys-contendo peptídeos.
  12. Quench IAA não tenha reagido, adicionando TDT para atingir 30 mM e incube por 30 min em RT.
  13. Verificar a eficiência da digestão do trypsin, examinando uma pequena alíquota de cada amostra. Do desalt usando uma ponta de pipeta de 10 µ l com cromatografia de mídia incorporada no espaço morto, de acordo com o fabricante ' protocolo s. Analisar cada amostra por LC-MS/MS. LC-MS/MS parâmetros são os mesmos como na etapa 5, com a exceção de que o gradiente é 10 min 23.
  14. Realizar uma pesquisa de banco de dados para dados brutos de MS (veja mais detalhes na etapa 6) usando 4 decotes perdidas como um parâmetro de busca.
    Nota: Se o número de perdeu decotes é > 10%, isso pode indicar a digestão incompleta do trypsin. Isto afetará negativamente os resultados a jusante. Este é um passo crítico controle de qualidade (QC).
  15. Digerir amostras novamente se o decote não atendido é > 10% adicionando um adicional 10 µ l de tripsina com as amostras.
  16. Acidificar as amostras pela adição de ácido trifluoroacético (TFA) para atingir a concentração de 1%. Medir o pH, usando uma faixa de pH. Verifique se que o pH é apostoWeen 2 e 3. Adicione mais TFA gota sábia (1 µ l) conforme necessário até que o pH correto é alcançado.
  17. Centrifugar 20.000 x g em RT por 10 min e recolher o sobrenadante.
  18. Rotação de capacidade de 0,5 a 60 µ g de lavagem colunas contendo resina de fase reversa C18 com 0,25 mL de metanol se usando 100 µ g amostras. Lavar 0,03 a 30 µ g capacidade rotação colunas com 0,25 mL de 60% TFA ACN/0.1% se usando 10 µ g amostras. Centrifugue a rotação colunas a 500 x g, durante 30 s.
  19. Equilibrar colunas com 0,5 mL de 0,1% TFA e remover por centrifugação a 500 x g durante 30 s.
  20. Carregar amostras em colunas e vincular as amostras para colunas por centrifugação a 100 g de x por 3 minutos ou até passa toda a amostra através da coluna.
  21. Adicionar 0,5 mL de 0.1% TFA para colunas e centrifugar 500 x g por 30 s.
  22. Adicionar 125 µ l de 60% ACN/0.1% TFA para cada coluna e eluir por centrifugação a 100 x g durante 3 min. Certifique-se de toda a solução foi passar a coluna.
  23. Secar os eluentes em um concentrador a vácuo. Assegurar que as amostras são completamente seco e não líquido permanece nos tubos. Loja a-80 ° C até posterior análise.

3. Rotulagem de peptídeos TMT

Nota: é fundamental para garantir que todas as amostras são totalmente rotuladas pelos reagentes TMT. Vários fatores (por exemplo, quantidade de reagentes TMT usado, valor de pH e precisão de quantificação de proteínas) podem afetar TMT etiquetagem de eficiência, que alterará negativamente todos os resultados a jusante.

