Summary
Vi præsenterer her, nematode Caenorhabditis elegans som en alsidig host model til at studere mikrobielle interaktion.
Abstract
Vi demonstrere en metode ved hjælp af Caenorhabditis elegans som model vært for at studere mikrobielle interaktion. Mikrober er indført via kosten gør tarmen den primære placering for sygdom. Ødelægge tarmen strukturelt og funktionelt efterligner pattedyr tarmene og er gennemsigtige, hvilket gør den modtagelig til mikroskopisk undersøgelse af kolonisering. Her viser vi, at patogener kan forårsage sygdom og død. Vi er i stand til at identificere mikrobielle mutanter, der viser ændrede virulens. Dens bevarede medfødte svar til biotiske understreger gør C. elegans et fremragende system at sonde facetter host medfødte immun interaktioner. Vi viser, at værter med mutationer i gen, dobbelt oxidase ikke kan producere reaktive ilt arter og er i stand til at modstå mikrobielle fornærmelse. Vi demonstrere yderligere alsidighed af præsenteres overlevelse analyse ved at vise, at det kan bruges til at studere virkningerne af hæmmere af mikrobiel vækst. Denne analyse kan også bruges til at opdage svampe virulens faktorer som mål for udviklingen af roman svampedræbende stoffer, samt give mulighed for at afdække yderligere host-mikrobe interaktioner. Udformningen af dette assay egner sig godt til høj overførselshastighed hele-genom skærme, mens evne til cryo-Bevar orme til fremtidig brug gør det en omkostningseffektiv og attraktive hele dyr model til at studere.
Introduction
C. elegans har været brugt som en kraftfuld model organisme i mere end 50 år. I 1960 ' erne banebrydende sydafrikanske biolog Sydney Brenner brugen af C. elegans at studere neuronal udvikling, baner vejen for en lang slægt af forskere til at studere forskellige aspekter af celle og dyr biologi i nematoder. Denne slægt omfatter nobelpristagere Craig Mello og Andrew Fire for deres RNAi arbejde1, Robert Horvitz og John Sulston for deres arbejde på orgel udvikling og apoptose2,3,4, og Martin Chalfie for hans arbejde på grøn fluorescerende proteiner5. Selvom denne model organisme har traditionelt været brugt til at studere molekylære og udviklingsmæssige biologi, over de sidste 15 år, er forskere begyndt at bruge C. elegans at undersøge forskellige menneskelige patogener herunder Pseudomonas biologi aeruginosa, Staphylococcus aureusog Salmonella enterica Serratia marcescens6,7,8,9,10. Disse undersøgelser afslørede, at mange af de mekanismer, der er involveret i den menneskelige-patogen interaktion er bevaret i nematoder, men også at der er nogle immunitet mekanismer, der er unikke for denne model organisme11,12. I naturen, C. elegans møder en række trusler fra indtagne patogener i jorden og det har givet en stærk selektivt pres til at udvikle og vedligeholde en sofistikeret medfødte immunsystem i sin intestinal lumen. Mange af de gener og mekanismer involveret i beskyttelse af intestinal lumen er orkestreret af yderst bevares elementer, som også findes i højere pattedyr11,13. C. elegans repræsenterer derfor et stor model til at studere gastrointestinale patogener som Salmonella enterica14, Shigella boydii15eller Vibrio kolera16.
Her fremhæve vi det bemærkelsesværdige alsidighed af C. elegans som model vært at studere smitstoffer som C. albicans. C. elegans som model vært giver mulighed for high throughput screening for virulens, der er mindre dyre og tidskrævende end en musemodel, som er almindeligt brugt til at studere candidiasis42.
