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Genetics

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Abstract

Wir zeigen eine Methode mit Caenorhabditis Elegans als Modell Host, um mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Mikroben sind über die Ernährung machen dem Darm den primären Speicherort für die Krankheit eingeführt. Die Nematoden Darm strukturell und funktionell imitiert Säugetier-Darm und ist transparent macht es zugänglich für mikroskopische Untersuchung von Besiedlung. Hier zeigen wir, dass Krankheitserreger Krankheit und zum Tod führen können. Wir sind in der Lage, mikrobielle Mutanten zu identifizieren, die veränderten Virulenz zu zeigen. Seine erhaltenen angeborene Reaktion auf biotische betont macht C. Elegans ein ausgezeichnetes System Facetten des angeborenen Immunsystems Wirt Interaktionen zu untersuchen. Wir zeigen, dass Hosts mit Mutationen im gen duale Oxidase nicht reaktiven Sauerstoffspezies produzieren und sind nicht in der Lage, mikrobielle Beleidigung zu widerstehen. Weiter zeigen wir die Vielseitigkeit des vorgestellten überleben Tests zeigen, dass es zur Untersuchung der Auswirkungen von Inhibitoren des mikrobiellen Wachstums verwendet werden kann. Dieser Test kann auch verwendet werden, entdecken Pilz Virulenzfaktoren als Ziele für die Entwicklung von neuartigen Antimykotika, sowie bieten die Möglichkeit, weitere Host-Mikroben-Interaktionen aufzudecken. Das Design dieser Assay eignet sich gut für hohen Durchsatz Vollständiggenom Bildschirme, während die Fähigkeit, Cryo-Konserve Würmer für zukünftigen Gebrauch es eine kostengünstige und attraktive ganze Tiermodell macht zu studieren.

Introduction

C. Elegans hat seit mehr als 50 Jahren als leistungsstarke Modellorganismus eingesetzt. In den 1960er Jahren Pionier südafrikanischer Biologe Sydney Brenner im Einsatz von C. Elegans , neuronale Entwicklung zu studieren ebnet den Weg für eine lange Linie von Wissenschaftlern, verschiedene Aspekte der Zell- und Biologie in Nematoden zu studieren. Diese Linie umfasst Nobelpreisträger Craig Mello und Andrew Fire für ihre RNAi Arbeit1, Robert Horvitz und John Sulston für ihre Arbeit über die Organentwicklung und Apoptose2,3,4, und Martin Chalfie für seine Arbeiten über grün fluoreszierendes Protein5. Obwohl diese Modellorganismus traditionell verwendet wurde, um Entwicklungsstörungen Molekularbiologie, in den vergangenen 15 Jahren zu studieren, haben Forscher damit begonnen, C. Elegans zu verwenden, um die Biologie der verschiedenen menschlichen Krankheitserreger einschließlich Pseudomonas untersuchen Aeruginosa, Staphylococcus Aureus, Salmonellen Entericaund Serratia Marcescens6,7,8,9,10. Diese Studien zeigten, dass viele der Mechanismen der Interaktion Mensch-Erreger beteiligt sind konserviert in Nematoden, aber auch das gibt es einige Immunität-Mechanismen, die einzigartig für dieses Modell Organismus11,12. In der Natur C. Elegans Begegnungen einer Vielzahl von Bedrohungen aus aufgenommenen Krankheitserreger im Boden vorhanden, und dies hat einen starken Selektionsdruck zu entwickeln und zu pflegen eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem in seiner Darmlumen zur Verfügung gestellt. Viele der Gene und Mechanismen, die im Bereich des Darmlumens werden durch hoch konserviert Elemente orchestriert, die gibt es auch in höheren Säugetiere11,13. C. Elegans stellt daher ein großes Modell, Magen-Darm-Erreger wie Salmonella Enterica14, Shigella Boydii15oder Vibrio Cholera16zu studieren.

Hier heben wir die bemerkenswerte Vielseitigkeit von C. Elegans als Modell Host Infektionserreger wie C. Albicanszu studieren. C. Elegans als Modell Host ermöglicht Hochdurchsatz-Screening für Virulenz, das ist weniger teuer und zeitaufwändig als ein Mausmodell, das häufig verwendet wird, um Candidiasis42zu studieren.

In dieser Studie zeigen wir, dass dieses Modell und ihre überleben Assay zuverlässig genutzt werden können, für das Studium Host angeborenen Immunsystem Effektoren wichtig gegen Infektionen, Erreger Determinanten, die Virulenz, fahren und pharmakologischen Verbindungen können in Pathogenese eingreifen. Ähnlich wie zuvor beschriebenen Tests diese Methode bietet eine Möglichkeit des Studiums Exposition gegenüber einem Krankheitserreger über die gesamte Lebensdauer des Tieres, vom Larvenstadium bis ins Erwachsenenalter, anstatt nur Erwachsenenalter bis Tod43,44. Zusammenfassend unsere C. Elegans - ist C. Albicans -Modell ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet werden kann, nicht nur die genetischen Grundlagen zu studieren, die Infektion und Immunität zu fahren, sondern auch neue Verbindungen für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.