  1. Reconstituir cada amostra de peptídeo demolhado em 50 µ l de tampão HEPES de 50mm (pH 8,5). Verificar o pH e certifique-se de que é entre 7 e 8.
    Nota: A amostra pode ser ácida, se não secou completamente após a etapa do desalting, que afetará a eficiência rotulagem.
  2. Manter ~ 1 µ g de cada amostra sem rótulo para uma subsequente TMT rotulagem eficiência teste, conforme descrito na etapa 3.3.
  3. Dissolver os reagentes TMT ACN anidro e etiquetar amostras de peptídeo seguindo o fabricante ' instruções s. Incubar os reagentes em RT para 1 h.
  4. Executar um teste de eficiência de rotulagem QC TMT do desalting µ g ~ 1 de cada amostra TMT-etiquetadas e - sem rótulo usando pontas de pipetas 10 µ l com mídia de cromatografia incorporado de acordo com o fabricante ' protocolo s. Analisar amostras sem rótulo e TMT-rotulado por LC-MS/MS.
    Nota: Parâmetros de LC-MS/MS são os mesmos como na seção 5, com a exceção de que o gradiente é de 10 min.
  5. Examinar os dados brutos para garantir que os peptídeos sem rótulo não são detectados nas amostras etiquetadas, garantindo a eficiência de rotulagem completa ( Figura 2). Faça isso por 6 a 10 de peptídeos separados verificar a eficiência de rotulagem.
  6. Saciar a reação adicionando 4 µ l de hidroxilamina 5% e incube por 15 min.
  7. Misturar uma alíquota pequenas e igual volume (2 µ l) de cada amostra de TMT-rotulados. Do desalt usando pontas de pipetas 10 µ l com mídia de cromatografia incorporado. Analise as amostras por LC-MS/MS, conforme descrito no passo 3.4. Use o programa de software de salto (um banco de dados aberto algoritmo de busca que converte arquivos raw do MS em tandem em uma lista de peptídeos e proteínas) determinar a proporção de concentração relativa de todas as 10 amostras pelas intensidades de marca TMT de todos identificados peptídeos.
    Nota: Este teste de relação de pré-mistura QC é útil para determinar a proporção correta para a mistura igual antes a partilha final, pois podem ocorrer erros de pipetagem que vai mudar as concentrações e a etapa de quantificação de proteína não pode ser sempre exata. Também é a melhor maneira de garantir que a quantidade de cada uma das 10 amostras usadas para a mixagem final são todos em uma relação de igualdade, conforme descrito na etapa 3.5.
  8. Repetir quantas vezes for necessário para obter uma proporção de 1:1 em todas as 10 amostras.
  9. Igualmente misturar as 10 amostras de acordo com os resultados do teste de relação de pré-mistura. Usar a amostra com a concentração mais baixa, como a linha de base para ajustar os volumes das outras 9 amostras.
  10. Remover os subprodutos da reação de resfriamento da amostra TMT-etiquetadas em pool por dessalinização.
    11. Cartuchos de extração
  11. lavagem 1 mL de fase sólida contendo 50 mg de adsorvente por coluna com 1 mL/0,25 mL de metanol se usando 100 µ g amostras. Lavar 0.5 - para 60-µ g capacidade C18 rotação colunas com 1 mL/0,25 mL de 60% TFA ACN/0.1% se usando 10 µ g amostras. Centrifugue colunas a 500 x g, durante 30 s.
  12. Equilibrar colunas com 0,5 mL de 0,1% TFA e remover por centrifugação a 500 x g durante 30 s.
  13. Carregar amostras em colunas e vincular por centrifugação a x 100 g por 3 min ou até que todos da amostra passou através da coluna.
  14. Adicionar 0,5 mL de 0.1% TFA para colunas e centrifugar 500 x g por 30 s.
  15. Adicionar 125 µ l de 60% ACN/0.1% TFA para cada coluna e eluir por centrifugação a 100 x g, durante 3 min. Certifique-se de toda a solução passou através da coluna.
  16. Secar os eluentes em um concentrador a vácuo. Assegurar que as amostras são completamente seco e não líquido permanece nos tubos. Loja a-80 ° C até posterior análise.

4. Extensa de alta resolução, básico pH LC Prefractionation

  1. Set até 2 colunas C18 conectadas, contendo partículas de híbrido de etileno com ponte (4,6 mm x 25 cm, totalizando 50 cm; Tamanho de partícula 3,5 µm) e usar uma bomba de LC microlitro fluxo alto desempenho para fracionamento.
    Nota: O uso de 2 colunas aumenta a carga de peptídeo e não melhora necessariamente cromatografia. Para amostras contendo ≤ 200 µ g de peptídeos, 1 coluna é suficiente.
  2. Lavar o loop de 100 µ l com adições posteriores de µ l 300 cada de metanol e tampão A água (formiato de amônio 10 mM, pH 8.0).
  3. Lavar as colunas com 100 µ l de água, metanol, ACN e igualmente mista isopropanol e equilibrar a coluna no buffer de 95% A por 2 h.
  4. Solubilizar a amostra demolhado em pool peptídeo TMT-etiquetadas em 65 µ l de tampão r. Verifique se que o pH da amostra é ~ 8.0. Se ainda ácida, use hidróxido de amónio para ajustar o pH para 8,0.
  5. Fractionate amostra usando o seguinte gradiente com buffer B (um mais de 90% do buffer ACN): 15% a 20% por 15 min, 20% a 35% para 100 min e 35% a 50% por 30 min. definir o coletor de fração para coletar frações cada 2min, incluindo o tempo de carregamento. Defina a taxa de fluxo de 0,4 mL/min. Consulte referência 29 e Figura 1 para um cromatograma representativo.
  6. Coletar um total de 80 frações e secar 40 fracções (todas as outra fração) com um concentrador de vácuo a secura completa.
  7. Usar as 40 amostras secas para análise de LC-MS/MS.
  8. Analisar todas as 80 frações por LC-MS/MS para atingir a cobertura de proteome ultraprofundas.