I denne undersøgelse, vi viser, at denne model og assosiated overlevelse assay kan være pålideligt anvendes til at studere vært medfødte immun effektorer vigtigt at modvirke infektioner, patogen determinanter, der drive virulens, og farmakologiske forbindelser der kan gribe ind i patogenesen. Ulig tidligere beskrevet assays, denne metode giver et middel til at studere eksponering en patogen over levetiden af dyr fra larve scenen til voksenalderen, snarere end kun voksenalderen død43,44. I Resumé, vores C. elegans - er C. albicans model et alsidigt og kraftfuldt værktøj, der kan bruges ikke kun til at studere det genetiske grundlag, at drive infektion og immunitet, men også at identificere nye stoffer til terapeutisk intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af fyrretræsnematoden vækst Medium (NGM)
- For 1 L medier, kombinere 20 g agar, 2,5 g organisk kvælstof kilde (f.eks., bacto-pepton) og 3 g natriumchlorid i en 2 L kolbe. Tilføje 975 mL sterilt vand.
- Tilføj i sterile rør bar. Hvis ved hjælp af en automatisk media skænkeprop, autoklave slanger og medier for 15 min; medierne bør være autoklaveres for længere hvis en større mængde er lavede.
- Medier på røre pladen, og afkøles.
- Når mediet er varm at røre (ca. 60 ° C) aseptisk tilsættes 1 mL 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 og 1 mL 0,5% kolesterol i ethanol.
- Hæld medier (i hånden, eller ved automatisk pumpe) under laminar flow i 35 mm x 10 mm sterile petriskåle. Tillad for at tørre under hood for 1-2 dage før brug.
Bemærk: Pladerne skal opbevares ved 4 ° C for at forhindre kontaminering.
2. At gøre en orm Pick
- skære en 1,5 cm stykke aluminium wire. Omhyggeligt indsætte ca 0,5 cm af denne længde i spidsen af Pasteur pipette.
- Ved hjælp af en bunsenbrænder eller alkohol lampe, smelte glas pipette tip ved at langsomt dreje det i flammen, indtil ledningen er sikkert levet op til pipette, uden at kompromittere den oprindelige form af pipette tip.
3. Forberedelse af E. coli kultur
- ved hjælp af en steril løkke, podes enkelt koloni af E. coli-stamme OP50 i 200 mL Luria bouillon. Der inkuberes natten over med rysten på 37 ° C.
- Flydende kultur er klar til brug den følgende dag og opbevares ved 4 ° C hvor ikke i hjælp.
Bemærk: E. coli-stamme, OP50, bruges som en fødekilde for C. elegans. Denne kultur kan anvendes til op til flere måneder når den opbevares ved 4 ° C.
4. Væsentlige C. elegans vedligeholdelse
- frø forberedt NGM agar plader med E. coli ved at afdække ca 50-100 µL af rede OP50 flydende kultur på midten af tallerkenen.
- Dækker plader og lade dem tørre ved stuetemperatur i 24 timer. Når tør, placere plader ved 37 ° C natten over for hurtig vækst eller holde ved stuetemperatur, hvis langsommere vækst ønskes.
- Tilføje orme til pladen ved enten " chunking, " (se protokollen trin 5 " Chunking og Picking orme "), picking orme individuelt, eller placere orm æg direkte på pladen (se protokollen trin 6 " æg forberedelse ").
5. Chunking og Picking orme
Bemærk: " Chunking, " refererer til en praksis, der er fælles i C. elegans vedligeholdelse. Dette indebærer at skære en del af NGM agar plade, der indeholder orme, og overføre dette stykke på en ny tallerken, således også overførsel af et stort antal orme i processen. Kontaminering kan også skæres ud af pladen på denne måde. Når picking orme, er det vigtigt at bevare integriteten af agaren fordi orme kan gå tabt i huller i agaren. Det er derudover vigtigt at tillade pick at køle før du rører pladen for at forhindre smeltning af agar eller brændende orme.
- For at hurtigt at overføre store mængder af orme på nye plader, skære et stykke af NGM agar indeholdende de valgte orme ved hjælp af en spatel. Fjerne de afskårne stykke og placere det ansigt ned på kanten af plænen i OP50 på en ny plade.
