Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный в Vivo модель для изучения хост микробных взаимодействий

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Здесь мы представляем нематоды Caenorhabditis elegans как универсальный хост модель для изучения взаимодействия микроорганизмов.

Abstract

Мы демонстрируем метода с помощью Caenorhabditis elegans как модель для изучения взаимодействия микроорганизмов. Микробы вводятся через диетические, делая основное расположение для заболеваний ЖКТ. Нематоды intestine структурно и функционально имитирует млекопитающих кишечника и прозрачна, что делает поддаются микроскопическое исследование колонизации. Здесь мы покажем, что патогенные микроорганизмы могут вызвать болезни и смерти. Мы в состоянии определить микробных мутантов, которые показывают изменения вирулентности. Ее сохраняется врожденный ответ биотических стрессов делает C. elegans отличной системой зонда грани принимающей innate иммунных взаимодействий. Мы показывают, что хосты с мутациями в гене двойной оксидазы нельзя производить реактивнооксигенных видов и не могут противостоять микробов оскорбление. Мы далее продемонстрировать универсальность представленных выживания assay, показывая, что он может использоваться для изучения последствий ингибиторы роста микроорганизмов. Этот assay может также использоваться для обнаружения Факторы вирулентности грибковых как цели в области развития новых противогрибковых агентов, а также обеспечить возможность для дальнейшего выявления хост микробных взаимодействий. Дизайн этот assay хорошо поддается высокой пропускной способности всего генома экранов, в то время как способность червей крио сохранить для будущего использования делает его экономически эффективным и привлекательным целом животных модель для изучения.

Introduction

C. elegans был использован как организм мощные модели для более чем 50 лет. В 1960 году Южной Африки биолог Сидней Бреннер пионером в использовании C. elegans для изучения развития нервной системы, проложив путь для длинные линии ученых для изучения различных аспектов биологии клетки и животных в нематод. Эта линия включает в себя лауреатов Нобелевской премии, Крейг Мелло и Эндрю огонь для работы их RNAi1, Роберт Horvitz Салстон, Джон за их работу по развитию орган и апоптоз2,3,4и Мартин Чалфи для его работы на Зеленый флуоресцирующий белок5. Хотя эта модель организма традиционно использовались для изучения молекулярных и развития биологии, за последние 15 лет, исследователи начали использовать C. elegans для изучения биологии различных патогенов человека, включая Pseudomonas aeruginosa, золотистый стафилококк, Salmonella entericaи Serratia marcescens6,,78,9,10. Эти исследования показали, что многие механизмы, участвующие во взаимодействии человека возбудитель сохраняются в нематод, но и что существуют некоторые механизмы иммунитета, которые являются уникальными для этой модели организма11,12. В природе C. elegans встречает различных угроз от попадает патогенных микроорганизмов, присутствующих в почве, и это оказывает сильное селективного давления развиваться и поддерживать сложные врожденной иммунной системы в его просвете кишечника. Многие из генов и механизмов в деле защиты кишечника люмен организовали хорошо сохранились элементы, которые также существуют в высших млекопитающих11,13. C. elegans поэтому представляет большой модели для изучения желудочно-кишечных патогенов как Salmonella enterica14, Shigella boydii15или16 вибрион холеры.

Здесь мы подчеркиваем замечательный универсальность C. elegans как хозяин модель для изучения инфекционных агентов, таких как C. albicans. C. elegans как модель хост позволяет для высокой пропускной способности скрининга для вирулентности, что является менее дорогостоящим и трудоемким, чем модель мыши, которой обычно используется для изучения кандидоз42.

В этом исследовании мы показываем, что эта модель и подсказать выживания assay может использоваться надежно для изучает принимающей врожденной иммунной эффекторов важно противодействовать инфекций, возбудителя определяющих факторов вирулентности, диск и фармакологические соединений, которые могут вмешиваться в патогенезе. Отличается от ранее описанных анализов, этот метод обеспечивает средства изучения воздействия возбудителя в течение животного, от личиночной стадии взрослой жизни, а не только взрослой жизни до смерти43,44. В целом, наши C. elegans - C. albicans модель является универсальный и мощный инструмент, который может использоваться не только для изучения генетических основ, которые управляют инфекция и иммунитет, но и для выявления новых соединений для терапевтического вмешательства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка нематода роста среднего (НГМ)