5. Preparação de LC-MS/MS e parâmetros

Nota: quantificação com base em TMT, peptídeo íons são isobárica e aparecem como 1 massa em uma varredura MS1. No entanto, eles são quantificados de acordo com a intensidade de íons repórter (10 íons de repórter exclusivo) no scan MS/MS depois que o íon de peptídeo foi fragmentado com maior dissociação de colisão de energia (HCD). Os rácios de íon TMT repórter podem ser suprimidos de eluição co de íons TMT-rotulado 24. Estreitando o íon isolamento janela 25, purificação de gás-fase 26, o MultiNotch MS3 método 27 ou fracionamento extensivo com LC multidimensional e gradientes longos (4-8 h) 28 são abordagens alternativas.

  1. Pack 75 µm de diâmetro interno (ID) esvazie colunas com 1,9 µm de resina C18 para 30 a 40 cm de comprimento (volume de cama ~1.3 µ l).
  2. Aquecer as colunas a 65 ° C com um aquecedor de portfólio de borboleta para reduzir a contrapressão e prevenir sobre pressionando da ultraelevado-pressão sistema de cromatografia líquida (UPLC). Bobina de coluna 2 a 3 vezes dentro do aquecedor de borboleta para garantir que o comprimento da cama toda coluna é aquecido. A coluna para o interior do aquecedor, tomando cuidado para não gravar por cima do sensor de temperatura no interior do aquecedor de fita.
    Nota: O aquecedor de portfólio de borboleta é montado e colado em um pedaço Custom-Made de plexiglass anexados à fase XYZ do instrumento.
  3. Preparar um (3% dimetil sulfóxido e 0,2% ácido fórmico) do buffer e buffer B (um mais 67% do buffer ACN) e lavar as colunas com buffer de 95% B. Em seguida, totalmente equilibrar colunas em tampão de 95% A (volumes de pelo menos 3 coluna). Usar uma taxa de fluxo de ~0.25 µ l/min e contrapressão de 280 para 320 bar
  4. Examinar a qualidade do sistema de LC-MS/MS executando 100 ng de rato cérebro peptides (ou padrão de nossa escolha) duas vezes antes de analisar as amostras TMT-rotulados. Verifique os seguintes parâmetros com frequência para garantir a coleta de dados de alta qualidade: levantamento de intensidade de sinal MS (entre e8 e e9 para base pico de intensidade), qualidade de espectros de MS/MS (uma boa representação de íons y e b), largura de pico (s. 12-22), tempo de retenção total, Pressão do sistema LC (aumento de pressão > 50 bares indica uma coluna suja ou entupido emissor ponta) e variabilidade de execução para execução (picos idênticos devem ser < 30 s entre execuções).
    Nota: Para resolver os íons de perto-isobárica repórter dos reagentes TMT 10-plex (6.32 mDa diferença), a resolução MS/MS deve ser definida como pelo menos 30.000 em 400 m/z. HCD é normalmente usado para fragmentação de íon TMT10-plex repórter, que não seja sujeito à regra de um terço que se aplica a dissociação induzida de colisão (CID) em instrumentos de ion trap.
  5. Clean e calibrar o instrumento MS regularmente e usar buffers de LC frescos para melhorar o desempenho do sistema.
  6. Reconstituir os peptídeos secados da separação básica pH em 5% TFA.
  7. Carregar ~0.2 µ g na coluna enquanto o buffer de fluxo 5% r.
  8. Elute com 15% a 45% do buffer B em 150 min. Como ponto de partida, use o seguinte gradiente: tempo 0, tampão B 5%; tempo 2, tampão B 15%; hora de 135, tampão B 45%, 145, tampão B 70%; e tempo, 150, tampão B 95%. Ajuste o gradiente ligeiramente para frações de SBST cedo e tarde pH básico depois de analisar cromatogramas de pico base.
  9. Operar o espectrômetro de massa no modo dependente de dados com uma varredura de pesquisa no analisador massa ion trap (400-1600 m/z; 60.000 resolução; alvo de controle (AGC) 1 x 10 6 ganho automático; tempo de íon máxima de 50 ms; e modo de centroide). Executar digitalizações de alta resolução de 20 MS/MS (resolução 60.000, alvo AGC 1 x 10 5, tempo de íon máximo de ~ 100 ms, 35 energia de colisão de HCD normalizado, 0,4 m/z janela de isolamento e exclusão dinâmica de 20 s).
    Nota: Dissociação de transferência de elétrons (ETD) não é recomendada para TMT10-plex reagentes porque ETD clivagem locais são diferentes do HCD, resultando em sobreposição de íon do repórter. Além disso, ETD não é eficaz como HCD porque peptídeos tryptic tipicamente geram Estados de carga + 2, e hem é mais eficiente em Estados mais elevados de carga.