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Protocol

1. Vorbereitung der Nematode Wachstum Medium (NGM)

  1. für 1 L der Medien, zu kombinieren, 20 g Agar, 2,5 g organischer Stickstoff-Quelle (z.B., Bacto-Pepton) und 3 g Natrium-Chlorid in eine 2 L Flasche. 975 mL sterilem Wasser hinzugeben.
    1. Add in einer sterilen Stir Bar. Wenn eine automatische Media Ausgießer, Autoklaven Tubing und Medien für 15 min; Medien sollten Autoklaven für mehr wenn ein höheres Volumen erfolgt.
  2. Medien auf Platte rühren und abkühlen lassen.
    1. Sobald Medien warm an (ca. 60 ° C) aseptisch ist fügen Sie 1 mL 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 und 1 mL 0,5 % Cholesterin im Äthanol.
    2. Medien (von hand oder durch automatische Pumpe) unter Laminar-Flow in Gießen 35 mm x 10 mm sterile Petrischalen. Unter Haube für 1-2 Tage vor dem Gebrauch trocknen lassen.
      Hinweis: Platten sollten gespeichert werden, bei 4 ° C um Kontaminationen zu vermeiden.

2. Macht ein Wurm holen

  1. schneiden Sie ein 1,5 cm Stück von Aluminiumdraht. Legen Sie ca. 0,5 cm Länge in der Spitze einer Pasteurpipette.
    1. Mit einem Bunsenbrenner oder Alkohol-Lampe, schmelzen die Pipettenspitze Glas durch langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher auf die Pipette eingehalten wird, ohne die ursprüngliche Form des die Pipettenspitze.

3. Vorbereitung der E. Coli-Kultur

  1. mit einer sterilen Schleife, einzige Kolonie von E. Coli-Stamm OP50 in 200 mL Brühe Luria impfen. Inkubation über Nacht unter Schütteln bei 37 ° c
  2. Die Flüssigkultur ist bereit für den Einsatz am Folgetag und bei 4 ° C bei Nichtgebrauch gespeichert werden können.
    Hinweis: Die E. Coli-Stamm, OP50, dient als Nahrungsquelle für C. Elegans. Dieser Kultur verwendet werden, für bis zu mehrere Monate bei 4 ° c

4. Wesentlichen C. Elegans Wartung

  1. Samen NGM Agarplatten mit E. Coli von Schmierblutungen etwa 50-100 µL bereit OP50 Flüssigkultur in die Mitte des Tellers vorbereitet.
  2. Abdeckplatten und bei Raumtemperatur für 24 Std. trocknen lassen. Nach dem Trocknen legen Platten bei 37 ° C über Nacht für ein schnelles Wachstum oder halten bei Raumtemperatur, wenn langsameres Wachstum gewünscht wird.
  3. Der Platte Würmer hinzufügen, indem entweder " chunking, " (siehe Protokoll Schritt 5 " Chunking und Kommissionierung Würmer "), Kommissionierung Würmer einzeln oder Wurm Eiern direkt auf den Teller zu platzieren (siehe Protokoll Schritt 6 " Ei Vorbereitung ").

5. Chunking und Kommissionierung Würmer

Hinweis: " Chunking, " bezieht sich auf eine Praxis, die häufig in C. Elegans Wartung. Dabei schneiden einen Abschnitt der NGM-Agar-Platte, die Würmer enthält, und dieses Stück auf eine neue Platte zu übertragen, damit auch eine große Anzahl von Würmern im Prozess übertragen. Verschmutzung kann auch aus der Platte auf diese Weise geschnitten werden. Bei der Kommissionierung Würmer, ist es wichtig, die Integrität des Nährbodens zu pflegen, denn Würmer in Löcher im Agar verloren gehen können. Darüber hinaus ist es wichtig, damit die Abholung abkühlen, bevor Sie die Platte, um zu verhindern, dass der Agar schmelzen oder brennen die Würmer berühren können.