  1. за 1 Л СМИ, объединить 20 g агар, 2.5 g источник органический азот (например, bacto Пептон) и 3 г, натрия хлорида в колбе 2 Л. Добавить 975 мл стерильной воды.
    1. Добавить в баре стерильных перемешать. При использовании автоматического СМИ Заливщик, автоклавные трубки и СМИ для 15 мин; СМИ должны быть газобетона для больше если высокой громкости производится.
  2. Набор средств массовой информации на табличке, перемешайте и дайте ему остыть.
    1. После того, как средства массовой информации теплый на ощупь (приблизительно 60 ° C) асептически добавьте 1 mL 1 М MgSO 4 ● H 2 O, 1 мл 1 М CaCl 2, 25 мл КПО 4 и 1 мл 0,5% холестерина в этаноле.
    2. Налить СМИ (вручную, или автоматический насос) под ламинарным потоком в 35 мм x 10 мм стерильные чашки Петри. Дайте высохнуть под капотом на 1-2 дня перед использованием.
      Примечание: Плиты следует хранить при 4 ° C для предотвращения контаминации.

2. Делая червь, выбрать

  1. Cut 1,5 см кусок алюминиевой проволоки. Осторожно вставьте примерно 0,5 см длины в наконечник пипетки Пастера.
    1. С помощью горелки Бунзена или алкоголя лампа, расплавить кончик Пипетки стеклянные, медленно повернув в пламени до тех пор, пока проволока надежно привязан к пипетку, без ущерба для оригинального форма кончика пипетки.

3. Подготовка культуры е. coli

  1. с помощью стерильных цикла, прививать единой колонии штамма E. coli ОР50 в бульоне Лурия 200 мл. Инкубируйте на ночь с встряхивания на 37 ° C.
  2. Жидкий культура готова к использованию следующий день и могут храниться при температуре 4 ° C когда не в пользе.
    Примечание: Штамм кишечной палочки, ОР50, используется в качестве источника пищи для C. elegans. Эта культура может быть использован для до нескольких месяцев, при температуре 4 ° с.

4. Основные обслуживания C. elegans

  1. семян подготовленный кровянистые выделения приблизительно 50-100 мкл подготовленных ОР50 жидкость культуры на центре пластины NGM плиты агара с E. coli.
  2. Накладки и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение 24 ч. После высыхания, поместите пластины при 37 ° C ночь для быстрого роста или держать при комнатной температуре, если замедление роста.
  3. Добавить червей к пластине, либо " фрагментации, " (см. шаг 5 протокол " Chunking и комплектации червей "), сбор червей индивидуально, или размещение яиц гельминтов непосредственно на пластину (см. шаг 6 протокол " яйцо подготовка ").

5. CHUNKING и комплектации червей

Примечание: " фрагментации, " относится к практике, которая распространена в C. elegans обслуживания. Это включает резки раздел, содержащий червей плиты агара НГМ и передачи этот кусок на новую пластину, таким образом также передавать большое количество червей в процессе. Загрязнение также могут быть сокращены из плиты таким образом. При выборе червей, важно сохранить целостность агар, потому что черви могут быть потеряны в отверстия в Агаре. Кроме того, важно забрать остыть прежде чем касаться пластину для предотвращения плавления агара или сжигание червей.

  1. Для того, чтобы быстро передавать большое количество червей на новые пластины, вырезать кусок NGM агар, содержащий выбранный червей с помощью шпателя. Удалять отрезанный кусок и поместите его лицевой стороной вниз на окраине Лон ОР50 на новой пластинкой.
  2. Передачи червей индивидуально, как описано ниже в протокол шаг 8.2, " Assay выживаемости, " с помощью червь выбрать. Пламя провод в червь выбрать до тех пор, пока это красный. Снять с огня и дайте ему остыть в течение нескольких секунд.
  3. С помощью проволоки на подбор, аккуратно почистить газон ОР50 культуры, выращенных на новой пластины, охватывающих провод на подбор.
  4. Вязкой культуры, охватывающей кончик проволоки делает червей придерживаться кончик забрать, таким образом мягко забрать выбранных червей с помощью прокрутки движений.
  5. После того, как собраны отдельные червей, поместите их на новую пластину, осторожно проводя культуры через агар. Поместите провод в пламя, чтобы удалить оставшиеся культуры на подбор.