- Overførsel orme individuelt som beskrevet nedenfor i protokollen skridt 8,2, " overlevelse analyse, " ved hjælp af en orm pick. Flamme wire i ormen pick indtil den er rød. Fjerne det fra flammen og lad det køle i et par sekunder.
- Ved hjælp af wiren på pick, forsigtigt skrabe plænen i den OP50 kultur dyrket på den nye plade, der dækker wiren på pick.
- Tyktflydende kulturen der dækker spidsen af ledningen gør orme stick til spidsen af pick, således forsigtigt afhente valgte orme ved hjælp af en swiping bevægelse.
- Når valgte orme er samlet, placere dem på en ny tallerken ved forsigtigt aflæse kultur på tværs af agaren. Placer wire i flamme til at fjerne tilbageværende kultur på pick.
6. Æg forberedelse
- sted ca 20 voksne dyr (ca. 2-3 dage efter klækning når vokset ved 20 ° C) ved enten picking eller chunking som beskrevet i protokollen trin 5, " Chunking og Picking orme, " på en tallerken med 50 µL af E. coli-stamme, OP50.
- Til indsamle æg, oversvømme pladen med 10 mL af M9 buffer efter 1-2 dage. Bruger et glas serologisk pipette, swirl og forsigtigt agitere indholdet på agar plade til at frigive æg fast til OP50 eller voksne dyr. Indsamle alle de væske, der indeholder æg og voksne.
- Overføre M9 og OP50 løsning til en 15 mL konisk tube. Centrifugeres 15 mL konisk tube på 2.100 x g i 2 min.
- Opsug ca 9 mL af supernatanten uden at forstyrre OP50 pellet.
- Resuspenderes i 2 mL sterilt vand, 1 mL af blegemiddel og 1 mL 0,25 M NaOH.
- Blandes forsigtigt ved inversion indtil fleste (ca. 70 procent) af voksne dyr synes lysed; typisk den æg forblive intakte under denne korte blegemiddel behandling på grund af deres shell. Centrifugeres den koniske rør på 990 x g i 2 min.
- Aspirat supernatanten uden at forstyrre pelleten. Genopslæmmes toerstoffet i 10 mL af M9 buffer.
- Centrifugeres den koniske rør i 990 x g i 2 min. aspirat supernatanten uden forstyrrende pellet. Genopslæmmes pellet med 200 µL af M9 buffer.
Bemærk: Æg forberedelse kan kræve flere forsøg. Æg kan blive ødelagt, hvis de udsættes for at afblege alt for længe. Hvis æggene ikke klækkes, enten formindske koncentrationen af blegemiddel i opløsning eller mindske varigheden af udsættelse for blegemiddel.
7. Infektion plade Set-up
- give afkald på 3-5 mL YPD i en steril reagensglas og podes den med en enkelt koloni af Candida albicans ved hjælp af en steril løkke.
- Røret anbringes på en rotatorisk tromme i ca 16-18 timer ved 30 ° C.
- Label one 1,5 mL mikrofuge tube indeholder C. albicans, og en anden til at indeholde OP50. Vægt af hver tomme rør.
- Sted 500 µL af natten C. albicans kultur ind i rør mærket C. albicans og 1.500 µL af natten OP50 kultur (fra trin 3.1) ind i røret, mærket OP50.
- Centrifugeres i 10 min på 16,100 x g. aspirat supernatanten uden forstyrrende pellet.
- Genopslæmmes hver pellet med 500 µL sterilt vand. Der centrifugeres i 5 min på 16,100 x g.
- Aspirat supernatanten uden at forstyrre pelleten. Den endelige vægt af mikrofuge rør.
- Bestemmer vægten af hver pellet ved at fratrække den oprindelige vægt af mikrofuge rør fra den endelige vægt.