  1. Um schnell große Mengen an Würmern auf neue Teller übertragen schneiden Sie ein Stück der NGM-Agar, enthält die ausgewählten Würmer mit einem Spatel. Entfernen Sie das geschnittene Stück und legen Sie es Gesicht nach unten am Rand des Rasens OP50 auf eine neue Platte.
  2. Transfer Würmer einzeln wie folgt im Protokoll Schritt 8.2, " Survival Test, " mit einem Wurm nehmen. Flamme des Drahtes in der Wurm holen bis es rot ist. Von der Flamme entfernen und für ein paar Sekunden abkühlen lassen.
  3. Mit den Draht auf die Abholung, sanft den Rasen der OP50 Kultur angebaut auf der neuen Platte, über den Draht auf die Pick kratzen.
  4. Die Viskose Kultur über die Spitze des Drahtes macht Würmer halten Sie sich an die Spitze der Abholung, so sanft ausgewählten Würmer mit einer swiping Bewegung abholen.
  5. Nach ausgewählten Würmer versammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte durch sanft streichen Kultur auf Agar. Legen Sie den Draht in die Flamme, verbleibenden Kultur bei der Abholung zu entfernen.

6. Ei-Vorbereitung

  1. Ort etwa 20 ausgewachsene Tiere (ca. 2-3 Tage nach dem Schlupf, wenn gewachsen bei 20 ° C) durch entweder Abnehmen oder chunking gemäß Protokoll Schritt 5, " Chunking und Kommissionierung Würmer, " auf einen Teller mit 50 ausgesät µL der E. Coli-Stamm, OP50.
  2. Zu die Eiern sammeln, überfluten die Platte mit 10 mL der M9 Puffer nach 1-2 Tagen. Mit Hilfe einer serologischen Glaspipette, wirbeln Sie und schütteln Sie sanft den Inhalt auf der Agarplatte freizugebende Eiern OP50 oder Erwachsene Tiere stecken. Sammeln Sie alle Flüssigkeit, die mit den Eiern und Erwachsene.
  3. Transfer M9 und OP50 Lösung in einem 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie 15 mL konische Rohr bei 2.100 x g für 2 min.
  4. Ca. 9 mL überstand ohne störende OP50 Pellet Aspirieren.
  5. Das Pellet in 2 mL sterilem Wasser, 1 mL der Bleichmittel und 1 mL von 0,25 M NaOH Aufschwemmen.
  6. Vorsichtig mischen durch umdrehen, bis die Mehrzahl (ca. 70 Prozent) der erwachsenen Tiere lysierten erscheinen, in der Regel Eiern bleiben während dieser kurzen Bleichmittel Behandlung wegen ihrer Schale. Das konische Rohr auf 990 X g für 2 min. Zentrifugieren
  7. Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Wieder aussetzen das Pellet in 10 mL Puffer M9.
  8. Zentrifuge das konische Rohr in 990 X g für 2 min. Aspirat überstand ohne störende Pellet. Wieder aussetzen Pellet mit 200 µL Puffer M9.
    Hinweis: Ei Vorbereitung kann mehrere Versuche erforderlich. Eiern können zerstört werden, wenn sie zu lange bleichen ausgesetzt sind. Wenn nicht schlüpfen, verringern Sie die Konzentration der Bleichmittel in Lösung oder verringern die Dauer der Exposition zu bleichen.

7. Infektion Teller Set-up

  1. 3-5 mL YPD in ein steriles Röhrchen zu verzichten und mit einer einzigen Kolonie von Candida Albicans mit einer sterilen Schleife zu impfen.
    1. Legen Sie das Rohr auf einer rotatorischen Trommel für ca. 16-18 h bei 30 ° c
  2. Label eine 1,5 mL Microfuge Röhre zu C. Albicans und anderen OP50 enthalten enthalten. Nehmen Sie das Gewicht jedes Leerrohr.
    1. Ort 500 µL der Übernachtungen C. Albicans Kultur in Rohr gekennzeichnet C. Albicans und 1.500 µL der Nacht OP50 Kultur (aus Schritt 3.1) in das Rohr mit der Bezeichnung OP50.
    2. Zentrifuge für 10 min bei 16.100 x g. Aspirat überstand ohne störende Pellet.
    3. Wieder aussetzen jedes Pellet mit 500 µL steriles Wasser. Zentrifuge für 5 min bei 16.100 x g.
    4. Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Aufnehmen das Endgewicht von Microfuge Rohren.
    5. Bestimmen das Gewicht jedes Pellet durch Subtraktion das Ausgangsgewicht der Microfuge Rohre aus der Auswaage.
  3. Mit sterilem Wasser wieder auszusetzen, C. Albicans Pellet bis 10 mg/mL und die OP50 Pellet bis 200 mg/mL. Machen Sie eine master-Infektion durch die Kombination von 10 µL einer Lösung von 50 mg/mL von Streptomycin, 2,5 µL OP50 Kultur, 0,5 µL von C. Albicans Kultur und 7 µL steriles Wasser mischen.
    1. Für Steuerplatten, einen master-Mix zu schaffen, indem die Lautstärke von C. Albicans Kultur mit sterilem Wasser. Seed 20 µL der Infektion Mix oder OP50-Control-Lösung auf die Mitte der NGM-Teller mit einer Mikropipette.
      Hinweis: Rund 100 Würmer sind erforderlich, um statistische Signifikanz bei der Analyse bestimmen. Dieser Test ist in der Regel in dreifacher Ausführung ausgeführt. Somit erfolgt eine 3,2 x Infektion Mischung sowie eine 3,2 x Kontrolllösung. Diese Mischungen sind gemacht, um etwas mehr als 3 x das Original um sicherzustellen, dass eine volle 20 µL auf jede Platte, so dass Raum für Fehler ausgesät wird. Dieses master-Mix entsteht, weil der Rachen des Wurms im ersten Larvenstadium (L1-L3), C. Albicans konsumieren zu klein ist. Für die Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen wie Fluconazol ( Abb. 3 b) wird der Agent auf die Infektion Mischung eingeführt. Die Konzentration des Agenten wird empirisch bestimmt. Zum Beispiel in Abbildung 3 b, 50 µM Fluconazol vertreten ist, jedoch 0, 12.5, 25, 50 und 100 µM Fluconazol waren auch mit dem gleichen Protokoll getestet.

