Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Abstract

Biz Caenorhabditis elegans mikrobiyal etkileşim çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak kullanarak bir yöntem göstermek. Mikroplar bağırsak hastalığı için birincil konumunu yaparak diyet ile tanıtılmaktadır. Nematot bağırsak yapısal ve işlevsel olarak memeli bağırsak taklit ve yapım o mükellef kolonizasyon mikroskobik incelenmesi için saydamdır. İşte patojenler hastalık ve ölüm neden olabilir göstermektedir. Değiştirilmiş virülans göstermek mikrobiyal mutantlar tespit edebiliyoruz. Biyotik streslere korunmuş onun doğuştan gelen yanıt C. elegans ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık etkileşimleri yönleriyle araştırmak için mükemmel bir sistem yapar. Gösterdiğimiz ev sahipliği yapan çift oksidaz gen mutasyonları ile Reaktif oksijen türleri üretemez ve mikrobiyal hakaret direnmek mümkün değildir. Daha fazla çok yönlülük sunulan hayatta kalma testin inhibitörlerinin mikrobiyal büyüme etkileri çalışma için kullanılabilir göstererek göstermektedir. Bu tahlil yanı sıra roman antifungal ajanların gelişim için hedefler olarak mantar virülans faktörleri keşfetmek daha fazla ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri ortaya çıkarmak için bir fırsat sağlamak için de kullanılabilir. Cryo-koru solucanlar ileride kullanmak için yetenek çalışmak için bir maliyet-etkin ve çekici bütün hayvan modeli yapar iken bu tahlil tasarımını de yüksek üretilen iş için bütün-genom ekranlar, ödünç vermek kendisi.

Introduction

C. elegans 50 yıldan fazla bir güçlü model organizma kullanılmıştır. 1960'larda, Güney Afrikalı biyolog Sydney Brenner hücre ve hayvan biyolojisi nematodlar içinde çeşitli yönlerini incelemek için uzun bir soy bilim adamlarının önünü nöronal gelişim, eğitim için C. elegans kullanılmasına öncülük etmiştir. Bu soy Nobel Ödülü sahipleri Craig Mello ve Andrew Fire onların RNAi iş1için Robert Horvitz ve John Sulston organ gelişimi ve Apoptozis2,3,4onların çalışmaları için ve Martin Chalfie içerir Yeşil flüoresan protein5üzerine çalışmaları için. Bu model organizma geleneksel olarak son 15 yılda biyoloji, moleküler ve gelişimsel çalışmaya yolculuklarında uygulanmış olsa, araştırmacılar Biyoloji Pseudomonas dahil olmak üzere çeşitli insan patojenlerin araştırmak için C. elegans kullanmaya başladı aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericave Serratia marcescens6,7,8,9,10. Bu çalışmalar birçok insan-patojen etkileşimde yer alan ilgili mekanizmaların korunmuş ortaya nematodlar de, ama bu bu model organizma11,12' ye özgü bazı bağışıklık mekanizmaları vardır. Doğada, C. elegans tehditlerine karşı alınan patojenler toprakta mevcut çeşitli karşılaşır ve bu gelişmeye ve onun intestinal Lümen sofistike bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi korumak için güçlü bir seçici basınç sağlamıştır. Genler ve mekanizmaları intestinal Lümen korunması dahil çoğu aynı zamanda daha yüksek memeliler11,13' te var son derece korunmuş öğeler tarafından düzenledi. C. elegans bu nedenle Salmonella enterica14, Shigella boydii15veya kolera16gibi gastrointestinal patojenler çalışmaya büyük bir model temsil eder.

Burada biz C. elegans olağanüstü çok yönlü C. albicansgibi enfeksiyöz ajanlar çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak vurgulayın. C. elegans modeli ana bilgisayar olarak daha az pahalı ve zaman alıcı kandidiyazis42eğitim için yaygın olarak kullanılan bir fare modeli daha virülans için yüksek aktarım tarama sağlar.