6. Яйцо подготовка

  1. место около 20 взрослых животных (примерно 2-3 дней после вылупления, когда выросли на 20 ° C), сбор или повреждениям, как описано в шаге 5, протокол " Chunking и комплектации червей, " на тарелку с семенами с 50 Мкл штамма кишечной палочки, ОР50.
  2. Собирать яйца, наводнение пластины с 10 мл M9 буфера после 1-2 дня. С помощью стеклянные Серологические Пипетки, вихрем и мягко агитировать содержимое на пластину агар выпустить яйца, застрял в ОР50 или взрослых животных. Собрать все жидкости, содержащие яйца и взрослых.
  3. Передачи M9 и ОР50 решение в 15 мл Конические трубки. Центрифуга для 15 мл конические пробки на 2100 x g на 2 мин
  4. Аспирационная приблизительно 9 мл супернатант не нарушая Пелле ОР50.
  5. Ресуспензируйте Пелле в 2 мл стерильной воды и 1 мл отбеливателя, 1 мл 0,25 М NaOH.
  6. Осторожно перемешать путем инверсии, до тех пор, пока большинство (около 70 процентов) взрослых животных появляются лизированных; как правило, яйца остаются нетронутыми во время этой короткой отбеливатель лечения из-за их оболочки. Центрифуга для конической трубки на 990 x g на 2 мин
  7. Аспирата супернатант не нарушая гранулы. Вновь приостановить гранулы в 10 мл буфера M9.
  8. Центрифуга Конические трубки в 990 x g для супернатант аспирата 2 мин без тревожных Пелле. Вновь приостановить лепешка с 200 мкл буфера M9.
    Примечание: Яйцо подготовки может потребоваться несколько судебных процессов. Яйца могут быть уничтожены, если они подвергаются воздействию отбеливателем слишком долго. Если не высиживают яйца, либо уменьшить концентрацию отбеливатель в растворе или уменьшить длительность воздействия поддаются отбеливанию.

7. Установка плиты инфекции

  1. обойтись 3-5 мл YPD в стерильную пробирку и прививать с одной колонии Candida albicans с помощью стерильных цикла.
    1. Место трубки на вращательное барабан для примерно 16-18 ч на 30 ° C.
  2. Label один 1.5 мл отцентрифугировать трубка содержит C. albicans, а другой содержит ОР50. Запишите вес каждого пустого трубки.
    1. Место 500 мкл ночь C. albicans культуры в трубу помечены C. albicans и 1 500 мкл на ночь ОР50 культуры (от шага 3.1) в трубу, помечены ОР50.
    2. Центрифуги за 10 минут на 16,100 x g. аспирата супернатант без тревожных Пелле.
    3. Вновь приостановить каждой лепешки с 500 мкл стерильной водой. Центрифуги для 5 минут на 16,100 x г.
    4. Аспирата супернатант не нарушая гранулы. Записать Окончательный вес трубки отцентрифугировать.
    5. Определить вес каждой гранулы путем вычитания начальный вес отцентрифугировать трубок от окончательного веса.
  3. С помощью стерильной воды, повторно приостановить C. albicans гранул до 10 мг/мл и Пелле ОР50 до 200 мг/мл. Сделать мастер инфекции перемешать путем объединения 10 мкл раствора 50 мг/мл стрептомицина, 2.5 мкл ОР50 культуры, 0.5 мкл C. albicans культуры и 7 мкл стерильной воды.
    1. Для контроля пластин, создать главный микс, заменив объем C. albicans культуры стерильной водой. Семя 20 мкл инфекции смесь или раствор ОР50 управления на центр NGM пластины с помощью микропипеткой.
      Примечание: Около 100 червей необходимы для определения статистической значимости во время анализа. Этот assay обычно выполняется в трех экземплярах. Таким образом производится 3.2 x микс инфекции, а также 3.2 x решение управления. Эти смеси сделаны быть немногим более 3 x оригинал для обеспечения что полный 20 мкл посеян на каждой пластине, позволяя места для ошибок. Этот Мастер микс создан потому, что на начальных этапах личинок (L1-L3) потреблять C. albicans глотки червь слишком мал. Для воздействия на фармакологические средства, такие как флуконазол ( рис. 3B) агент вводится в смесь инфекции. Эмпирически определяется концентрация агента. Например, на рисунке 3B, 50 мкм флуконазол представлена, однако 0, 12,5, 25, 50 и 100 мкм Флуконазол также были протестированы, используя тот же протокол.