8. Analyse der Analbereich verformt (Dar) Phänotyp und Survival Test

  1. visualisieren den Dar-Phänotyp
    Hinweis: Dar ist am besten visualisiert, in die L3-Stadium und darüber hinaus. Dar präsentiert sich als eine kleine Vorwölbung im Analbereich Post des Wurms ( Abbildung 2A), die im Laufe der Zeit stärker wird.
    1. Bestätigen, falls ein Tier Dar, indem man schnell die Platte auf der Bühne des Mikroskops Dissektion; Tiere ohne Dar Willen rückwärts sofort bewegen, während Tiere mit Dar entweder werden wiederholt runden klopfen, oder sie ihre Richtung umkehren wird das auch gar nicht tun.
  2. Überleben Assay
    1. komplette Ei Vorbereitung wie oben beschrieben im Protokoll Schritt 6, " Ei Vorbereitung ". Zählen Sie die Eizellen im Rahmen der Dissektion und verdünnen Sie die Ei-Lösung mit M9 zu, bis eine Konzentration von ca. 5-6 gesunden Eizellen pro Mikroliter erreicht ist. Mit einer Pipette 20 µL Probe mit ca. 30 Eiern auf vorbereiteten NGM-Teller, im Bereich zwischen der bakteriellen Kultur und der Seite der Platte zu verzichten (Eiern und Wurm Essen, OP50, sind in zwei unterschiedlichen Spots).
    2. Platten Inkubation bei 20 ° C für 48 h. Zählen Sie unter dem Mikroskop Dissektion die Anzahl der Leben und tot Erwachsene Würmer auf jeder Platte, sowie die Anzahl der Würmer mit Dar. Aufzeichnen der Prozent mit Dar.
    3. Ein Tier tot betrachten, wenn es nicht antwortet, wird auf den Kopf von einem Aluminiumdraht oder durch Tippen auf die Platte angezapft.
    4. Jeden zweiten Tag transfer restlichen Erwachsenen Würmer mit Kommissionierung, wie im Protokoll Schritt 5 beschrieben " Chunking und Kommissionierung Würmer, " auf eine neue Infektion oder Kontrolle. An dieser Stelle bei Bedarf einen Überlebens-Assay durch tracking-Nummer live, Tote und vermisste Würmer pro Tag durchführen.
      Hinweis: Dieser Test kann für zwei Wochen laufen beginnend mit Ei-Vorbereitung. Darüber hinaus sollte die Ei-Lösung auf die Bakterienkultur nicht verzichtet werden, da die Lösung kann Spuren von Bleichmittel enthalten, die die OP50 töten kann. Die Lösung sollte ca. 0,5 cm vom Rand der Platte verzichtet, wie Eiern zwischen den Seiten der Platte und der Agar geklebt werden können. Darüber hinaus aufgrund der schnellen Verbreitung von Würmern, Übertragung von Erwachsenen auf neue Teller ist entscheidend für die sie von ihren Nachkommen zu trennen.
  3. Analysieren überleben
    1. Ergebnisse mit überleben Kurve Analysesoftware zu analysieren (siehe Materialliste).
    2. Vergleichen Überleben Kurven mit der Grehan Breslow Wilcoxon-Methode (unter der Annahme, dass die Daten vom frühen Überlebenszeiten genauer als die späteren Zeiten, Gewicht die Daten entsprechend) sowie Form Statistikwerkzeugen 45.
      Hinweis: Zum Beispiel in Abbildung 4 b -C, das Überleben der Würmer mit Mutant C. Albicans behandelt ist im Vergleich zu den behandelten mit isogenen Wildtyp Steuerelemente oder Complementarystrains.