6. Análise de dados do MS

Nota: descrevemos a análise de dados com o programa de software de salto. No entanto, a análise dos dados pode ser realizada com outros programas comercialmente disponíveis ou livre.

  1. Motor JUMP 21, que combina uma pesquisa de banco de dados baseado no padrão e um sequenciamento baseado em marcas de novo para melhorar a sensibilidade e especificidade de busca de arquivos raw de processo do espectrômetro de massa com o híbrido baseado em marcas.
  2. Converter dados brutos de mzXML Formatar e busca MS2 espectros contra o alvo-chamariz UniProt humano banco de dados (ou outros adequados espécie-específicos) para calcular a taxa falsa da descoberta (FDR).
    3. Realizar pesquisas usando-se uma tolerância de 10 ppm em massa de íons tanto o precursor e o fragmento de
  3. . Defina outros parâmetros de pesquisa totalmente tryptic restrição com 2 decotes perdidas máximos, 3 sites de modificação máxima por peptídeo e a atribuição de um b e y íons para marcar os peptídeos. Conjunto de modificações estáticas a TMT tags sobre resíduos de Lys e termini N (+229.162 Da) e carbamidomethylation de resíduos de CIS (+57.021 Da). Conjunto dinâmicas modificações incluem oxidação Met (+15.994 Da), que é um artefato de peptídeo comum resultante de manuseio de amostras.
  4. Filtrar dados pelos seguintes critérios: 7 comprimento mínimo do peptide de aminoácido, precisão de m/z (por exemplo, 5 ppm) e correspondência de Pontuação (Pontuação J e deltaCn). Grupo de peptídeos de acordo com o comprimento do peptide, trypticity e cobrar o estado.
  5. Usar um nível adicional de filtragem por correspondência Partituras para reduzir a proteína FDR para abaixo de 1%. Identificado por um único Conde espectral de proteínas requerem uma maior pontuação correspondente.
  6. Para peptídeos compartilhados por vários membros de uma família de proteínas, cluster membros a proteína correspondente em 1 grupo.
    Nota: De acordo com o princípio da parcimônia, o grupo é representado pela proteína com o maior número de peptídeos atribuídos e outras proteínas igualadas por peptídeos exclusivo 1.
  7. Dosar proteínas somando repórter íon contagens através de todas as correspondências de espectro de peptídeo correspondente (PSMs) usando um programa incorporado a suite de software salto.
  8. Para cada um aceite PSM, extrair e corrigir as intensidades de íon TMT repórter de acordo com a distribuição isotópica de reagentes a rotulagem e o viés de carregamento, que é calculado a partir dos dados de quantificação globais PSM. PSMs do filtro com baixa intensidade e nível de ruído elevado com limiares definidos pelo usuário durante a quantificação.
  9. Calcular um sinal relativo entre cada íon de repórter e a média de todos os íons de repórter 10. Resumir os sinais relativos dos PSMs para as proteínas identificadas. Converter estes sinais relativos aos sinais absolutos multiplicando a intensidade do íon de repórter em média dos PSMs top 3 em proteínas correspondentes.
  10. Usar uma abordagem computacional pós-MS corrigir interferências. Supondo que a intensidade de íon y 1 é proporcional à intensidade do íon de repórter, calcular a relação linear de scans limpos e derivam o nível de interferência a intensidade y1ion contaminados em varreduras barulhento 23.
    Nota: Para TMT-rotulado tryptic peptídeos, resíduos K-TMT e R são 2 tipos de íons y 1 (Da 376.27574 e Da 175.11895, respectivamente) em scans MS2. Se apenas 1 y 1 íon é detectado e é consistente com o peptídeo identificado, o MS2 é considerado varredura limpa ( Figura 3A). Se os dois y1ions são detectados, o MS2 é considerado uma varredura barulhenta.
  11. Exportar os valores de quantificação de proteína para um programa de software de planilha para análise adicional. Use comparações emparelhadas ou análise de variância para identificar proteínas diferencialmente expressas.