8. Анализ фенотипа деформированных анальной области (ПРБ) и выживания Assay

  1. визуализировать фенотип дар
    Примечание: дар лучше визуализируется на этапе L3 и за его пределами. Dar представлены как небольшой выступ в регионе анальный пост червя ( рисунок 2A), который со временем становится более заметным.
    1. Подтвердить, если у животного есть дар, быстро нажав пластину на сцене рассечение микроскопа; животных без дар будет двигаться назад немедленно, в то время как животные с дар будет либо повторил раундов выстукивать в обратном направлении их, или они не будет делать это на всех.
  2. Assay выживаемости
    1. Подготовка полного яйцо, как описано в шаге 6, протокол " подготовка яйцо ". Количество яиц в сферу рассечение и разбавить раствор яйцо с M9, пока не будет достигнуто в концентрации примерно 5-6 здоровых яиц в мкл. С помощью пипетки, обойтись 20 мкл пример, содержащий около 30 яиц на подготовленных NGM пластину, в районе между бактериальной культуры и боковые пластины (яйца и питание червей, ОР50, находятся в двух различных пятен).
    2. Инкубировать пластины при 20 ° C в течение 48 часов. Под микроскопом, рассечение подсчитать количество живых и мертвых взрослых червей на каждой пластине, а также количество червей с дар. Запись % с дар.
    3. Рассмотреть животное мертвых, если он не отвечает на использован алюминиевый провод или нажав на табличке на голове.
    4. Каждый день, передачи оставшихся взрослых червей по комплектации, как описано в шаге 5, протокол " Chunking и комплектации червей, " на новой инфекции или управления пластину. На данный момент, при необходимости, выполнить assay выживаемости, отслеживая количество глистов живут, погибших и пропавших без вести каждый день.
      Примечание: Этот assay может работать на две недели, начиная с подготовки яйцо. Кроме того решение яйцо должно не обойтись на бактериальной культуры, как решение может содержать следы отбеливателем, который может убить ОР50. Решение следует также отказаться от примерно 0,5 см от края пластины, как яйца могут стать застрял между стороны пластины и агар. Кроме того, ввиду быстрого распространения червей, передачи взрослых на новые пластины важно отделить их от их потомства.
  3. Анализировать выживание
    1. анализировать результаты, используя программное обеспечение для анализа кривой выживания (см. перечень материалов).
    2. Сравнить выживания кривых с помощью метода Grehan-Бреслоу-Вилкоксон (предполагая, что данные с ранних времен выживания являются более точными, чем более поздние времена, вес данные соответственно) а также Logrank статистические инструменты 45.
      Примечание: К примеру, в рисунке 4В -C, выживание червей, получавших мутант C. albicans сравнивается с тех, кто лечится isogenic одичал тип элементов управления или complementarystrains.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Патогенез пробирного (рис. 1), используя C. albicans и C. elegans ранее был описан в нашей лаборатории17,18 и19,других лабораторий20. Мы демонстрируем ограниченой использования C. elegans для изучения C. albicans вирулентности, показывая что C. albicans клетки быстро заглатывается червей и накапливаются в просвете кишечника, вызывая медленнее локомоции, деформированные анальный регион (дар) (рисунок 2A), отек вульвы (рис. 2B), вздутие кишечника (Рисунок 3А), и летальность (рис. 3, рис. 4). Мы также измерить продолжительность жизни инфицированных червей как количественная мера фитнес. Например, C. elegans инфицированных C. albicans живут 10-12 дней по сравнению с 20-22 для неинфицированных элементов управления. В C. elegans инфицированных C. albicans двойной нокаут мутант, efg1/efg1 cph1/cph1, которые являются двумя ключевыми вирулентности факторы, необходимые для инфекции в мыши, крыс и человека эпителиальных модели21, 23, нематоды выжил значительно дольше, чем элементы управления (рис. 3B). Эти эксперименты показывают, что некоторые из уроков, которые мы узнаем в этой простой модели о C. albicans вирулентности могут оставаться в силе в высших млекопитающих и наоборот.