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Representative Results

Eine Pathogenese-Assay (Abb. 1) mit C. Albicans und C. Elegans wurde zuvor von unserem Labor17,18 und andere Labors19,20beschrieben. Wir zeigen die Bereitschaft der Verwendung von C. Elegans , um C. Albicans Virulenz zeigen, dass C. Albicans Zellen von den Würmern schnell aufgenommen werden und reichern sich im Darmlumen verursacht langsamere Fortbewegung zu studieren verformt anal Region (Dar) (Abbildung 2A), Schwellung der Vulva (Abb. 2 b), Ausdehnung des Darmes (Abbildung 3A) und Letalität (Abbildung 3, Abbildung 4). Wir messen auch die Lebensdauer der infizierte Würmer als ein quantitatives Maß für Fitness. Zum Beispiel Leben C. Elegans infiziert mit C. Albicans 10-12 Tage im Vergleich zu 20-22 für nicht infizierte Kontrollen. In C. Elegans mit C. Albicans Doppel Knock out Mutant infiziert, efg1/efg1 cph1/cph1, die zwei wichtigsten Virulenzfaktoren Infektion mit Maus erforderlich sind, Ratten und Menschen epithelialen Modelle21, 23, Nematoden überlebten signifikant länger als Kontrollen (Abb. 3 b). Diese Experimente deuten darauf hin, dass einige der Lektionen, die wir in diesem einfacheren Modell über C. Albicans Virulenz lernen bei den höheren Säugetieren und umgekehrt gültig bleiben kann.

Wir zeigen auch, dass die Nematoden Modellsystem sein kann pharmakologisch modulierte (Abb. 3 b). In Anwesenheit von Fluconazol, das am häufigsten verschriebene Antimykotika Medikament überlebten Würmer mit C. Albicans herausgefordert deutlich länger als Kontrollen. Dieser Nachweis der Grundsatz Experiment legt nahe, dass die Nematoden Modell für kleine Molekül-Screening verwendet werden kann. In der Tat, war unser C. Elegans Modell maßgeblich bei der Ermittlung von Filastatin, ein kleines Molekül hemmt verschiedene Aspekte der Pilz Virulenz24.

Krankheit-Phänotypen und mikroskopische Analyse der C. Elegans Infektion
C. Elegans wurden über einen Zeitraum von sechs Tagen C. Albicans ausgesetzt und Anzeichen einer Infektion, Fortschreiten der Krankheit und Tod zu beobachten. Der Dar-Phänotyp ist sichtbarste von Tag 4 des Überlebens-Assays wie eine hervorstehende Analbereich festgestellt hat, die in nicht infizierten Tieres (Abbildung 2A) nicht sichtbar ist. Würmer von C. Albicans infiziert sind auch bekannt, zeigen Schwellung der Vulva Region (Abb. 2 b). In beiden Fällen ist der Wurm nicht in der Lage, die Infektion nach Erreichen dieser Stufe zu löschen. Um die Besiedlung von C. Albicans im Darmlumen zu visualisieren, wurden Würmer gefüttert Wildtyp C. Albicans getaggt mit RFP, die dazu führen, dass Bereiche der Kolonisation zu fluoreszieren rot (Abbildung 3A). Um diese Bilder zu erzeugen, wurden Würmer auf eine 2 % Agarose-Pad mit 0,01 M Natriumazid betäubt. Würmer waren entweder Wildtyp C. Albicans oder RFP gekennzeichnet C. Albicansausgesetzt und in 5 µM-M9-Puffer auf dem Agarose-Pad übertragen. Die Agarose-Pad wurde dann mit einem Deckgläschen bedeckt. Würmer wurden bei 200 X und 400 X Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-Mikroskopie Funktionen angesehen. Bilder wurden unter differential Interferenz-Kontrast (Nomarski) und Epifluoreszenz Optik geschaffen. Die fluoreszierende Bilder wurden erweitert mit Software (Abb. 3A). Zeit-Serie Mikrographen infizierte Würmer festgestellt, dass C. Albicans im Darmlumen am dritten Tag der Assay17kolonisiert. Infizierte Würmer zeigte schwerer Darm Distension als bei nicht infizierten Kontrolle.