Bu çalışmada, biz bu modeli ve assosiated hayatta kalma tahlil güvenilir ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık effectors enfeksiyonlar, virülans, sürücü patojen belirleyicileri karşı koymak önemli eğitim için kullanılabileceğini gösterir ve farmakolojik olabilir maddeler ve birleşimler patogenezinde müdahale. Yukarıda açıklanan deneyleri için birbirine benzemeyen, bu yöntem maruz kalma bir patojen hayvan sadece yetişkinlik yerine, yetişkinlik larva Sahne Alanı'ndan ölüm43,44ömrünü üzerinden eğitim için bir yol sağlar. Özet olarak, bizim C. elegans - sadece sürücü enfeksiyon ve bağışıklık genetik üsleri eğitim için aynı zamanda yeni bileşenleri, terapötik müdahale için tanımlamak için kullanılan çok yönlü ve güçlü bir araç C. albicans modelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) hazırlık

  1. için 1 L medya, 20 g agar, 2.5 g organik azot kaynağı (örneğin, bacto-pepton) ve 3 g sodyum klorür bir 2 L şişesi içinde birleştirmek. 975 mL steril su ekle.
    1. Ekle bir steril heyecan barda. Bir otomatik medya dökücü, otoklav boru ve medya 15dk için kullanıyorsanız; medya-meli var olmak autoclaved için artık daha fazla yapılırsa.
  2. Ayarla medya heyecan plaka üzerinde ve soğumasını bekleyin.
    1. Medya (yaklaşık 60 ° C) aseptik dokunmak sıcak olduğunda 1 M MgSO 4 1 mL ekleyin ● H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, KPO 4 25 mL ve 1 mL etanol içinde % 0.5 kolesterol.
    2. Medya (el ile veya otomatik pompa) laminar akış altında 35 mm x 10 mm steril petri yemekler dökün. 1-2 gün kullanmadan önce başlık altında kurumasını izin.
      Not: Tabak kontaminasyonu önlemek için 4 ° C saklanmalıdır.

2. Bir solucan almak yapım

  1. bir 1,5 cm parça Alüminyum tel kesme. Dikkatle bu uzunluğu yaklaşık 0.5 cm Pasteur pipet ucu takın.
    1. Bir Bunsen brülör veya alkol lamba, kullanarak Tel güvenli bir şekilde pipet pipet ucu orijinal şekli ödün vermeden yapıştırılır kadar yavaş yavaş alev içinde döndürerek cam pipet ucu eritebilir.

3. E. coli kültür hazırlanması

  1. bir kısır döngü kullanarak, koloni E. coli baskı OP50 Luria suyu 200 ml aşılamak. Gecede 37, sallayarak ile kuluçkaya ° C.
  2. Sıvı kültür ertesi gün kullanıma hazırdır ve kullanılmadığı zaman 4 ° C'de depolanmış olabilir.
    Not: E. coli gerginliği, OP50, için bir besin kaynağı olarak kullanılan C. elegans. Bu kültür için kullanılabilir birkaç ay 4'te saklandığında kadar ° C.

4. Temel C. elegans bakım

  1. NGM Ağar kaplamalar E. coli ile yaklaşık 50-100 µL hazırlanan OP50 sıvı kültür plaka Merkezi lekelenme tarafından hazırlanan tohum.
  2. Kuruyucu ve onları, oda sıcaklığında 24 h için kurumasını bekleyin. Sonra kuru, hızlı büyüme için gecede 37 ° C'de tabak yerleştirin veya daha yavaş büyüme isterseniz oda sıcaklığında tutun.
  3. Ekleyin solucanlar plakasına tarafından " parçalama, " (bkz: protokol adım 5 " Chunking ve malzeme çekme solucanlar "), solucanlar tek tek seçmek veya solucan yumurta doğrudan plaka üzerine yerleştirerek (bkz: protokol adım 6 " yumurta hazırlık ").

5. Chunking ve solucanlar toplama

Not: " parçalama, " C. elegans bakım ortak bir uygulama anlamına gelir. Bu bir bölüm solucan içeren NGM agar plaka kesme ve bu parça yeni bir tabak üzerine aktarılması, böylece aynı zamanda aktarılması sürecinde solucanlar, çok sayıda içerir. Kirlenme plaka bu şekilde dışarı kesebilir. Solucanlar seçilmesinde, solucanlar agar boşluklar kayıp olabilir çünkü agar bütünlüğünü korumak önemlidir. Buna ek olarak, agar erime veya solucanlar yanma önlemek için plaka dokunmadan önce soğuması çekme izin önemlidir.