Мы также показывают, что система нематоды модель может быть фармакологически модуляцией (рис. 3B). Присутствии флуконазол, наиболее часто назначаемых противогрибковый препарат, черви, оспаривается с C. albicans выжил значительно дольше, чем элементы управления. Это доказательство принцип эксперимент свидетельствует о том, что нематоды модель может использоваться для проверки малых молекул. Действительно наша модель C. elegans сыграл важную роль в выявлении filastatin, малые молекулы, ингибирующих различные аспекты грибковых вирулентности24.

Заболевание фенотипы и микроскопический анализ C. elegans инфекции
C. elegans были подвержены C. albicans в течение шести дней и отметил признаки инфекции, прогрессирование заболевания и смерти. Фенотип дар является наиболее видимым день 4 assay выживаемости, как отметил выступающий анальной области, которая не видна в незараженных животных (рисунок 2A). Черви, заражены C. albicans известны также демонстрируют отеки в области вульвы (рис. 2B). В обоих случаях червь не может очистить инфекции после достижения этой стадии. Для того, чтобы визуализировать колонизации C. albicans в просвете кишечника, черви кормили одичал тип C. albicans отмеченных ППП, которые вызывают области колонизации флуоресцировать красный (рис. 3A). Для того чтобы произвести эти образы, червей были под наркозом на 2% агарозном pad, содержащие азид натрия 0,01 М. Черви были подвержены одичал тип C. albicans или ЗП тегами C. albicansи переведены в 5 мкм M9 буфер на площадку агарозы. Pad агарозы был затем покрывается coverslip. Черви рассматривались на 200 X и 400 кратном увеличении с помощью инвертированного микроскопа с возможностями флуоресцентной микроскопии. Изображения были созданы под дифференциальной помехи контраст (Номарски) и эпифлуоресцентного оптика. Флуоресцентного изображения были расширены с помощью программного обеспечения (рис. 3A). Время серии микроскопии зараженных червей определяется, C. albicans колонизирована на третий день пробирного17просвета кишечника. Зараженных червей показали более тяжелых кишечных растяжение чем наблюдаемых в элементе неинфицированных.

Генетические и фармакологические средства для изучения инфекции
Далее мы протестировали модель с использованием генетического и фармакологические модуляции. Мы также протестировали факторы ранее документально вирулентности, которые регулируют гиф переход C. albicans25 и показали важную роль в в естественных условиях инфекции мышей и нематод20,26 . Мы протестировали червей способность выжить инфекции, вызванной C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 Двухместный мутант. Efg1 это хорошо сохранились транскрипционный фактор и важным компонентом ЦАМФ/протеин киназы (PKA) метаболический путь. В C. albicans этот путь регулирует гиф морфогенеза27, белый укрывистая переключения28и Арсенал вирулентности ключевых факторов. Эти факторы вирулентности включают Hwp1 и Hwp2, два дрожжей конкретной клеточной стенки белков, участвующих в адгезии и биопленки, Eap1, стены клетки принимает участие в привязке к эпителиальных клеток человека29и Sap5, гидролитических ферментов, участвующих в Эпителиальная ткань вторжения30. Cph1 является транскрипционным фактором, который регулирует многие метаболические процессы, включая спаривания, филаментацию и биопленки и было показано, чтобы играть решающую роль в ущерб эпителиальных клеток31 и человека реконструированный эпителий21 . Нарушение любого из этих генов имеет значительное влияние на вирулентности и одновременное нарушение как в cph1/cph1efg1/efg1 результаты в драматических вирулентности сокращения в различных моделях животных, включая мышей25, дрозофила 32, данио рерио33,34 и моли34. Cph1/cph1efg1/efg1 Двухместный мутант считается avirulent штамм по определению и золотой стандарт для проверки систем Роман модель сообществом C. albicans . Efg1Δ и cph1Δ Одноместный мутантов, показали снижение дар (~ 10% и ~ 50%, соответственно) по сравнению с близкими дикого типа, в то время как двойной мутант efg1Δ cph1Δ удалось добиться дар ответ17. Эти результаты пилки шаблон вирулентности мышей, где cph1∆ мутант немного ослаблены, efg1∆ мутант является сиgnificantly ослабленных, и двойной мутант является полностью avirulent25. Черви инфицированных efg1 cph1/cph1 / efg1C. albicans двойной мутант жили статистически значимо больше, чем контроль (p < 0.01 для журнала ранга и Бреслоу статистический тест, n = 60) о том, что эти два генов необходимы для C. Albicans вирулентности против C. elegans (рис. 3B).