7. Validação de dados do MS

Nota: para avaliar a qualidade dos dados do MS, pelo menos 1 método de validação deve ser executado antes de prosseguir com experiências biológicas demoradas.

  1. Examinar manualmente os espectros de MS/MS de proteínas de interesse para validar a sequência do peptide e quantificação de íon repórter TMT.
  2. Uso conhecido dados de quantificação de proteína para confirmar os resultados de MS.
  3. Verificar alterações de proteína com abordagens baseadas em anticorpos (por exemplo, westeanálise de Borrão e imuno-histoquímica do RN).
  4. Quimicamente sintetizar os peptídeos de interesse e usá-los como internas normas para confirmar a identificação de peptídeos nativos.
    Nota: Seus padrões de MS/MS e tempo de retenção durante o LC-MS/MS devem ser idênticos.
  5. Verificar alterações de proteínas com uma abordagem orientada de MS.

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Representative Results

Usamos uma mistura de peptídeo de espécies descritas anteriormente para analisar sistematicamente o efeito da compressão ratio em 3 etapas principais do protocolo, incluindo pre-MS fracionamento, MS configurações e correção post-MS23. O fracionamento de pre-MS foi avaliado e otimizado usando uma combinação de pH básico SBST e pH ácido SBST. Para análise de post-MS, foram considerados apenas peptídeos espécie-específicos. Usamos este modelo de interferência para examinar um número de parâmetros na LC/LC-MS/MS, incluindo a janela de isolamento MS2, resolução on-line de LC, quantidade de carregamento de pH ácido on-line SBST e resolução do SBST off-line de alta-pH (veja a Figura 3 na referência 29).

Para alterar a resolução durante a LC off-line, estamos separados os peptídeos isobárico etiquetados em 320 fracções e então combinados frações selecionadas juntos para ajustar o poder de separação. Resolução de LC off-line foi testada usando um número de subconjuntos de fração coletados (1, 5, 10, 20, 40, 80 e 320), enquanto os níveis de interferência de monitoramento. Achamos que os níveis de interferência diminuiu gradualmente de 16,4% para 2,8%, indicando que fracionamento extensivo durante a separação de LC off-line um pouco aliviaram o problema de peptídeos de eluição co mas não foi capaz de remover completamente o interferência.

Em seguida, avaliamos o efeito da janela de isolamento MS2 na interferência. Nós determinado experimentalmente que a interferência era aproximadamente proporcional ao tamanho da janela do isolamento, com o acordo anterior estudos29,30. Por exemplo, uma 4-fold diferença de tamanho da janela (Da 1.6 a 0,4) resultou em um ~ 4-fold diferença de nível de inferência (14,4% para 3,7%). Nós também determinou a quantidade ideal de carregamento na coluna para análise de MS e usavam essa informação para negar mais interferência. Reduzimos a interferência de 9,4% para 3,3% em carregar a quantidade adequada da amostra. Carregar muita amostra pode levar ao pico ampliando31 e, portanto, aumentar o nível de interferência, resultando em precisão de quantificação de proteína reduzida. Por último, nós aperfeiçoamos a resolução SBST on-line, alterando os gradientes comprimentos (1, 2 e 4 h) e usando uma coluna longa (~ 45 cm). Nós encontramos que um gradiente de 4h quase eliminou a interferência (até 0,4%) mas também adicionado tempo de instrumento. Os parâmetros otimizados revelaram uma janela estreita isolamento (0,4 Da), ~ 100 ng de amostra carregada na coluna e fracionamento de nível médio (~ 40 x 2 h, 3,3 dias). Também mostramos que, usando uma estratégia de correção de post-MS baseado em computador melhorámos precisão quantitativa, ao determinar os rácios de proteína (Figura 3B).

Nossos resultados indicam que o uso de otimizado parâmetros LC-MS e post-MS correção pode fornecer um perfil minucioso proteomic e praticamente eliminar a interferência que muitas vezes é produzida por técnicas de rotulagem isobárica para quantificação da proteína.