- Ved hjælp af sterilt vand, genopslæmmes C. albicans pellet til 10 mg/mL og OP50 pellet til 200 mg/mL. Gøre en master infektion mix ved at kombinere 10 µL af en 50 mg/mL opløsning af Streptomycin, 2,5 µL af OP50 kultur, 0,5 µL af C. albicans kultur og 7 µL sterilt vand.
- For kontrol plader, oprette en master mix ved at erstatte mængden af C. albicans kultur med sterilt vand. Seed 20 µL af infektion mix eller OP50 kontrol løsning på center for NGM plader ved hjælp af en mikropipette.
Bemærk: Ca. 100 orme er nødvendige for at bestemme Statistisk signifikans under analysen. Denne analyse er typisk kører i tre eksemplarer. Således, en 3.2 x infektion mix og en 3.2 x kontrol løsning er lavet. Disse blandinger er lavet til at være lidt over 3 x original til at sikre, at en fuld 20 µL er seedet på hver tallerken, giver plads til fejl. Denne master mix er lavet fordi svælget af ormen er for lille i de indledende larve faser (L1-L3) til at forbruge C. albicans. For eksponering for farmakologiske stoffer såsom fluconazol ( figur 3B), er agenten introduceret til infektion blanding. Koncentrationen af agenten bestemmes empirisk. For eksempel, i figur 3B, 50 µM fluconazol er repræsenteret, men 0, 12,5, 25, 50 og 100 µM fluconazol blev også testet ved hjælp af den samme protokol.
- For kontrol plader, oprette en master mix ved at erstatte mængden af C. albicans kultur med sterilt vand. Seed 20 µL af infektion mix eller OP50 kontrol løsning på center for NGM plader ved hjælp af en mikropipette.
8. Analyse af deforme Anal Region (Dar) fænotype og overlevelse analyse
- Visualiser Dar fænotype
Bemærk: Dar er bedst visualiseret på stadiet L3 og videre. Dar præsenterer som et lille fremspring i post anal region af ormen ( figur 2A), som bliver mere fremtrædende over tid.- Bekræft hvis et dyr har Dar ved hurtigt at trykke pladen på scenen af dissektion mikroskop; dyr uden Dar vil flytte baglæns straks, mens dyr med Dar vil enten nødt gentagne runder af aflytning at vende deres retning, eller de vil ikke gøre det på alle.
- Overlevelse analyse
- komplet æg forberedelse som tidligere beskrevet i protokollen trin 6, " æg forberedelse ". Tælle æg omfattet dissektion, og fortynd æg løsning med M9, indtil en koncentration på ca 5-6 sunde æg pr. µL opnås. Ved hjælp af en pipette, dispensere 20 µL prøve indeholdende ca 30 æg på rede NGM tallerken, i området mellem bakteriekulturen og siden af pladen (æg og orm mad, OP50, er i to adskilte steder).
- Incubate plader ved 20 ° C for 48 h. Under et mikroskop for dissektion, tælle antallet af levende og døde voksne orme på hver plade, og antallet af orme med Dar. Optage procent med Dar.
- Overveje dyrets død, hvis det ikke reagerer på at blive tappet på hovedet af en aluminium wire eller trykke på pladen.
- Hver anden dag, overføre resterende voksne orme ved plukning som beskrevet i protokollen trin 5, " Chunking og Picking orme, " på en ny infektion eller kontrol tallerken. På dette tidspunkt, hvis det er nødvendigt, udføre en overlevelse analyse ved at spore antallet af levende, døde og forsvundne orme hver dag.
Bemærk: Dette assay kan køre i to uger, begyndende med æg forberedelse. Derudover bør æg løsning ikke udleveres til bakteriekulturen, som løsningen kan indeholde spor af blegemiddel, der kan dræbe OP50. Løsningen bør også udleveret ca 0,5 cm fra kanten af pladen, som æg kan blive fast i mellem sider af pladen og agaren. Derudover på grund af den hurtige spredning af orme, overførsel af voksne på nye plader er afgørende for at adskille dem fra deres afkom.