Для того, чтобы изучить возможность использования нашей модели C. elegans для потенциальных наркотиков скрининг, мы протестировали эффект добавления флуконазола на конечный результат инфекции. Мы использовали целый ряд различных концентраций флуконазола и обнаружил, что 50 мкм дал нам наиболее значимых результатов. Черви, инфицированных C. albicans и 50 мкм флуконазол (рисунок 3B) жили статистически значимо больше, чем контроль (p < 0,01 в рейтинг журнала и Бреслоу статистический тест, n = 60). Эта концентрация определялась эмпирически (см. Примечание в конце протокола шаг 7, «инфекции пластины Настройка»). Эти доказательства принцип эксперименты показали, что наши нематоды модель может использоваться для малых молекул противогрибковые скрининга. Модель на самом деле сыграл важную роль в открытии filastatin, малые молекулы, ингибирующих различные аспекты грибковых вирулентности, которые в настоящее время переживает далее доклинические исследования24. Соответственно наша пробирного подходит для изучения стратегий вирулентности C. albicans и фармакологических агентов.

Исследование по врожденной хост ответа
Далее мы хотели бы изучить взаимное хост оборону против патогенов, поскольку аспекты этого врожденного иммунитета сохраняются в млекопитающих11,35. Хорошо известно, что C. elegans производит ROS на оба бактериальные и грибковые инфекции18,,3637 в рамках ее механизма обороны. ROS биоцидной скажется на вторжение организмы и играют важную роль в врожденного иммунитета. zcf15/zcf15 гипер подверженность рос в vitro привели нас к предполагают, что из-за пониженной способностью выдерживать его снижение вирулентности у нематоды Caenorhabditis elegans хозяина, сформированных рос. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы определили zcf15/zcf15 способностью убивать червей или одичал типа червей с нарушениями способности производить рос. Представитель C. albicans мутантов zcf15 , чувствительные к реактивнооксигенных видов (рис. 4A) показал снижение вирулентности в C. elegansодичал типа. C. elegans отвечает попадании возбудителя, производить внеклеточные рос в просвете кишечника через СЕ-Duox1, NADPH оксидаза, кодируется геном bli-3. В процессе производства рос кишечных клетки также производят внутриклеточных антиоксидантов Виа DAF-16 для защиты своих собственных тканей от36,повреждения эффекты ROS,38. CE-Duox1 — это белок с N-концевой домен пероксидазы, C-терминала генерации супероксидного NADPH оксидаза домена и два центральных Кальмодулин привязки сайтов39. После микробной инфекции этот протеин использует цитозольной NADPH для создания внеклеточного токсичных рос в просвете кишечника противостоять инфекции. На протяжении серии биохимических анализов в исследовании 2009 Jain et al. показал, что рос совершенно производятся на дрожжевой инфекции и что bli-3 потеря функции через bli-3(e767) резко снижает способность нематод производить рос. Как показано на рисунке 4В, черви, оспаривается с zcf15/zcf15 выжили значительно дольше, чем дикого типа или дополняться штаммов (p < 0.01 лог ранг тест) о том, что ZCF15 требуется для вирулентности. Однако, когда мы оспорили ROS-недостаточным C. elegansbli-3(e767), мы получили кинетики убийств, которые были сопоставимы между zcf15/zcf15, дикого типа и дополняет нагрузку (рис. 4 c). Это свидетельство показывает, что zcf15/zcf15 не удастся убить нематод, если принимающей способности производить ROS скомпрометирован. Взятые вместе, эти результаты показывают, что ZCF15 не требуется для полного вирулентности и что этот ген вероятно участвует в возбудителя способность сопротивляться узла создается рос. В меру наших знаний это в первый раз, что ZCF15 было показано, быть вовлечены в патогенности и ROS сопротивления.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление C. elegans инфекции. C. elegans воздействию смеси штамм E. coli ОР50 и возбудителя и наблюдается в течение 4 дней после достижения совершеннолетия для признаки инфекции и прогрессирование заболевания.