Figure 1
Figura 1: esquema da análise de perfil de todo-proteome por TMT-LC/LC-MS/MS. Dez amostras biológicas foram lysed, digeridas e rotuladas com 10 diferentes etiquetas TMT, igualmente agrupadas e fracionadas em 80 fracções por pH básico off-line reverso-fase da cromatografia líquida (LC). Todos os outra fração foi ainda mais separada por SBST ácida e analisada on-line com um espectrômetro de massa de alta resolução. Os arquivos raw de MS/MS foram processados e procurou um banco de dados Uniprot para identificação de peptídeos e proteínas. As proteínas foram quantificadas de acordo com as intensidades relativas das tags TMT. Finalmente, as proteínas identificadas e quantificadas foram submetidas para análise de dados integrativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: TMT rotulagem exame de eficiência. Ambos TMT-etiquetadas e seus correspondentes unlabeled amostras foram analisadas por LC-MS/MS separadamente para examinar TMT etiquetagem de eficiência. Para a rotulagem de TMT completo, pico (A), o peptídeo sem rótulo foi completamente ausente na amostra rotulada, (B) Considerando que o peptídeo TMT-rotulado estava presente apenas em amostra rotulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: uma abordagem computacional para a remoção da interferência após a coleta de dados de MS. (A) MS2 todos os exames foram divididos em varreduras barulhentas (painel direito) e limpo (painel esquerdo). Varreduras barulhentas exibem ambos y1 íons de K e R (1 de um peptídeo de alvo e os outros de contaminar peptídeos). (B) Peptídeos de Escherichia coli individualmente foram rotulados com 3 diferentes reagentes TMT e agrupados em 1:3:10 rácios. Aproximadamente 20-fold mais peptídeos de rato foram adicionados como pano de fundo. As intensidades relativas somadas dos peptides e. coli nos 3 grupos revelaram que a y1 ion baseado correção é mais exata para quantificação de TMT-baseado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Descreveremos um protocolo de alta produtividade para a quantificação de proteínas com uma 10-plex isobárica rotulagem estratégia que tem sido implementado com sucesso em várias publicações12,13,14,32 . Neste protocolo, podemos analisar até 10 amostras de diferentes proteínas biológicas no 1 experimento. Nós rotineiramente pode identificar e dosar bem sobre 10.000 proteínas com alta confiança. Apesar de rotulagem isobárica é uma tecnologia eficaz para dosar as proteínas, é limitada pela compressão de relação que pode levar à imprecisão quantitativa. Nosso protocolo usando várias estratégias, como a otimização de LC/LC e configurações de MS/MS em combinação com y1 íon-baseado post-MS correção, remove eficazmente a maioria dos efeitos de interferência e portanto, aumenta consideravelmente a precisão de quantificação da proteína.

Para quantificação da proteína, a suíte de salto de funções de programas em um número de maneiras. Nós medimos a impureza isotópica para cada lote de reagentes comprados, que difere ligeiramente os valores relatados em certificados fornecidos pelo fornecedor. A impureza isotópica medida é usada para corrigir as intensidades de íons de repórter no software do salto. Uma proteína é geralmente quantificada por muitos PSMs com diferentes intensidades absolutas que são influenciadas por vários fatores, tais como a eficiência de ionização. Porque a influência dos fatores é desconhecida, espectros de massa revelaram apenas a abundância relativa de íons de repórter em um ensaio TMT. A abundância relativa de íons repórter é calculada dividindo-se a intensidade de cada íon de repórter pela intensidade média de todos os 10 repórteres. Para fornecer o melhor representante "sinal absoluto" da proteína, calculamos uma média das intensidades relativas de 3 PSMs com as intensidades absolutas mais altas da proteína e a média da intensidade mais forte para estimar o absoluto absoluta sinal da proteína. Definimos essas etapas como rescaling. A correção de1 y é universalmente aplicável para quaisquer ensaios TMT; no entanto, em alguns casos nós pode não corrigir para peptídeos com espectros de MS/MS, contendo o íon de1 y. No entanto, encontramos que ~ 90% dos espectros têm os íons y1 da lisina e arginina. Para compensar a interferência causada por co de eluição peptídeos que têm os mesmos resíduos de C-terminal como o peptídeo identificado, o nível de interferência estimado foi essencialmente duplicou e usado para a correção. Esta suposição foi baseada em evidências empíricas que nós coletamos sobre numerosos experimentos TMT, em que observamos o mesmo nível de intensidade por y1 em K e R-contendo peptídeos.