    Hızlı bir şekilde solucanlar yeni Kaplamalar, üzerine büyük miktarlarda aktarmak için
  1. bir spatula kullanarak seçili solucan içeren NGM agar bir parça kesti. Kesilmiş parça çıkarın ve yüz aşağı OP50 çimenlerin üzerine yeni bir tabak kenarına yerleştirin.
  2. Transfer protokolü adım 8.2, aşağıda açıklandığı gibi ayrı ayrı solucanlar " hayatta kalma yöntemi, " bir solucan kullanarak seçin. Alev solucan Tel al kırmızı olana. Alev çıkarın ve birkaç saniye için soğumasını bekleyin.
  3. Tel çekme üzerinde kullanarak yavaşça tel çekme üzerinde kapsayan yeni plaka üzerinde yetiştirilen OP50 kültür çim kazımak.
  4. Tel ucu kapsayan viskoz kültür sopa çekmeyi ucuna, böylece nazikçe bir sürükleme hareketi kullanarak seçili solucanlar kadar aç kurt yapar.
    5. Bir kez seçilen solucanlar toplandık,
  5. koyun onları yeni bir tabağa nazikçe kültür agar swiping tarafından. Tel çekme üzerinde kalan kültür kaldırmak için alevin içine yerleştirin.

6. Yumurta hazırlık

  1. toplama ya da 5, protokolü adımda anlatıldığı gibi parçalama tarafından yaklaşık 20 Yetişkin Hayvanlar (yaklaşık 2-3 gün sonra 20 ° C'de yetiştirilen damızlık) yer " Chunking ve solucanlar, malzeme çekme " ile 50 numaralı seribaşı bir plaka üzerine E. coli baskı, OP50 µL.
  2. Yumurta toplamak için sel M9 arabellek 10 mL ile plaka 1-2 gün sonra. Bir cam serolojik pipet kullanarak, girdap ve yavaşça yumurta şaşırıp kalmış OP50 ya da Yetişkin Hayvanlar serbest bırakmak için agar plaka üzerinde içeriği tahrik. Yumurta ve yetişkin içeren sıvı toplamak.
  3. 15 mL konik M9 transfer ve OP50 çözümde tüp. Santrifüj kapasitesi 2100 x g 2 dakika süreyle de 15 mL konik tüp
  4. Yaklaşık 9 mL süpernatant OP50 Pelet bozmadan Aspire edin.
  5. 2 mL steril su, çamaşır suyu 1 mL ve 1 mL 0.25 M NaOH Pelet resuspend.
    6. Yetişkin Hayvanlar (yaklaşık yüzde 70) çoğunluğu lysed görününceye kadar
  6. karışımı yavaşça tarafından inversiyon; genellikle, yumurta bu kısa çamaşır suyu tedavi sırasında kendi kabuk nedeniyle korunacak. Konik tüp, 990 x g 2 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
  7. Pelet bozmadan aspiratı süpernatant. Pelet 10 mL M9 arabellek yeniden askıya alma.
  8. 990 x g 2 dk. aspiratı süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet için konik tüp santrifüj kapasitesi. M9 arabelleği 200 µL ile yeniden askıya Pelet.
    Not: Birden fazla denemeler yumurta hazırlık gerektirebilir. Onlar uzun süre bleach maruz kalır Eğer yumurta yok olabilir. Yumurtadan değil, çamaşır suyu çözüm konsantrasyonu azaltmak veya çamaşır suyu pozlama süresi azaltmak.

7. Enfeksiyon plaka koymak-yukarıya

  1. YPD 3-5 mL steril tüp içine dağıtmak ve bir kısır döngü kullanarak Candida albicans bir koloni ile aşılamak.
    1. Yaklaşık 16-18 h 30 için çevirme davul tüpü yerleştirin ° C.
  2. C. albicans ve başka OP50 içerecek şekilde içerecek şekilde etiket bir 1.5 mL microfuge tüp. Her boş tüpün ağırlığı kaydetmek.
    1. Yer 500 µL gecede C. albicans kültür tüp içine etiketli C. albicans ve gecede OP50 kültür (Kimden adım 3.1) 1.500 µL OP50 etiketli tüpüne.
    2. , 16,100 g. aspiratı süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet x 10 dk santrifüj.
    3. Her Pelet 500 µL steril su ile yeniden askıya alma. Santrifüj 16,100 x g., 5 min için
    4. Pelet bozmadan aspiratı süpernatant. Microfuge tüpler son ağırlığı kaydetmek.
    5. Microfuge tüpler son ağırlık üzerinden ilk ağırlığını çıkararak her Pelet ağırlığını belirlemek.
  3. Steril su kullanarak yeniden askıya C. albicans Pelet 10 mg/ml ve 200 mg/ml OP50 Pelet. Streptomisin, 50 mg/mL solüsyon 10 µL, OP50 kültürünün 2.5 µL, 0.5 µL C. albicans kültür ve steril su 7 µL birleştirerek karışımı bir ana enfeksiyon olun.
    1. C. albicans kültür hacmi steril su ile değiştirerek kontrol levha için ana bir karışım oluşturmak. Enfeksiyon karışımı veya OP50 kontrol çözümü bir micropipette kullanarak Merkezi NGM plakalar üzerine 20 µL tohum.
      Not: Yaklaşık 100 solucanlar istatistiksel anlamlılık Çözümleme sırasında belirlemek için gereklidir. Bu tahlil genellikle nüsha çalıştırılır. Böylece, 3.2 x enfeksiyon mix yanı sıra 3.2 x kontrol çözümü yapılır. Bu karışımları biraz üzerinde 3 x tam 20 µL üzerine hata izin her plaka numaralı seribaşı sağlamak için orijinal olmak için yapılır. Yutak solucanın ilk larva evrelerinde (L1-L3) C. albicans tüketmek için çok küçük olduğundan bu ana karışımı oluşturulur. Flukonazol kullanımı ( şekil 3B) gibi farmakolojik ajanlara maruz kalma için enfeksiyon karışıma aracı kullanılmaya başlandı. Aracı konsantrasyonu ampirik olarak belirlenir. Örneğin, içinde şekil 3B, 50 µM Flukonazol temsil edilmektedir, ancak 0, 12.5, 25, 50 ve 100 µM Flukonazol vardı da aynı iletişim kuralını kullanarak test.