- Analysere overlevelse
- analysere resultater ved hjælp af overlevelse kurven analyse software (Se liste over materialer).
- Sammenlign overlevelse kurver ved hjælp af metoden Grehan-Breslow-Wilcoxon (antages det, at dataene fra tidlig overlevelse gange er mere præcis end senere tider, vægt data i overensstemmelse hermed) samt Logrank statistiske værktøjer 45.
Bemærk: For eksempel, i figur 4B -C, overlevelse af orme behandles med mutant C. albicans er i forhold til dem, der er behandlet med isogene wild-type kontrolelementer eller complementarystrains.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En patogenese assay (figur 1) ved hjælp af C. albicans og C. elegans er tidligere blevet beskrevet af vores lab17,18 og andre labs19,20. Vi vise imødekommenhed ved C. elegans for at studere C. albicans virulens viser at C. albicans celler hurtigt indtages af orme og ophobes i intestinal lumen forårsager langsommere bevægelse, deforme anal region (Dar) (figur 2A), hævelse af vulva (figur 2B), udspilning af tarmen (figur 3A) og dødelighed (figur 3, figur 4). Vi måler også levetid af inficerede orme som en kvantitativ måling af fitness. For eksempel, bor C. elegans inficeret med C. albicans 10-12 dage i forhold til 20-22 til ikke-inficerede objekter. I C. elegans inficeret med C. albicans dobbelt knock out mutant, efg1/efg1 cph1/cph1, der er to centrale virulens faktorer kræves for infektion i mus, rotter og menneskelige epitelial modeller21, 23, nematoder overlevede betydeligt længere end kontrol (figur 3B). Disse eksperimenter tyder på, at nogle af vi lære i denne enklere model om C. albicans virulens kan forblive gyldig i højere pattedyr og vice versa.
Vi viser også, at ødelægge modelsystem kan være farmakologisk moduleret (figur 3B). I nærværelse af fluconazol, de mest almindeligt ordineret svampedræbende stof, orme udfordret med C. albicans overlevede betydeligt længere end kontrol. Dette bevis for princippet eksperiment antyder at ødelægge modellen kan anvendes for små molekyle screening. Ja, vores C. elegans model var medvirkende til at identificere filastatin, et lille molekyle hæmmer forskellige aspekter af svampe virulens24.
Sygdom fænotyper og mikroskopisk analyse af C. elegans infektion
C. elegans blev udsat for C. albicans over en periode på seks dage og observeres for tegn på infektion, progression af sygdom og død. Dar fænotype er mest synlige ved dagen 4 for overlevelse analyse, som bemærket af en fremspringende anal region, der ikke er synlige i den ikke-inficerede dyr (figur 2A). Orme inficeret af C. albicans er også kendt at udstille hævelse i vulva-området (figur 2B). I begge tilfælde er ormen ude af stand til at klare infektion efter at have nået dette stadie. For at visualisere kolonisering af C. albicans i intestinal lumen, blev orme fodret wild-type C. albicans markeret med RFP, som forårsager områder af kolonisering til fluorescerer rødt (figur 3A). For at producere disse billeder, blev orme bedøvede på en 2% Agarosen pad indeholdende 0,01 M natriumazid. Orme blev udsat for enten wild-type C. albicans eller RFP-tagged C. albicansog overført til 5 µM M9 buffer på Agarosen pad. Agarosen pad blev derefter dækket med en coverslip. Orme blev set på 200 X og 400 X forstørrelse ved hjælp af en omvendt mikroskop med fluorescerende mikroskopi kapaciteter. Billeder blev skabt under differential interferens kontrast (Nomarski) og epifluorescensmikroskop optik. De fluorescerende billeder blev styrket ved hjælp af software (figur 3A). Gang serie micrographs af inficerede orme bestemmes, at C. albicans koloniseret af intestinal lumen af den tredje dag i analyse17. Inficerede orme viste mere alvorlige tarm udspiling end observerede i kontrolelementet ikke-inficerede.