Genetische und pharmakologische Werkzeuge, um Infektion zu studieren
Als nächstes haben wir das Modell mit genetischen und pharmakologische Modulation getestet. Wir testeten auch zuvor dokumentierten Virulenzfaktoren, die Regeln von Bodenaggregaten Übergang von C. Albicans25 und haben gezeigt, dass in in-Vivo -Infektionen von Mäusen und Nematoden20,26 wichtig sein . Wir testeten die Fähigkeit der Würmer, Infektion, die durch C. Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 doppelte Mutant. überleben Efg1 ist ein Transkriptionsfaktor, der hoch konserviert und ein wesentlicher Bestandteil der zyklische AMP/Protein Kinase A (PKA) Stoffwechselweg. Dieser Weg regelt in C. Albicans Bodenaggregaten Morphogenese27, weiß-opak switching-28und ein ganzes Arsenal an wichtigsten Virulenzfaktoren. Diese Virulenzfaktoren sind Hwp1 und Hwp2, zwei Hefe-spezifische Zellwandproteine Adhäsion und Biofilmbildung, Eap1, eine Zellwand Adhäsin Bindung an menschliche Epithelzellen29, beteiligt und Sap5, eine hydrolytische Enzyme beteiligt beteiligt Epithelgewebe Invasion30. Cph1 ist ein Transkriptionsfaktor, der regelt viele metabolische Prozesse einschließlich Paarung, Filamentierung und Biofilmbildung und hat gezeigt, dass eine kritische Rolle bei der schädlichen Epithelzellen31 und menschlichen rekonstruierten Epithel21 . Störung von einem dieser Gene hat einen signifikanten Einfluss auf Virulenz und gleichzeitige Unterbrechung beider in cph1/cph1efg1/efg1 Ergebnisse in dramatischen Virulenz Reduktion in verschiedenen Tiermodellen, darunter Mäuse25, Drosophila 32, Zebrafisch33,34 und Motte34. Die cph1/cph1efg1/efg1 doppelte Mutante gilt von C. Albicans -Gemeinschaft als avirulent Belastung per Definition und der Goldstandard für die Validierung neuartiger Modellsysteme. Efg1Δ und cph1Δ einzelne Mutanten zeigte verminderte Dar (~ 10 % und ca. 50 %, beziehungsweise) im Vergleich mit den Verwandten Wildtyp während der efg1Δ cph1Δ doppelte Mutant nicht Dar Antwort17zu entlocken. Diese Ergebnisse rekapitulieren die Muster der Virulenz in Mäusen, wo die cph1∆ mutierten leicht abgeschwächt wird, ist die efg1∆ mutierten SiGnificantly abgeschwächt, und die doppelte Mutante ist völlig avirulent25. Würmern infiziert mit cph1/cph1 efg1 / efg1C. Albicans doppelte Mutant lebten statistisch signifikant länger als Steuerelemente (p < 0,01 für Log Rank und Breslow statistische Test, n = 60) darauf hindeutet, dass diese zwei Gene für C. erforderlich sind Albicans Virulenz gegen C. Elegans (Abb. 3 b).

Um die Möglichkeit der Nutzung unserer C. Elegans -Modell für potenzielle Drogentest zu erkunden, haben wir die Wirkung des Zusatzes von Fluconazol auf das endgültige Ergebnis der Infektion getestet. Wir verwendeten eine Vielzahl von unterschiedlichen Konzentrationen von Fluconazol und festgestellt, dass 50 µM gab uns die wichtigsten Ergebnisse. Würmern infiziert mit C. Albicans und 50 µM Fluconazol (Abb. 3 b) lebten statistisch signifikant länger als Kontrollen (p < 0,01 bei Log Rank und Breslow statistische Test, n = 60). Diese Konzentration wurde empirisch ermittelt (siehe die Anmerkung am Ende des Protokolls Schritt 7, "Infektion Platte einrichten"). Diesen Nachweis der Grundsatz Experimente zeigten, dass unsere Nematoden Modell für ein kleines Molekül antimykotische Screening verwendet werden kann. Das Modell war in der Tat maßgeblich an der Entdeckung der Filastatin, ein kleines Molekül hemmt verschiedene Aspekte der Pilz Virulenz, die derzeit weitere präklinische Studien24stattfinden. Dementsprechend eignet sich unsere Assay für die Virulenz-Strategien von C. Albicans und pharmakologische Wirkstoffe zu erforschen.