8. Anal bölge (Dar) deforme fenotip ve hayatta kalma tahlil analiz

  1. Visualize Dar fenotip
    Not: Dar L3 aşamada ve ötesinde en iyi görüntülenir. Dar olan zaman içinde daha belirgin hale gelir solucanın ( şekil 2A), küçük bir çıkıntı sonrası anal bölgede olarak gözlenmektedir.
    1. Bir hayvan olup olmadığını hızlı bir şekilde plaka diseksiyon mikroskop sahneye dokunarak Dar; Dar hayvanlarla-ecek da lüzum hemen geriye doğru hareket hayvan Dar olmadan Onayla kendi yönünü ya da tersine çevirmek için dokunarak tur tekrarlanan Bunu hiç yapmak.
  2. Hayatta kalma tahlil
    1. daha önce protokol adım 6, açıklandığı gibi tam yumurta hazırlık " yumurta hazırlık ". Diseksiyon kapsamı altında yumurta sayısı ve yaklaşık 5-6 sağlıklı yumurta µL başına bir konsantrasyon elde kadar M9 yumurta Çözümle sulandırmak. Bir pipet kullanarak dağıtmak arasında yaşayan bakteri kültürü ve plaka tarafında hazırlanan NGM plaka üzerine yaklaşık 30 yumurta içeren 20 µL örnek (yumurta ve solucan yemek, OP50, iki farklı noktalar vardır).
    2. İçin 48 h 20 ° C'de Incubate tabaklar. Diseksiyon mikroskop altında canlı ve ölü yetişkin solucanlar her plaka üzerinde sayısı, hem de Dar Kurtlarla sayısını saymak. Dar ile yüzde rekor.
    3. Kafasına bir Alüminyum tel veya dokunarak plaka için dinleniyor vermezse bir hayvan ölü düşünün.
    4. Her gün, aktarım kalan yetişkin solucanlar tarafından malzeme çekme 5, protokolü adımda anlatıldığı gibi " Chunking ve solucanlar, malzeme çekme " yeni bir enfeksiyon veya kontrol levha üzerine. Bu noktada, canlı, ölü ve kayıp solucanlar sayısı her gün takip ederek bir hayatta kalma tahlil gerekirse, gerçekleştirmek.
      Not: Bu tahlil yumurta hazırlık ile başlayan iki hafta boyunca çalıştırabilirsiniz. Çözüm OP50 öldürebilir çamaşır suyu izleri içerebilir gibi Ayrıca, yumurta çözüm bakteri kültürü reçete değil. Çözüm Ayrıca olmalıdır yumurta plaka ve agar kenarlarına arasında kalmış olur gibi yaklaşık 0.5 cm tabak kenarına uzakta reçete. Buna ek olarak, solucanlar hızlı yayılması nedeniyle, Yetişkin yeni plakalar üzerine aktarma onları--dan onların döl ayırmak için çok önemlidir.
  3. Analiz hayatta kalma
    1. sağkalım eğrisi analiz yazılımı kullanarak sonuçları analiz (malzeme listesi için bakınız).
      2. Grehan-Breslow-Wilcoxon yöntemini kullanarak
    2. Karşılaştır hayatta kalma eğrileri (veri buna göre erken hayatta kalma kez verilerden ilerleyen zamanlarda daha doğru olduğu varsayımıyla, ağırlığı) yanı sıra Logrank istatistiksel araçlar 45.
      Not: Örneğin, içinde şekil 4B -C, mutant C. albicans ile tedavi solucanlar yaşama isogenic vahşi tipi denetimleri veya complementarystrains ile tedavi karşılaştırılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. albicans ve C. elegans kullanarak bir Patogenez tahlil (şekil 1) daha önce bizim laboratuvar17,18 ve diğer labs19,20tarafından tarif edilmiştir. C. albicans hücreleri hızlı bir şekilde solucanlar tarafından yutulur ve yavaş hareket, neden intestinal Lümen içinde birikir gösterilen C. albicans virülans çalışmaya C. elegans kullanarak amenability göstermek anal deforme Bölge (Dar) (şekil 2A), vulva (şekil 2B) şişmesi, şişkinlik bağırsak (şekil 3A) ve lethality (3 şekil, şekil 4). Ayrıca fitness nicel bir ölçüsü olarak enfekte solucan ömrü ölçüyoruz. Örneğin, C. albicans ile enfekte C. elegans 10-12 gün 20-22 bulaşmamış denetimler için göre yaşamak. C. albicans çift knock mutant dışarı ile enfekte C. elegans içinde iki anahtar virülans faktörleri enfeksiyon Mouse için gerekli olan efg1/efg1 cph1/cph1, sıçan ve insan epitel modelleri21, 23, nematodlar hayatta önemli ölçüde denetimleri (şekil 3B) uzun. Bu deneyler C. albicans virülans hakkında basit bu modelde öğreniyoruz derslerin bazıları daha yüksek memelilerde ve tersi geçerli olmaya devam öneririz.