Genetiske og farmakologiske værktøjer til at studere infektion
Næste, vi testede model ved hjælp af genetiske og farmakologiske graduering. Vi testede også tidligere dokumenteret virulens faktorer, der regulerer hyphal overgang af C. albicans25 og har vist sig at være vigtigt i i vivo infektioner af mus og nematoder20,26 . Vi testede ormene evne til at overleve infektion forårsaget af C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 dobbelt mutant. Efg1 er en meget bevaret transskription faktor og en vigtig bestanddel af den cykliske AMP/protein kinase A (PKA) stofskiftevej. I C. albicans regulerer denne vej hyphal morfogenese27, hvid-uigennemsigtig skifte28, og et arsenal af centrale virulens faktorer. Disse virulens faktorer omfatter Hwp1 og Hwp2, to gær-specifikke cellevæg proteiner involveret i vedhæftning og Biofilmdannelse, Eap1, en cellevæg adhesin involveret i binding til humane epitelceller29, og Sap5, en hydrolytisk enzym involveret i epitelvæv invasion30. Cph1 er en transkriptionsfaktor, der regulerer mange metaboliske processer herunder parring, filamentation og Biofilmdannelse og har vist sig at spille en afgørende rolle i skadelige epitelceller31 og menneskelige rekonstruerede epitel21 . Afbrydelse af en af disse gener har en betydelig indvirkning på virulens og samtidige forstyrrelse af både i cph1/cph1efg1/efg1 resultater i dramatisk virulens reduktion i forskellige dyremodeller herunder mus25, Drosophila 32, zebrafisk33,34 og møl34. Cph1/cph1efg1/efg1 dobbelt mutant anses af C. albicans Fællesskabet som den Avirulente stamme af definition og guld standard for validering af roman modelsystemer. Efg1Δ og cph1Δ enkelt mutanter viste nedsat Dar (~ 10% og ~ 50%, henholdsvis) sammenlignet med den beslægtet vildtype, mens efg1Δ cph1Δ dobbelt mutant undladt at fremkalde Dar svar17. Disse resultater sammenfatte mønsteret af virulens i mus, hvor cph1∆ mutant er lidt svækket, efg1∆ mutant er significantly svækket, og den dobbelte mutant er helt Avirulente25. Orme inficeret med cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans dobbelt mutant boede statistisk signifikant længere end kontrol (p < 0,01 for både Log Rank og Breslow statistiske test, n = 60) antyder, at disse to gener er påkrævet for C. albicans virulens mod C. elegans (figur 3B).
For at undersøge muligheden af at anvende vores C. elegans model for potentielle stof screening, vi har testet effekten af tilsætning af fluconazol på det ultimative resultat af infektionen. Vi brugte en lang række forskellige koncentrationer af fluconazol og fandt, at 50 µM gav os de mest betydningsfulde resultater. Orme inficeret med C. albicans og 50 µM fluconazol (figur 3B) boede statistisk signifikant længere end kontrol (p < 0,01 på både Log Rank og Breslow statistiske test, n = 60). Denne koncentration var empirisk bestemmes (se note i slutningen af protokollens trin 7, "infektion plade sat op"). Disse bevis for princippet eksperimenter viste, at vores nematodeprøveudtagning model kan bruges til små molekyle svampedræbende screening. Modellen var faktisk medvirkende til opdagelsen af filastatin, et lille molekyle hæmmer forskellige aspekter af svampe virulens, der undergår i øjeblikket yderligere prækliniske undersøgelser24. Vores analyse er derfor egnet til at udforske virulens strategier for C. albicans og farmakologiske midler.
Undersøgelse af medfødte vært svar
Næste, vi ønskede at studere de gensidige vært forsvar mod patogener, da aspekter af denne medfødte immunitet er bevaret i pattedyr11,35. Det er velkendt, at C. elegans producerer ROS på begge bakterie-og svampeinfektioner18,36,37 som en del af sin forsvarsmekanisme. ROS have nogen biocidvirkning på invaderer organismer og spiller en stor rolle i medfødt immunitet. zcf15/zcf15 hyper følsomhed over for ROS i vitro førte os til hypotesen om, at dens reducerede virulens i C. elegans skyldtes en nedsat evne til at modstå værtens genereret ROS. For at teste vores hypotese, besluttet vi på zcf15/zcf15 evne til at dræbe enten vildtype orm eller orme med en nedsat evne til at producere ROS. Repræsentative C. albicans mutant zcf15 der er følsomme over for reaktive ilt arter (figur 4A) viste reduceret virulens i wild-type C. elegans. C. elegans reagerer på indtagelse af patogenet ved at producere ekstracellulære ROS i intestinal lumen via Ce-Duox1, en NADPH oxidase kodet af genet bli-3. Under ROS produktion producere de tarmcellerne også intracellulære antioxidanter via DAF-16 til at beskytte sine egne væv fra ROS skadelige virkninger36,38. CE-Duox1 er et protein med en N-terminale peroxidase domæne, C-terminale superoxid-genererende NADPH-oxidase domæne og to centrale calmodulin-bindingssteder39. Ved mikrobiel infektion bruger dette protein cytosole NADPH til at generere ekstracellulære giftige ROS i intestinal lumen til at modvirke infektion. Gennem en serie af biokemiske analyser i en 2009 undersøgelse viste Jain et al. at ROS er rigeligt produceret af gær infektion og at bli-3 tab af funktion via bli-3(e767) drastisk reducerer nematoder evne til at producere ROS. Som vist i figur 4B, orme udfordret med zcf15/zcf15 overlevede betydeligt længere end vildtype eller suppleret stammer (p < 0,01 af log-rank test) indikerer, at ZCF15 er påkrævet for virulens. Men når vi udfordret ROS-mangelfuld C. elegansbli-3(e767), vi opnåede kinetik af drab, der var sammenlignelige mellem zcf15/zcf15, vildtype og suppleret stamme (figur 4 c). Dette tyder på, at zcf15/zcf15 undlader at dræbe nematoder, medmindre værtens evne til at producere ROS er kompromitteret. Taget sammen, tyder disse resultater på, at ZCF15 kræves til fuld virulens, og at dette gen sandsynligvis er involveret i patogenets evne til at modstå vært genereret ROS. Til bedste af vores viden er dette første gang, at ZCF15 har vist sig at være involveret i patogenicitet og ROS modstand.
Figur 1: En skematisk gengivelse af C. elegans infektion. C. elegans er udsat for en blanding af E. coli stamme OP50 og en patogen og observeret over en periode på 4 dage efter at have nået voksenalderen for tegn på infektion og progression af sygdommen.
Figur 2: sygdommen fænotyper. (A) Deformed anal region (Dar) er synlige (angivet med en pil) som en hævelse i det indlæg anal region af inficerede orme (højre panel) fire dage efter eksponering. Ormene på panelet til venstre er virusfri og tjene som et kontrolelement. (B) en delmængde (~ 15%) af inficerede orme Vis en hævelse af vulva (højre panel, angivet med en pil) i forhold til ikke-inficerede kontrol orme (venstre panel), der repræsenterer formidlet infektion resulterer i matricidal død. Alle billeder blev taget som beskrevet i de repræsentative resultater18.
Figur 3: De C. albicans - C. elegans model er åbne over for mikroskopiske manipulation, og kan være farmakologisk og genetisk moduleret. (A) C. albicans markeret med RFP ophobning i ødelægge intestinal lumen dag 3 efter infektion. Gærceller er hurtigt indtaget af orme og ophobes i intestinal lumen helt intakte, der angiver, at de er i stand til at overleve den mekaniske knusning af svælget. Billeder blev taget som beskrevet i de repræsentative resultater18. (B) Kaplan-Meier overlevelse kurver af nematoder udfordret med wild-type C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 dobbelt mutant eller wild-type C. albicans + 50 µM af fluconazol i forhold til ikke-inficerede kontrol orme.