Studium der angeborenen Wirtsantwort
Als nächstes wollten wir die gegenseitige Host Verteidigung gegen Krankheitserreger, zu studieren, da Aspekte dieser angeborenen Immunität in Säugetieren11,35konserviert sind. Es ist bekannt, dass C. Elegans als Bestandteil seiner Abwehrmechanismus ROS auf beide Bakterien-und Pilzinfektionen18,36,37 produziert. ROS ein Biozid wirken auf eindringende Organismen und spielen eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunität. zcf15/zcf15 hyper Anfälligkeit für ROS in Vitro führte uns zu vermuten, dass seine reduzierten Virulenz in C. Elegans aufgrund einer reduzierten Fähigkeit zu widerstehen war, dass der Hosts ROS erzeugt. Um unsere Hypothese zu testen, haben wir bestimmt die Fähigkeit des zcf15/zcf15 , Wildtyp Würmer oder Würmer mit eingeschränkter Fähigkeit, ROS produzieren zu töten. Repräsentative C. Albicans mutierte zcf15 , die empfindlich auf reaktive Sauerstoffspezies (Abb. 4A) zeigte reduziert Virulenz in Wildtyp C. Elegans. C. Elegans reagiert auf Einnahme des Erregers durch die Herstellung von extrazellulären ROS im Darmlumen über Ce-Duox1, eine NADPH-Oxidase kodiert durch das Gen Bli-3. Während der ROS-Produktion produzieren die Darmzellen auch intrazelluläre Antioxidantien über DAF-16 , seine eigenen Gewebe vor der ROS schädliche Effekte36,38zu schützen. CE-Duox1 ist ein Protein mit einer N-terminalen Peroxidase-Domäne, eine C-terminale Superoxid erzeugen NADPH-Oxidase Domain und zwei zentrale Calmodulin-Bindungsstellen39. Auf mikrobielle Infektion verwendet dieses Protein cytosolischen NADPH um zu extrazellulären toxischer ROS im Darmlumen gegen die Infektion zu generieren. In einer Reihe von biochemischen Assays in einer 2009 durchgeführten Studie zeigten Jain Et Al. , dass ROS reichlich auf Hefe-Infektion produziert sind und dass Bli-3 Verlust der Funktion über bli-3(e767) die Fähigkeit von Nematoden reduziert, ROS zu produzieren. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, Würmer, die vor der Herausforderung, zcf15/zcf15 überlebt deutlich länger als Wildtyp oder ergänzt Stämme (p < 0,01 durch die Log-Rank-Test) darauf hinweist, dass ZCF15 für Virulenz erforderlich ist. Jedoch, wenn wir herausgefordert ROS-defizienten C. Elegansbli-3(e767), wir erhalten Kinetik der Tötungen, die zwischen den zcf15/zcf15, Wildtyp und ergänzt Belastung (Abbildung 4) vergleichbar waren. Dieses deutet darauf hin, dass zcf15/zcf15 fehlschlagen, Nematoden zu töten, es sei denn, der Möglichkeit des Hosts, ROS zu produzieren gefährdet ist. Zusammen genommen, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ZCF15 für volle Virulenz erforderlich ist und, dass dieses gen der Erreger-Resistenz gegen Gastgeber wahrscheinlich beteiligt ist ROS erzeugt. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies das erste Mal, die ZCF15 nachweislich Pathogenität und ROS Widerstand beteiligt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung von C. Elegans Infektion. C. Elegans , eine Mischung aus E. Coli -Stamm OP50 und ein Erreger ausgesetzt sind und über einen Zeitraum von 4 Tagen nach erreichen des Erwachsenenalters für Anzeichen einer Infektion und das Fortschreiten der Erkrankung beobachtet.

Figure 2
Abbildung 2: Krankheit Phänotypen. (A) verformt Analbereich (Dar) ist sichtbar (mit einem Pfeil gekennzeichnet) als eine Schwellung im post Analbereich von infizierten Worms (rechte Abbildung) vier Tage post Exposition. Die Würmer auf der linken Seite sind nicht infiziert und als Kontrolle dienen. (B) eine Teilmenge (~ 15 %) der infizierten Würmer zeigen eine Schwellung der Vulva (rechte Abbildung, mit einem Pfeil gekennzeichnet) im Vergleich zu nicht infizierten Kontrolle Würmer (links), der disseminierten Infektion matricidal Todesfolge darstellt. Alle Bilder wurden aufgenommen, wie in der repräsentative Ergebnisse18beschrieben.

Figure 3
Abbildung 3: C. Albicans - C. Elegans Modell ist offen für mikroskopische Manipulation und pharmakologisch und genetisch moduliert werden. (A) C. Albicans getaggt mit RFP Akkumulation in der Nematoden Darmlumen Tag 3 Post-Infektion. Hefezellen sind schnell von den Würmern eingenommen und reichern sich im Darmlumen völlig intakt, darauf hinweist, dass sie in der Lage zu überleben, die mechanische Zerkleinerung des Rachens. Bilder wurden aufgenommen, wie in der repräsentative Ergebnisse18beschrieben. (B) Kaplan-Meier Überleben Kurven der Nematoden mit Wildtyp C. Albicans, cph1/cph1efg1/efg1 doppelte Mutant oder Wildtyp C. Albicans + 50 µM im Vergleich zu nicht infizierten Kontrolle Würmer Fluconazol in Frage gestellt.