Biz de onlardır modeli sistem olabilir göstermek farmakolojik modüle (şekil 3B). Flukonazol varlığında, en sık reçete antifungal uyuşturucu C. albicans ile meydan solucanlar denetimleri önemli ölçüde daha uzun hayatta kaldı. Bu kanıtı prensibi deneyi nematodunun model küçük molekül tarama için kullanılabilir öneriyor. Gerçekten de, bizim C. elegans modeli filastatin, mantar virülans24çeşitli yönlerini inhibe bağlanabilecek küçük bir moleküldür belirlenmesinde etkili oldu.

Hastalık fenotipleri ve mikroskobik analizi C. elegans enfeksiyon
C. elegans C. albicans için bir altı gün boyunca maruz ve gözlenen Enfeksiyon belirtileri, hastalık ve ölüm için. Dar fenotip bulaşmamış hayvan (şekil 2A) görünür değil çıkıntılı bir anal bölge tarafından belirtildiği gibi hayatta kalma testin 4 gün en görünür. C. albicans tarafından enfekte solucanlar da sergilemek için bilinen (şekil 2B) vulva bölgesinde şişlik. Her iki durumda da, bu aşamada ulaştıktan sonra enfeksiyon temizleyemezsiniz solucandır. C. albicans ' nın intestinal Lümen içinde görselleştirmek için solucanlar RFP ile tagged yaban tipi C. albicans hangi alanlarda kırmızı (şekil 3A) bulabilsem kolonizasyon neden beslenen edildi. Bu görüntüler üretmek için solucanlar 0.01 M sodyum azid içeren bir % 2 özel yastık üzerinde anestezi. Solucanlar vahşi-türü C. albicans veya RFP öğesini C. albicansmaruz ve özel altlığında 5 µM M9 arabelleğe aktarılır. Özel yastık sonra bir coverslip ile kaplı idi. Solucanlar 200 X ve floresan mikroskopi yetenekleri ile ters bir mikroskop kullanarak 400 X büyütme görüldü. Görüntüleri fark girişim kontrast (Nomarski) ve epifluorescence optik altında oluşturuldu. Floresan görüntü yazılımı (şekil 3A) kullanarak gelişmiş. Zaman serisi Filmler virüslü Worms C. albicans intestinal Lümen tahlil17üçüncü gün tarafından kolonize belirledi. Virüs bulaşan solucanları bulaşmamış denetimindeki gözlenen daha daha şiddetli bağırsak distansiyonu gösterdi.