Figure 2
Рисунок 2: болезни фенотипов. (A) арматура анальный региона (дар) является видимым (обозначается стрелкой) как опухоль в регионе после анального зараженных червей (правая панель) через четыре дня после воздействия. Червей на левой панели неинфицированных и служить в качестве элемента управления. (B) (~ 15%) подмножество зараженных червей шоу отек вульвы (правая панель, обозначается стрелкой) по сравнению с неинфицированным управления червей (левая панель), которые представляет собой распространение инфекции, что приводит к matricidal смерти. Все изображения были взяты как описано в представительных результатов18.

Figure 3
Рисунок 3: C. albicans - C. elegans модель поддается микроскопических манипуляции и может быть фармакологически и генетически модуляции. (A) C. albicans , отмеченных накопление РФП в пост инфекции Кишечные нематоды люмен день 3. Дрожжевые клетки быстро заглатывается червей и накапливаются в кишечной люмен, полностью нетронутыми, указав, что они способны выжить механического дробления глотки. Изображения были взяты как описано в представительных результатов18. (B) Каплана-Мейера кривых выживания из оспаривается с одичал тип C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 Двухместный мутанта или одичал тип C. albicans + 50 мкм флуконазола, по сравнению с неинфицированным управления червей нематод.

Figure 438. (B) Каплана-Мейера кривых выживания показывают, что удаление ZCF15 ограничивает убийство дикого типа червей. (C) Каплана-Мейера выживания кривая показывает аналогичные показатели выживания между zcf15/zcf15, дикого типа и дополняться штамм, когда рос недостаточным C. elegansbli-3(e767) были инфицированы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы для assaying C. elegans инфекции и выживания за время жизни воздействия C. albicans , который мы описали могут быть изменены для проверки другой патогена. Жидкий культур другой бактерий или грибов могут сделаны и кормили в C. elegans в подобной манере. Кроме того, может быть assayed последовательных инфекций, сначала подвергая личинка в один возбудитель, как описано и затем передавая животных на новую пластину, содержащий отдельный возбудитель после достижения совершеннолетия.

При проведении этого анализа, важно обратить пристальное внимание на сроки. Во-первых при завершении подготовки яйцо для того, чтобы собирать яйца для assay, важно ограничить количество времени, которым яйца подвергаются отбеливателем. Количество времени, необходимое для растворения взрослых в раствор отбеливателя выпустить яйца варьируется. Сразу же после введения раствор отбеливателя, червь решения необходимо внимательно под микроскопом рассечение. После того, как примерно 70% червей распался, решение должно быть центрифугируют. Если яйцо подготовки не дают жизнеспособные яйца, уменьшите концентрацию отбеливатель или длительность воздействия для отбеливания. В завершении этот assay, важно также, что внимание уделяется передаче взрослых червей на новые пластины как необходимо избежать путаницы учебные предметы с их потомства. Ограничение на количество яиц, покрытие в начале assay до 25-30 яиц должны предотвратить это также. Наконец передача взрослых червей на новые пластины часто также снижает вероятность червей ползет вверх по бокам Петри и умирает.

Мы использовали Caenorhabditis elegans как узел универсальная модель для изучения патогенного или синантропных отношения между микробов или микроба и его хозяина. Наша система может использоваться как инструмент для исследования микробиологических или хост Микроб взаимодействия на клеточном и молекулярном уровне, с помощью прямого и обратного генетических подходов, но и для изучения новых молекул для терапевтического вмешательства. Мы продемонстрировали гибкость этой системы путем проведения генетических экрана, чтобы выявить гены, которые способствуют вирулентности40, связанные с микробной фитнес41, те, которые посредником хост ответ на микробы17, 18, а также с использованием модели для высокой пропускной способности приложений для обнаружения наркотиков в24. Это хорошая модель для использования студентов, потому что она не нуждается в дорогостоящей инфраструктуры для поддержания колонии, считая, что животные могут быть крио сохранились для будущих приложений. Наконец это обеспечивает идеальный «посредника» в vitro исследования и мышиных моделях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была выполнена на и поддерживаемых Вустер политехнического института.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).

Tags

Генетика выпуск 128 микробных взаимодействий Факторы вирулентности возбудитель врожденное обороны животных модель Caenorhabditis elegans
Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный <em>в Vivo</em> модель для изучения хост микробных взаимодействий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The… More

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter