作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染
Summary
この原稿を作製し、ひと免疫不全ウイルス 1 型感染に対して強力な接着剤や抗ウイルス活性を示す Griffithsin 変更ポリ (乳酸グリコール酸) 電極として繊維を特徴付けるプロシージャを記述します。生体外で。合成に使用するメソッド表面変更、共役, 結果として得られる形態の特徴し、繊維の表面改質から Griffithsin の脱離が記載されています。
Abstract
エレクトロスピニング繊維 (EFs) は、様々 な治療上のアプリケーションで広く使用されています。しかし、彼らが感染症 (性感染症) の予防と性的治療技術として適用ばかりされています。さらに、EF の多くの技術は、biofunctionality を付与する表面を基準にして、アクティブなエージェントをカプセル化に焦点を当てます。ここを作製し、表面 – poly(lactic-co-glycolic) 酸 (PLGA) エレクトロスピニング繊維、強力な抗ウイルス レクチン Griffithsin (GRFT) を変更する方法を記述します。PLGA は、その優れた化学と生体適合性の特性のための薬剤投与で広く使用されている FDA が承認したポリマーです。GRFT は、強力な自然とひと免疫不全ウイルス タイプ 1 (HIV-1) を含む多数のウィルスに対して広範な活動を所有している安全なレクチンです。組み合わせることで、繊維の GRFT 変更は体外の HIV-1 の強力な不活化を実証しています。この原稿は、製造するために、EFs の GRFT 変更を特徴付ける方法を説明します。まず、PLGA はエレクトロスピニング繊維足場を作成します。繊維は、その後表面改質 1 を使用して GRFT-エチル – 3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) と N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 化学。走査電子顕微鏡 (SEM) は、サイズと表面改質した製剤の形態を評価するために使用されました。また、gp120 やヘマグルチニン (HA)-ベース ELISA は、共役 GRFT として GRFT 脱繊維表面の量を定量化するされることがあります。このプロトコルは、異なった蛋白質の様々 な表面改質は、ファイバーを作製するより広く適用できます。
Introduction
局所配信プラットフォームとして EFs の使用には、性感染症を大幅に削減する可能性があります。現在、hiv 感染者の報告された 2015年だけ1,2の以上 200 万の新しい症例以上 3600 万の人々 があります。さらに、単純ヘルペス ウイルス 2 (HSV-2) 感染影響何百もの世界中の人々 の何百万人を入力し、2-5 倍3によって HIV の買収を強化するのに示されています。HSV-2 感染症および HIV 取得の関係、ため複数性感染症に対する保護を同時新規の活性剤の開発に重要な関心があります。さらに、これらの抗ウイルス剤の配信を改善するために新しい車の開発は、予防・治療の効力を強化する可能性を提供しています。この目標に向かって HIV 1 と hsv-2 感染症の有病率を削減する新しい配信プラットフォームとして EFs を調べた。
過去 20 年間、EFs は薬剤配達および組織エンジニア リングの4分野で広く使用されています。多くの場合、簡単に治療への応用に翻訳する生体適合性ポリマーが選択されます。高分子 EFs を作製するには、有機溶剤、水性溶液、高分子の疎水性5の程度に応じてに選択したポリマーを溶解しています。関心の活性剤、静電紡糸プロセスの前に溶剤または水のソリューションに追加されます。高分子溶液は、注射器に吸引、電気電流を受ける一方ゆっくりと放出されます。このプロセスは通常ポリマー繊維シートまたは円筒状の破面観察 (図 1)、繊維径マイクロ ・ ナノスケール6に至るとの結果します。最も治療用活性剤は紡糸プロセス中に繊維内に組み込まれているし、拡散とその後繊維分解を介して繊維から解放されます。ポリマーの種類を使用しての劣化や解放の率を変更ことがありますまたはポリマーのユニークな化学的および物理的特性7を授受し、事実上すべてのカプセル化を推進、望ましいリリース プロファイルを確立するブレンド化合物。など、EFs は小分子薬および生物学的製剤のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、成長因子6,8,9などの配信に有益な証明しています。
EFs は、STI 予防のフィールドに組み込む、または誘引可能な – の徐放性抗ウイルス剤10、11,12,13,14 を提供する最近使用されてしまった ,,1516,17,18,19。初期の研究のひとつで、pH 応答性繊維は HIV 111に対する保護のオンデマンド方式として (FRT)、女性の生殖器官内で環境の変化に対応した活性剤を解放するために開発されました。以来、他の研究は、ポリエチレンオキシド (PEO) とポリ-L-乳酸 (PLLA)、抗ウイルス、避妊剤、HIV 1 予防や避妊体外用の可変のリリースを評価するから成るポリマー ブレンドを検討しました。12. 追加の研究は、次を提供するために EFs の可能性を実証した: 低分子抗ウイルス剤14, 強力なリリースと柔軟な機械的性質20、3 D 配信アーキテクチャ21 を延長、精子侵入12と他配信技術13とをマージする機能の抑制。最後に、前作は、HIV-114や HSV-2 一般的な co-infective ウイルスに対する抗ウイルス剤の持続的な配達のための高分子繊維を評価しています。本研究ではポリマー繊維は、1 ヶ月のために構造を維持し、ウイルス エントリへの物理的な障壁を提供することによって抗ウイルス配信を補完する活動を提供しました。これらの結果から両方の物理的および化学的にウイルス感染を妨げるに EFs を使用できるということがわかった。
可変リリース プロパティする高分子 EFs が殺菌剤の配達のための魅力的な配信プラットフォーム、EFs は表面改質した足場7として機能する他のアプリケーションで開発されています。EFs は、しばしば細胞再生22を向上させ、組織工学23,24でのユーティリティを足場として細胞外のマトリックス (ECM) の形態を模倣するために使用されています。ポリ-ε-カプロラクトン (PCL) 等の高分子から成る繊維とポリ乳酸をされている成長因子および蛋白質の表面修飾エレクトロスピニング後増加の細胞接着と増殖の25を含む ECM のような性質を与える,26します。 特定の病原細菌27,28の成長を防ぐために抗菌表面改質した EFs が評価されたさらに。この汎用性と生物学的作用を誘導する能力のため EF 技術はさまざまな多機械論的機能を提供するフィールドを展開し続けます。そのユーティリティ アプリケーションの多様性にもかかわらずまだ、殺菌剤フィールド29で繊維の表面改質が最近検討されています。