Enfeksiyon çalışmaya genetik ve farmakolojik Araçlar
Daha sonra genetik ve farmakolojik modülasyonu kullanarak modeli test ettik. Biz de hyphal geçiş C. albicans25 düzenleyen ve fareler ve nematodlar20,26 in vivo enfeksiyonlarının tedavisinde önemli olduğu gösterilmiştir önceden belgelenen virülans faktörleri test . Enfeksiyon C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 Çift Kişilik mutant. neden hayatta kalmak için solucanlar yeteneklerini test ettik Efg1 son derece korunmuş transkripsiyon faktörü siklik AMP/protein kinaz A (PKA) metabolik yolu bir temel bileşenlerinden biridir. C. albicans içinde bu yolu hyphal morfogenetik27,28ve anahtar virülans faktörleri bir cephanelik geçiş beyaz opak düzenlemektedir. Hwp1 ve Hwp2, iki Maya özel hücre duvarı protein yapışma ve biyofilm oluşumu, Eap1, hücre duvarı adhesin bağlama insan epitel hücreleri29, yer ve Sap5, hydrolytic enzim katılan katılan bu virülans faktörleri içerir epitel doku istila30. Cph1 çiftleşme, filamentation ve biyofilm oluşumu da dahil olmak üzere birçok metabolik süreçleri düzenler ve zararlı epitel hücreleri31 ve insan yeniden oluşturulan epitel21 kritik bir rol oynamak için gösterilen bir transkripsiyon faktörü olduğunu . Ya bu genlerin bozulması dramatik virülans azaltma fareler25, Drosophila dahil olmak üzere çeşitli hayvan modellerinde virülans ve cph1/cph1efg1/efg1 sonuçlarında her ikisi de aynı anda bozulma üzerinde önemli bir etkisi vardır 32, Zebra balığı33,34 ve güve34. Cph1/cph1efg1/efg1 Çift Kişilik mutant C. albicans topluluğu tarafından olmayan yük tanımlama ve doğrulama roman model sistemleri için altın standart olarak kabul edilir. Azalan Dar gösterdi mutantlar tek efg1Δ ve cph1Δ (~ %10 ve % ~ 50, sırasıyla) efg1Δ cph1Δ Çift Kişilik mutant Dar Yanıt17temin başarısız iken soydaş vahşi türü ile karşılaştırıldığında. Bu sonuçlar desen özetlemek virülans nerede cph1∆ mutant biraz zayıflatılmış, farelerde, sı efg1∆ mutant olduğunugnificantly zayıflatılmış ve tamamen olmayan25Kişilik mutant olduğunu. Solucan bulaşmış ile cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans Çift Kişilik mutant yaşamış denetimleri daha istatistiksel olarak önemli ölçüde uzun (p < 0,01 için günlük sırası ve Breslow istatistiksel test, n = 60) bu iki gen C. için gerekli olduğunu düşündüren albicans virülans C. elegans (şekil 3B) karşı.

C. elegans modelimiz potansiyel uyuşturucu tarama için kullanma imkanı keşfetmek için Flukonazol ilavesi etkisi enfeksiyon, nihai sonucunu test ettik. Flukonazol farklı konsantrasyonlarda çeşitli kullanılan ve bulduğu 50 µM bize en önemli sonuçlar verdi. C. albicans ve 50 µM Flukonazol (3B rakam) ile enfekte solucanlar yaşamış denetimleri daha istatistiksel olarak önemli ölçüde uzun (p < 0.01'de günlük sırası ve Breslow istatistiksel test, n = 60). Bu konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmiştir ("enfeksiyon plaka kurmak" Protokolü adım 7, sonundaki nota bakın). İlke deneyler bu kanıtı nematodunun modelimiz küçük molekül antifungal tarama için kullanılabileceğini gösterdi. Model aslında filastatin, şu anda daha fazla preklinik çalışmalar24geçiyor mantar virülans çeşitli yönlerini inhibe bağlanabilecek küçük bir moleküldür keşfi vesile oldu. Buna göre bizim tahlil C. albicans ve farmakolojik virülans stratejileri keşfetmek için uygundur.