Interferência pode ser reduzida através de muitos métodos diferentes o que descrevemos neste protocolo, tais como a abordagem multinotch MS3. Todos estes métodos são válidos e têm os seus méritos individuais. Em última análise, a metodologia utilizada depende de uma série de fatores, incluindo mas não se limitando a quantidade de amostra, disponibilidade do instrumento (i.e., tipo de instrumento e tempo necessário para analisar amostras), resultados desejados (ou seja, o número de proteínas identificadas) e quantificação de precisão necessária.

Para garantir os resultados mais precisos, é importante seguir os passos de controle de qualidade em todo o protocolo. Estes incluem o uso de padrões precisos para quantificação da amostra (por exemplo, BSA que submeteu-se a análise de aminoácidos), testar a eficiência de rotulagem do reagente TMT, determinação da eficiência da digestão do trypsin, realizando um teste de relação de pré-mistura para assegurar uma mistura igual de todas as 10 amostras e usando um software para corrigir qualquer viés de carregamento. Nos casos em que uma proteína conhecida ou múltiplas proteínas espera-se que apresentam alterações de expressão entre amostras individuais, é importante realizar análise ocidental do borrão após a lise da célula inicial para confirmar que estas alterações estão presentes e podem ser detectadas. Isso garante que as amostras representam a biologia a ser testado e economiza tempo, dinheiro e esforço antes de executar o protocolo inteiro de TMT. Se uma determinada amostra é esperada para não expressar certos antisentido, também é importante usar análise ocidental do borrão para confirmar sua ausência após lise antes de continuar com o protocolo. O teste de relação de pré-mistura é usado quando a maioria das proteínas são esperados para não alterar entre as 10 amostras biológicas. Também removemos proteínas contaminantes conhecidas, como a queratina, então eles não afetaria negativamente a nossa correção. Nosso método de quantificação corrigido por quaisquer erros que possam ter ocorrido erros de pipetagem, etc. Quando possível, usamos especificamente pipeta volumes superiores a 5 µ l para reduzir erros. Foram realizadas várias rodadas deste teste pré-mistura, para garantir que obtivemos uma mistura exata de 1:1. É importante notar que nós não executar esse tipo de teste de relação de pré-mistura quando usando imunoprecipitação amostras para o protocolo, como esperávamos uma grande porcentagem das proteínas para mudar. Em tais casos, o teste de pré-mistura iria distorcer os resultados. Isto também é verdade de qualquer experimento em que pelo menos 1 das 10 amostras deverá variar muito na expressão da proteína (vetor vazio, inibição do Proteassoma, etc.) em tais casos, é altamente recomendável usar repetições para facilitar a quantificação estatísticas. Normalmente recomendamos realizar 3 Replica para esses tipos de amostras. Em última análise, o número de repetições baseia-se a variabilidade esperada de cada amostra.

Com alguns ajustes, este protocolo robusto pode ser usado como um pipeline de proteomic geral para investigar proteínas proteína e dos percursos, progressão da doença e outras funções biológicas. O protocolo apresentado aqui fornece uma técnica poderosa para obter cobertura de proteína profunda e aliviar a supressão da relação durante a quantificação. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser facilmente adaptado para dosar modificações posttranslational proteína, como a fosforilação, ubiquitination e acetilação33,34. Esses tipos de projetos de proteomics abrangente podem ser integrados com a genômica, transcriptomics e possivelmente metabolómica para uma abordagem de biologia de sistemas para entender os sistemas biológicos e facilitar novas descobertas dos mecanismos moleculares, biomarcadores e alvos terapêuticos em doenças13,28,35,36,37,38.

Temos demonstrado um método para dosar com precisão mais de 10.000 proteínas de células inteiras ou tecidos lisados. Esperamos que este método seja amplamente aplicável a muitos sistemas biológicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores graças a todos os outros membros de laboratório e instalações para discussão útil. Este trabalho foi parcialmente financiado pela NI H concede R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 e ALSAC. A análise de MS foi realizada em Hospital Proteomics instalação St Jude Children, parcialmente financiado por subsídio NIH Cancer Center Support P30CA021765. Os autores agradecer Nisha Badders ajuda com edição do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

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Bioquímica edição 129 bioinformática interferência rotulagem isobárica cromatografia líquida de LC-MS/MS espectrometria de massa proteômica TMT
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