Summary

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

Published: October 18, 2017
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

Abstract

נדגים שיטה באמצעות Caenorhabditis elegans כמחשב מארח דגם ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי. חיידקים הם הציגו באמצעות הדיאטה עושה המעי המיקום העיקרי למחלה. המעי נמטודות מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית מחקה בתרבית של המעיים, שקוף שהופך אותו לבצע מחקר מיקרוסקופיות של קולוניזציה. הנה אנחנו מראים כי פתוגנים יכול לגרום למחלות ומוות. אנו מסוגלים לזהות חיידקים מוטנטים להראות שונה התקפה אלימה. שלה שנשמרת תגובה הטבועה ביוטיים מדגיש גורם C. elegans מערכת מעולה כדי לחקור היבטים של אינטראקציות החיסון מולדים המארח. אנו מראים כי מארחים עם מוטציות בגן אוקסידאז כפול לא יכול להפיק מינים חמצן תגובתי, אינם מסוגלים לעמוד בפני העלבון מיקרוביאלי. נדגים נוסף צדדיות של וזמינותו להישרדות שהוצגו על-ידי הצגת כי זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי צמיחת חיידקים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי לגלות את הגורמים התקפה אלימה פטרייתי כמטרות לפיתוח של סוכני פטריות חדשניים, כמו גם לספק הזדמנות לחשוף עוד יותר אינטראקציות מארח-חיידק. העיצוב של זה וזמינותו משאיל את עצמו היטב כדי תפוקה גבוהה מסכי הגנום כולו, בזמן יכולת הקפאה-שימור תולעים לשימוש עתידי הופכת במודל חיה כל חסכונית ואטרקטיבית, ללמוד.

Introduction

C. elegans שימש כאורגניזם מודל חזק במשך יותר מ-50 שנה. בשנות השישים, ביולוג בדרום אפריקה סידני ברנר חלוץ השימוש של C. elegans ללמוד פיתוח עצביים, לסלול את הדרך לשושלת ארוכה של מדענים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה תאים של בעלי חיים של נמטודות. זה כולל חתני פרס נובל קרייג מלו, אנדרו פייר עבור העבודה שלהם RNAi1, רוברט הורביץ, ג’ון סלסטון עבודתם על התפתחות האיברים ואפופטוזיס-2,3,4, מרטין צ’לפי על עבודתו על חלבון פלואורסצנטי ירוק5. למרות אורגניזם מודל זה שימש באופן מסורתי ללמוד ביולוגיה מולקולרית, התפתחותית, במשך 15 השנים האחרונות, חוקרים החלו להשתמש C. elegans כדי לחקור את הביולוגיה של פתוגנים אנושיים שונים כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus סלמונלה enterica, בסרישיה marcescens6,7,8,9,10. מחקרים אלה חשף כי רבים של המנגנונים המעורבים באינטראקציה פתוגן-האדם נשמרים נמטודות, אלא גם כי ישנם כמה מנגנונים חסינות ייחודיים11,זה אורגניזם מודל12. בטבע, C. elegans נתקל מגוון רחב של איומים מפני פתוגנים בלע להציג באדמה, זה סיפק לחץ סלקטיבי חזקה להתפתח ולפתח לשמור על מערכת חיסונית מולדת מתוחכמת ב שלה לומן מעיים. רבים של גנים המנגנונים המעורבים ההגנה של לומן מעיים הם בניצוחו של אלמנטים והתפאורה מאוד שקיימים גם יונקים גבוהה יותר11,13. C. elegans ולכן מייצג מודל ללמוד פתוגנים מדרכי העיכול כמו סלמונלה enterica14, שיגלה boydii15או ויבריו כולרה16.

כאן אנחנו מדגישים צדדיות יוצא דופן של C. elegans כמחשב מארח דגם ללמוד מדבקים כגון אלביקנס ג. C. elegans כמחשב מארח המודל מאפשר תפוקה גבוהה הקרנה של התקפה אלימה פחות יקר, אורכת זמן רב יותר דגם העכבר, המשמש בדרך כלל ללמוד קנדידה42.

במחקר זה, אנו מראים כי מודל זה ואת וזמינותו להישרדות assosiated אמין ניתן ללמוד מארח מולדת המערכת החיסונית effectors חשוב לנטרל זיהומים, גורמים הפתוגן לנהוג התקפה אלימה, ולא תרופתי תרכובות שיכול. להתערב פתוגנזה. שיטה זו שונה כדי מבחני שתואר לעיל, מספק אמצעים של הלומדים חשיפה חיידק במהלך תקופת החיים של החיה, של הזחל לבגרות, ולא רק לבגרות אל המוות43,44. לסיכום, שלנו, C. elegans – מודל אלביקנס ג הוא כלי רב-תכליתי, עוצמה שניתן להשתמש בהם לא רק ללמוד את היסודות גנטי כי הכונן זיהום וחסינות אלא גם לזהות תרכובות חדשות התערבות טיפולית.

Protocol

1. הכנה של תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) עבור 1 L של מדיה, לשלב 20 גרם אגר, מקור חנקן אורגני 2.5 g (למשל, מה נשארתי-peptone) ו- 3 גר’ נתרן כלורי בבקבוקון 2 ל’. להוסיף 975 מ ל מים סטריליים. הוספה בבר מערבבים סטרילי. אם משתמש של המשפך מדיה אוטומטי, אבובים אוטוקלב ומדיה למשך 15 דקות; המדי…

Representative Results

Assay פתוגנזה (איור 1) באמצעות אלביקנס ג ו- C. elegans בעבר שתואר עד17,שלנו במעבדה18 ו-19,אחרים מעבדות20. נדגים את amenability של השימוש C. elegans ללמוד התקפה אלימה אלביקנס ג מראה כי אלביקנס ג…

Discussion

ניתן לשנות את שיטות assaying C. elegans זיהום והישרדות לאורך כל החיים חשיפה אלביקנס ג אשר תארנו לבחון פתוגן אחר. נוזלי תרביות של חיידקים או פטריות אחר ייתכן וגם למאכל C. elegans באופן דומה. בנוסף, ייתכן לבדיקה זיהומים טורי על-ידי קודם חשיפת הזחל ל one פתוגן כמתואר ולאחר מכן להעביר את החיות ע…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו ביצע, נתמך על ידי המכון הפוליטכני וורצ.

Materials

Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).

Play Video

Cite This Article
Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans – A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

View Video