Doğuştan gelen ana bilgisayar yanıt incelenmesi
Daha sonra bu doğuştan gelen bağışıklık yönlerini memeliler11,35korunmuş beri patojenler karşı karşılıklı konak savunma okumak istedim. İyi C. elegans her iki bakteriyel ve mantar enfeksiyonları18,36,37 onun savunma mekanizmasının bir parçası ROS üretir bilinmektedir. ROS organizmalar istila üzerinde biocidal bir etkiye sahip ve doğuştan gelen bağışıklık önemli bir rol oynamaktadır. zcf15/zcf15 hiper duyarlılık ROS vitro C. elegans azaltılmış onun virülans ana bilgisayarın ROS oluşturulan bir azalma yeteneği nedeniyle dayanacak şekilde yapıldı hipotez için bize yol. Bizim hipotezi test etmek vahşi tipi solucan veya solucanlar ROS üretmek bir görme yeteneği ile öldürmek için zcf15/zcf15 yeteneği belirledi. Temsilcisi gösterdi Reaktif oksijen türleri için (şekil 4A) duyarlıdır C. albicans mutant zcf15 vahşi-türü C. elegansvirülans azaltılmış. C. elegans patojen sindirim yolu ile Ce-Duox1, gen bli-3tarafından kodlanmış bir NADPH oksidaz intestinal Lümen içinde ekstraselüler ROS üreterek yanıt verir. ROS üretim sırasında bağırsak hücreleri de kendi dokuları ROS zararlı etkileri36,38korumak için DAF-16 üzerinden intrasellüler antioksidan üretmek. CE-Duox1 N-terminal peroksidaz etki alanı, C-terminal süperoksit üreten NADPH-oksidaz etki alanı ve iki Merkez calmodulin bağlayıcı siteleri39ile bir proteindir. Mikrobiyal enfeksiyon bu proteinin sitozolik NADPH ekstraselüler toksik ROS enfeksiyonu önlemek için intestinal Lümen içinde oluşturmak için kullanılır. 2009 çalışmada biyokimyasal testleri bir dizi boyunca, Jain ve ark. ROS bol mantar enfeksiyonu üretilir ve fonksiyon bli-3(e767) üzerinden bu bli-3 kaybı önemli ölçüde ROS üretmek için nematodlar yeteneğini azaltır gösterdi. Şekil 4B' de gösterildiği gibi zcf15/zcf15 ile meydan solucanlar vahşi türü veya çıkarılan suşları önemli ölçüde daha uzun hayatta (p < 0,01 günlük-rank testi tarafından) ZCF15 virülans için gerekli olduğunu gösterir. Ancak, ne zaman biz meydan okudu ROS-eksik C. elegansbli-3(e767), zcf15/zcf15, vahşi türü ve çıkarılan zorlanma (şekil 4 c) arasında karşılaştırılabilir cinayetleri Kinetik elde. Bu kanıt o zcf15/zcf15 gösterir ROS üretmek için ana bilgisayarın yeteneğini tehlikeye sürece nematodlar öldürmek için başarısız. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar ZCF15 tam virülans için gereklidir ve bu gen büyük olasılıkla ana bilgisayar direnmeye patojen'ın yeteneği dahil ROS oluşturulan öneririz. Bizim bilgi en iyi şekilde bu ZCF15 patojenitesi ve ROS direnç dahil olmak gösterilen ilk seferim.

Figure 1
Resim 1: C. elegans enfeksiyon şematik gösterimi. C. elegans e.coli suşu OP50 ve bir patojen bir karışıma maruz ve erişkin Enfeksiyon belirtileri ve hastalığın ilerleme için ulaştıktan sonra 4 günlük bir dönemde gözlenen.

Figure 2
Şekil 2: hastalık fenotipleri. (A)Deformed anal bölge (Dar) görünür (okla gösterilen) enfekte Worms (doğru kapı aynası) sonrası anal bölgede bir şişlik olarak pozlama dört gün sonrası. Sol panelde solucanları bulaşmamış ve bir denetim olarak hizmet vermektedir. (B) A alt küme küme küme (% ~ 15) vulva (sağ paneli, bir ok ile gösterilen) şişmesi virüslü solucanlar gösterinin Dissemine enfeksiyon matricidal ölümle sonuçlanan temsil eden hastalık bulaşmamış tek denetim solucanlar (sol panelde) göre. Tüm görüntüleri temsilcisi sonuçları18' açıklandığı gibi alındı.

Figure 3
Şekil 3: C. albicans - C. elegans model mikroskobik manipülasyon mükellef ve farmakolojik ve genetik olarak modüle. (A) C. albicans nematodunun intestinal Lümen 3 gün sonrası enfeksiyon RFP birikimi ile etiketlendi. Maya hücreleri hızlı bir şekilde solucanlar tarafından yutulur ve intestinal Lümen tamamen bozulmamış, onlar mekanik yutak kırma hayatta gösteren birikir. Görüntüleri temsilcisi sonuçları18' açıklandığı gibi alındı. (B) meydan vahşi-türü C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 Çift Kişilik mutant veya vahşi-türü C. albicans + virüs bulaşmamış denetim solucanlar için karşılaştırıldığında Flukonazol, 50 µM ile nematodlar Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri.