Figur 4. ZCF15 er påkrævet til at modstå C. elegans genereret ROS. (A) ZCF15 er ansvarlig for vildtype modstand til paraquat, som er kendt for at generere reaktive ilt arter. Vildtype, knockout eller suppleret stammer blev dyrket i flydende kultur overnight og resuspenderet til OD = 1. Kulturer var hver fortyndet 1:5 og belagt på YPD eller YPD indeholdende 1 mM paraquat. C. elegans producere ROS via bli-3 for at bekæmpe patogener, der invaderer intestinal lumen38. (B) Kaplan-Meier overlevelse kurver viser at ZCF15 sletning begrænser drab på vildtype orm. (C) den Kaplan-Meier overlevelse kurven viser lignende satser for overlevelse mellem zcf15/zcf15, vildtype og suppleret stamme når ROS-mangelfuld C. elegansbli-3(e767) var smittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder til paavisning C. elegans infektion og overlevelse over livslange eksponering for C. albicans , vi har beskrevet kan ændres for at teste en anden patogen. Flydende kulturer af en anden bakterier eller svamp kan lavet og fodres til C. elegans på en lignende måde. Derudover seriel infektioner kan analyseres ved først at udsætte larve til et patogen, som beskrevet, og derefter overføre dyr ind på en ny plade der indeholder en separat patogen efter at have nået voksenalderen.
Mens gennemføre denne analyse, er det vigtigt at være nøje opmærksom timing. Første, ved udfyldelsen af æg forberedelse for at høste æg til analysen, det er afgørende at begrænse mængden af gang æg er udsat for at afblege. Mængden af tid, det tager at opløse voksne i opløsningen blegemiddel for at frigive æg varierer. Umiddelbart efter administration af blegemiddelopløsning, skal orm løsning være overvåget nøje under et mikroskop for dissektion. Når ca. 70% af orme har opløst, bør så løsningen være centrifugeres. Hvis ægget forberedelse ikke giver levedygtige æg, reducere enten koncentration af blegemiddel eller varigheden af udsættelse for blegemiddel. At afslutte denne analyse, er det også afgørende, at der lægges vægt på indskydende voksne orme på nye plader som nødvendig for at undgå forvirrende undersøgelse fag med deres afkom. Begrænsning af antallet af æg forgyldt i starten af analysen til 25-30 æg bør undgå dette så godt. Endelig mindsker overførsel voksne orme på nye plader ofte også chancerne for orm kravler op ad siderne af petriskålen og døende.
Vi har udnyttet Caenorhabditis elegans som en alsidig model vært for at studere patogene eller commensal relationer mellem mikrober eller en mikrobe og sin vært. Vores system kan bruges som et værktøj til undersøgelse mikrobiel eller host-mikrobe interaktion på cellulære og molekylære niveau ved hjælp af forward og reverse genetiske metoder, men også for at udforske nye molekyler for terapeutisk intervention. Vi har vist alsidigheden af dette system ved at foretage en genetisk skærmen for at identificere gener, der bidrager til virulens40, dem knyttet til mikrobiel fitness41, dem, der mægle host reaktion på mikrober17, 18, samt ved hjælp af modellen for høj produktivitet programmer for drug discovery24. Dette er en god model for brug af bachelorstuderende, fordi det ikke behøver dyre infrastruktur til at opretholde kolonier, overvejer at dyr kan være cryo-konserveret for fremtidige ansøgninger. Endelig, dette giver en perfekt "mellemmand" til in vitro- undersøgelser og murine modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført på og støttet af Worcester Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
- Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
- Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
- Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
- Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
- Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
- Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
- Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
- Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
- Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
- Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
- Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
- Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
- Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
- McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
- Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
- Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
- Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
- Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
- Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
- Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
- Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
- Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
- Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
- Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