Figure 4
Abbildung 4. ZCF15 ist erforderlich, um widerstehen C. Elegans ROS erzeugt. (A) ZCF15 ist verantwortlich für den Wildtyp Widerstand gegen Paraquat, die bekannt ist, um reaktive Sauerstoffspezies zu generieren. Wildtyp, Ko oder ergänzt Sorten wurden gezüchtet in Flüssigkultur über Nacht und resuspendierte, OD = 1. Kulturen wurden je verdünnter 1:5 und auf YPD oder YPD mit 1 mM Paraquat vernickelt. C. Elegans produzieren ROS über Bli-3 , um die Erreger zu bekämpfen, die das Darmlumen38eindringen. (B) Kaplan-Meier-Survival-Kurven zeigen, dass ZCF15 löschen die Tötung von Wildtyp Würmer begrenzt. (C) der Kaplan-Meier überleben Kurve zeigt ähnliche Zuwachsraten des Überlebens zwischen zcf15/zcf15, Wildtyp und ergänzt Belastung bei ROS-defizienten C. elegansbli-3(e767) infiziert wurden.

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Discussion

Die Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Infektion und das Überleben Lebensdauer Überbelichtung zu C. Albicans , die wir beschrieben haben können geändert werden, um eine andere Erreger zu testen. Flüssige Kulturen anderer Bakterien oder Pilze können gemacht und C. Elegans in ähnlicher Weise zugeführt. Darüber hinaus können serielle Infektionen untersucht werden durch die Larve zu einem Erreger zunächst auszusetzen, wie beschrieben, und dann die Übertragung der Tiere auf eine neue Platte mit einer separaten Erreger nach erreichen des Erwachsenenalters.

Während der Durchführung dieses Tests, ist es wichtig, sorgfältig auf Timing achten. Zunächst unbedingt beim Ausfüllen Ei Vorbereitung um Eiern zum Test zu ernten, die Höhe der Zeit zu begrenzen, die die Eizellen bleichen ausgesetzt sind. Der Zeitaufwand für Erwachsene in das Bleichmittel-Lösung um den Eiern freizugeben auflösen variiert. Sofort nach der Verabreichung der Bleichmittel-Lösung, muss die Wurm-Lösung genau unter dem Mikroskop Dissektion beobachtet werden. Nach ca. 70 % der Würmer aufgelöst haben, sollte die Lösung zentrifugiert werden. Wenn Ei Vorbereitung nicht lebensfähige Eiern nachgeben, verringern Sie die Konzentration der Bleichmittel oder der Dauer der Exposition zu bleichen. Beim Ausfüllen dieses Tests, ist es auch wichtig, dass die Übertragung von Erwachsenen Würmer auf neue Teller Aufmerksamkeit gewidmet wird nach Bedarf, um zu vermeiden, verwirrende Probanden mit ihren Nachkommen. Begrenzung der Anzahl von Eiern, die zu Beginn des Tests bis zu 25-30 Eiern überzogen sollte dies auch verhindern. Schließlich verringert die Übertragung von Erwachsenen Würmer auf neue Teller häufig auch die Chancen von Würmern kriechen herauf die Seiten der Petrischale und sterben.

Wir haben ein vielseitiges Modell Gastgeber für das Studium von pathogener oder kommensaler Beziehungen zwischen Mikroben oder eine Mikrobe und seinen Wirt Caenorhabditis Elegans genutzt. Unser System kann als ein Instrument zur Untersuchung mikrobieller oder Host-Mikroben-Interaktion auf zellulärer und molekularer Ebene mit vorwärts- und gentechnische Ansätze, sondern auch für die Erkundung neuer Moleküle für eine therapeutische Intervention verwendet werden. Wir zeigten die Vielseitigkeit dieses Systems durch die Durchführung eines genetischen Bildschirms, um Gene, die dazu beitragen, Virulenz40, die mikrobielle Fitness41, diejenigen zu identifizieren, die vermitteln Wirtsantwort Mikroben17, 18, sowie mit dem Modell für Anwendungen mit hohen Durchsatz für Drug Discovery24. Dies ist ein gutes Modell für die Verwendung durch Studenten, weil es nicht notwendig teuren Infrastruktur weiterhin Kolonien, wenn man bedenkt, dass Tiere Cryo für zukünftige Anwendungen aufbewahrt werden können. Schließlich stellt dies eine perfekte "Vermittler" für in-vitro- Studien und murinen Modelle.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durchgeführt und unterstützt von Worcester Polytechnic Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

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Genetik Ausgabe 128 mikrobielle Wechselwirkungen Virulenzfaktoren Erreger angeborene Verteidigung Tiermodell Caenorhabditis elegans
Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig <em>In Vivo</em> Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen
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Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The… More

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

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