予防し、感染症を治療する新しい配信技術の開発と並行して、生物学的治療薬が開発されています。殺菌剤の最も有望な候補者は、接着剤の抗レクチン、GRFT30があります。紅藻の種から派生した当初、GRFT は HIV、HSV-2、SARS の強力な阻害剤としての活性を示しているだけでなく、C 型肝炎ウイルス31,32,33,34,35,36します実際には、生物学に基づいた阻害剤の間で GRFT は最も強力な抗 HIV 活性安定性と腟から文化メディアの存在下で活性を維持しながら接触30、時にほとんどすぐに HIV 1 を不活性。最大 10 日間37微生物。最近では、0.1 %grft ゲルは、HSV-2 や HIV-1 の32の両方に対する保護の最初のラインのための有望な候補内の HSV-2 のチャレンジに対してマウスを保護するために示されていた,38. の HIV GRFT が物理的にエントリ38,39,40,41 を防ぐためにウイルスの封筒表面の gp120 またはターミナル マンノースの N 型糖鎖の残基をバインドすることによって感染を阻害する具体的には、 ,42。この阻害は、3 の ng/mL43に近づいて IC50s で非常に強力です。研究の HIV 感染を阻害する、に加えてウイルス32細胞-細胞拡散を抑制することによって、GRFT が HSV-2 の感染症から保護することが示されています。すべてのケースで GRFT を変性高抵抗性を発揮しながら、ウイルス粒子を接着剤に示されています。最後に、GRFT は、実現可能であり可能性が有益なこと EFs で共同管理するテノホビル (TFV) とその他の抗ウイルス剤の44の組み合わせで相乗的な活性を実証しています。GRFT の強力な特性では、優秀な生物学に基づく抗ウイルス候補で配信は、EF 技術と高められるかもしれない。
GRFT の接着および生来抗ウイルス プロパティは、この知識を利用して、高分子繊維足場設計されました、ウイルス エントリ抑制29の最初の層を提供するこれらのプロパティを統合します。腟粘液が主に mucoadhesive ムチン相互作用を介してウイルスの輸送を妨げる方法のインスピレーションを見つけること、私たちと仮定足場として EFs を使用し共有 GRFT の高密度と表面の変更表面共役 GRFT は消耗し、そのエントリ ポイント45,46,47でウイルスを不活性化します。ここで EFs は、タンパク質ベース、バイラルマーケティング接着剤不活性バリア プラットフォームを提供する固定足場として開発されました。我々 は GRFT の強力な抗ウイルス特性「トラップ」新しいウイルスを作成には、生体適合性、変更可能で、耐久性のあるポリマー プラットフォームと組み合わせるしよう
これらの目標を達成するために PLGA から成る繊維エレクトロスピニングと EDC NHS 化学だった GRFT EF 表面を後で変更するために使用します。PLGA はエレクトロスピニング48、生体適合性と費用対効果での広範な使用のためのモデル ポリマーとして提供しています。また、表面改質、EFs の大きな表面積を悪用、繊維ユーティリティ49を最大限にカプセル化と組み合わせることができます便利な代替手段を提供します。異なり、伝統的なカプセル化方法 GRFT の部分のみ利用可能です (とのみ一過性、FRT で提示)、表面改質処理の全体の期間中最大の生物活性を維持するために GRFT を有効に。さらに、伝統的なエレクトロスピニング法によるタンパク質など親水性化合物の取り込み低カプセル化効率とタンパク質活性50の損失可能性があります。したがって、GRFT、繊維表面改質した STI 感染に対する保護を強化する単独またはエレクトロスピニングとの組み合わせで使用できる有望な代替配信方法があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
それらの多孔質構造と大きな表面積のため EFs は医療、治療薬デリバリー車として、さまざまなアプリケーションを発見しました。一方、生物学的製剤と化学リガンドを細胞特異ターゲット52またはバイオセンシング53繊維表面に共役することができます、薬やその他のアクティブなエージェントを可変配信のため EFs 内組み込むことできます。ここで GRFT ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究を資金調達のための卓越性のためユダヤ人の遺産基金に感謝しております。ありがとう博士スチュアート ・ ウィリアムズ II 寛大エレクトロスピニング システムの使用法を提供します。我々 はまた、Griffithsin と私たちを提供するため博士ケネス ・ パーマーを感謝します。また、的場信幸と GRFT ELISA で私たちが仕事の訓練のための彼の実験室を感謝いたします。
Materials
| Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | 147541000 | |
| Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD 3mL Syringe Luer-lok tip | VWR | 309657 | |
| Parafilm (plastic film) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) | Sigma Aldrich | M3671 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | BP176 | |
| Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
| Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3355 | |
| Influenza Hemagglutinin (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-00 |
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