Figure 4
Şekil 4. ZCF15 için gerekli C. elegans dayanıklı üretilen ROS. (A) ZCF15 vahşi tipi direnç Reaktif oksijen türleri oluşturmak için bilinen bozması için sorumludur. Vahşi türü, nakavt veya çıkarılan suşları yetişkin sıvı kültüründe gecede ve OD resuspended = 1. Kültürler her seyreltilmiş 1:5 ve YPD veya YPD içeren 1 mM bozması kaplama. C. elegans , intestinal Lümen38istila patojenler ile mücadele için via bli-3 ROS üretmek. (B) Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri göstermek ZCF15 silme vahşi tipi solucanlar öldürülmesi sınırlar. (C) Kaplan-Meier sağkalım eğrisi gösterir hayatta kalma zcf15/zcf15, vahşi türü ve çıkarılan zorlanma arasındaki benzer oranları ne zaman ROS-eksik C. elegansbli-3(e767) bulaştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz anlatmıştık C. albicans maruz ömür boyu üzerinde C. elegans enfeksiyon ve hayatta kalma raporlaması için yöntemler başka bir patojen sınamak için değiştirilebilir. Başka bir bakteri veya mantar sıvı kültürleri yapılmış ve C. elegans için benzer bir şekilde beslenir. Ayrıca, seri enfeksiyonlar denetlesinler ilk larva bir patojen için açıklandığı gibi göstererek ve sonra hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra ayrı bir patojen içeren yeni bir plaka üzerine transfer tarafından.

Bu tahlil yürütürken, zamanlama dikkatli dikkat önemlidir. İlk olarak, yumurta tahlil için hasat için yumurta hazırlık tamamlarken, yumurta çamaşır suyu açık olduğu süreyi sınırlamak için önemlidir. Yumurta serbest bırakmak için çamaşır suyu çözüm yetişkinlerde dağıtılması için gereken zaman miktarı değişir. Hemen çamaşır suyu çözüm yönetme sonra solucan çözüm yakından diseksiyon mikroskop altında izledim gerekir. Solucanlar yaklaşık % 70'i dağıldı sonra o zaman çözüm centrifuged. Yumurta hazırlık uygun yumurta verim, çamaşır suyu konsantrasyon veya çamaşır suyu pozlama süresi azaltmak. Bu tahlil tamamlanmasında, Ayrıca dikkat transfer yetişkin solucanlar için yeni plakalar çalışma konuları ile onların döl kafa karıştırıcı önlemek için gerektiği kadar verilmiş olması çok önemli. 25-30 yumurta için testin başında kaplama yumurta sayısını sınırlama bu de engelleyecektir. Son olarak, sık sık yeni plakalar üzerine yetişkin solucanlar aktarma da petri kabına kenarlarına kadar tarama ve ölüm solucan olasılığını azaltır.

Caenorhabditis elegans mikroplar veya bir mikrop arasında patojen veya komensal ilişkiler eğitim için çok yönlü modeli ana bilgisayar ve ana bilgisayar kullanılan. Sistemimiz çalışma mikrobiyal veya ana bilgisayar-mikrop etkileşime ileriye ve geriye doğru genetik yaklaşımları kullanarak hücresel ve moleküler düzeyde aynı zamanda tedavi müdahale için yeni moleküller keşfetmek için bir araç olarak kullanılabilir. Bu sistem çok yönlülük virülans40için katkıda bulunan genler o mikrobiyal fitness41olarak, bağlantılı bu mikroplar17, ana bilgisayar yanıt aracılık tanımlamak için genetik bir ekran yaparak göstermiştir 18de yüksek üretilen iş uygulamaları için ilaç keşif24. modelini kullanarak, Koloniler, hayvanlar cryo-gelecekteki uygulamalar için korunmuş olabilir dikkate alınarak korumak için pahalı altyapı gereksinimi olmadığından bu lisans öğrencileri tarafından kullanılacak iyi bir modeldir. Son olarak, bu mükemmel bir "arabulucu" vitro çalışmalar ve fare modelleri için sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser gerçekleştirilen ve Worcester Polytechnic Enstitüsü tarafından desteklenen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).

Tags

Genetik sorunu 128 mikrobiyal etkileşim virülans faktörleri patojen doğuştan gelen savunma hayvan modeli Caenorhabditis elegans
Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü <em>Vivo içinde</em> manken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The… More

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter