هذه المخطوطة يصف الإجراءات لاختلاق وتميز ألياف اليكتروسبون تعديل جريفيثسين بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) التي تبين نشاط لاصقة والأدوية المضادة للفيروسات القوية ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 في المختبر. الأساليب المستخدمة لتجميع، تعديل السطح، وتميز مورفولوجية الناتجة، الاقتران، ووصف الامتزاز جريفيثسين من تعديل سطح الألياف.
ألياف اليكتروسبون (EFs) وقد استخدمت على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية؛ ومع ذلك، أنها إلا في الآونة الأخيرة طبقت كما هي تقنية لمنع وعلاج الأمراض التي تنتقل (المنقولة). وعلاوة على ذلك، العديد من التكنولوجيات EF تركز على تغليف عامل نشط، بالنسبة للاستفادة من السطح لنقل بيوفونكتيوناليتي. هنا يصف لنا طريقة لاختلاق والسطح-تعديل poly(lactic-co-glycolic) الحمضية (بلجا) ألياف اليكتروسبون مع يكتين المضادة للفيروسات القوية جريفيثسين (جرفت). بلجا هو بوليمر وافقت إدارة الأغذية والعقاقير التي استخدمت على نطاق واسع في إيصال الأدوية بسبب خصائصه الكيميائية ومتوافق حيويا المعلقة. وهو جرفت الطبيعية، قوية، ويكتين الآمنة التي تمتلك نشاط واسع النطاق ضد فيروسات عديدة بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (فيروس نقص المناعة البشرية-1). عندما يتم دمجها، أثبتت ألياف معدلة جرفت المنظمة القوية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب اختﻻق وتميز تعديل جرفت EFs. أولاً، هو بلجا اليكتروسبون لإنشاء سقالة ألياف. الألياف تعديل للسطح في وقت لاحق مع جرفت استخدام 1-إيثيل-3-(3-ديميثيلامينوبروبيل) كاربودييميدي (EDC) والكيمياء N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS). واستخدمت المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) لتقييم حجم ومورفولوجيا سطح تعديل الصيغ. بالإضافة إلى ذلك، gp120 أو هيماغلوتينين (ها)-أليسا أساس يمكن أن تستخدم لتحديد مقدار جرفت مترافق ل، فضلا عن الامتزاز جرفت من سطح الألياف. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع اختﻻق الألياف التي يتم تعديل سطح مع مجموعة متنوعة من البروتينات المختلفة.
وقد استخدام EFs كمنصة تسليم الموضعية يمكن أن تقلل إلى حد كبير من العداوي المنقولة جنسياً. حاليا، هناك ما يزيد على 36 مليون شخص يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية، مع ما يزيد على 2 مليون من الحالات الجديدة المبلغ عنها في عام 2015 وحدها1،2. بالإضافة إلى ذلك، اكتب 2 (HSV-2) العدوى يؤثر على مئات الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم فيروس الحلأ البسيط وقد ثبت أن تعزيز الحصول على فيروس نقص المناعة البشرية من 2-5 إضعاف3. بسبب هذه العلاقة بين عدوى HSV-2 واكتساب فيروس نقص المناعة البشرية، هناك اهتمام كبير بتطوير عناصر فاعلة جديدة توفر الحماية الفورية ضد العداوي المنقولة جنسياً متعددة. وعلاوة على ذلك، يوفر تطوير مركبات جديدة تحسين أداء هذه العوامل المضادة للفيروسات يمكن أن تزيد من تعزيز القدرة الوقائية والعلاجية. نحو تحقيق هذا الهدف، تم تحري EFs كمنصة تسليم جديدة للحد من انتشار الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 و 2-هامبورغ.
وخلال العقدين الماضيين، استخدمت EFs على نطاق واسع في الحقول لإيصال الأدوية، و هندسة الأنسجة4. وغالباً ما يتم اختيار البوليمرات متوافق حيويا أن يترجم بسهولة إلى التطبيقات العلاجية. لاختلاق EFs البوليمرية، هو حل البوليمر المحدد في حلاً مائي أو المذيبات عضوية، تبعاً لدرجة البوليمر هيدروفوبيسيتي5. ثم تضاف عناصر فاعلة لمصلحة حل المذيبات أو مائي قبل عملية اليكتروسبينينج. ثم يستنشق في محقن الحل البوليمر وإخراجه ببطء بينما تخضع لتيار كهربائي. وينتج هذه العملية عادة الألياف البوليمرية مع ورقة أو أسطواني ماكروستروكتوريس (الشكل 1)، والألياف بأقطار تتراوح بين الصغير إلى نانو الحجم6. للتطبيقات العلاجية الأكثر، مدرجة ضمن الألياف أثناء عملية اليكتروسبينينج عناصر فاعلة وتم إصدارها من الألياف عن طريق نشر وتدهور الألياف اللاحقة. يمكن تغيير معدل التدهور أو الإصدار باستخدام أنواع مختلفة من البوليمرات أو البوليمر يمزج بإنشاء ملف تعريف إصدار المطلوب، إضفاء خصائص كيميائية وفيزيائية فريدة من نوعها7، وتشجيع تغليف تقريبا أي مجمع. على هذا النحو، وقد أثبتت EFs مفيداً لإيصال الأدوية جزيء صغير والعوامل البيولوجية، بما في ذلك البروتينات، الببتيدات، النوكليوتيد، وعوامل النمو6،،من89.
في مجال الوقاية من الأمراض المنقولة جنسياً، EFs مؤخرا استخدمت لدمج وتوفير استدامة-أو إيندوسيبلي-الإفراج عن العوامل المضادة للفيروسات10،11،،من1213،14 ،،من1516،17،،من1819. في واحدة من الدراسات أقرب، وضعت ألياف المراعية للأس الهيدروجيني بالإفراج عن عناصر فاعلة في الاستجابة للتغيرات البيئية داخل المسالك التناسلية الأنثى (معاهدة سجل الأفلام)، كأسلوب الطلب على الحماية ضد فيروس نقص المناعة البشرية-111. منذ ذلك الحين، حققت دراسات أخرى يمزج بوليمر يتألف من البولي إيثيلين أكسيد (بيو) وحامض بولي-L-اللبن (ذات)، لتقييم الإصدار الانضباطي للعوامل المضادة للفيروسات واستخدام وسائل منع الحمل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الوقاية ومنع الحمل في المختبر 12-دراسات إضافية قد أثبتت جدوى EFs تقديم ما يلي: الإفراج عن جزيء صغير مضادات الفيروسات14، قوية ومرنة الخصائص الميكانيكية20، تسليم ثلاثي الأبعاد أبنية21 لفترات طويلة ، تثبيط من الحيوانات المنوية اختراق12، والقدرة على دمج مع سائر التكنولوجيات تسليم13. وأخيراً، تقييم الأعمال السابقة الألياف البوليمرية لإيصال المستدام للعوامل المضادة للفيروسات مكافحة الفيروسات كوينفيكتيفي المشتركة، هامبورغ-2 وفيروس نقص المناعة البشرية-114. في هذه الدراسة، تقدم الألياف البوليمرية نشاط مكمل لتقديم الأدوية المضادة للفيروسات بالإبقاء على الهيكل لمدة تصل إلى شهر واحد، وتوفير حاجز مادي لدخول الفيروسية. من هذه النتائج، فقد لوحظ أنه يمكن استخدام EFs جسديا وكيميائيا يحول دون الإصابة بعدوى الفيروس.
بينما جعل خصائص الإصدار الانضباطي EFs البوليمرية منصة تسليم جذابة للتسليم للجراثيم، وضعت EFs في تطبيقات أخرى لتكون بمثابة تعديل للسطح السقالات7. وقد استخدمت eFs لمحاكاة مورفولوجية المصفوفة خارج الخلية (ECM)، غالباً بوصفها السقالات تحسين التجدد الخلوية22، وزيادة فائدتها في الأنسجة الهندسة23،24. الألياف تتكون من البوليمرات مثل بولي-اليورو–كابرولاكتوني (PCL) وذات تم تعديل السطح مع عوامل النمو والبروتينات بعد اليكتروسبينينج نقل خصائص مثل إدارة المحتوى في المؤسسة بما في ذلك زيادة التصاق وانتشار الهاتف الخلوي25 , 26-وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييمها EFs الميكروبات المعدلة السطح لمنع نمو البكتيريا المسببة للأمراض المحددة27،28. نظراً لهذا التنوع والقدرة على حمل الآثار البيولوجية، EF والتكنولوجيا لا يزال لتوسيع عبر مجموعة متنوعة من المجالات لتوفير وظائف ميكانيكية متعددة. حتى الآن، على الرغم من فائدتها في مجموعة متنوعة تطبيقات، إلا في الآونة الأخيرة تم استكشاف تعديل سطح الألياف في حقل الجراثيم29.
وقد وضعت بالتوازي مع تطوير تكنولوجيات تسليم جديدة لمنع وعلاج الأمراض المنقولة جنسياً، رواية العلاجات البيولوجية. أحد المرشحين للجراثيم الأكثر تبشيرا بالنجاح هو يكتين المضادة للفيروسات لاصقة، جرفت30. مستمد أصلاً من نوع من أنواع الطحالب الحمراء، جرفت أثبت النشاط كمثبط قوي لفيروس نقص المناعة البشرية، هامبورغ-2، والسارس، والتهاب الكبد الوبائي فيروس31،32،،من3334، 35 , 36-وفي الواقع، بين مثبطات المستندة إلى بيولوجيا، جرفت قد أقوى النشاط المضادة فيروس نقص المناعة البشرية، ويخمد فيروس نقص المناعة البشرية-1 على الفور تقريبا على اتصال30، مع الحفاظ على الاستقرار والنشاط حضور وسائل الإعلام ثقافة من المهبل الجراثيم لمدة تصل إلى 10 أيام37. في الآونة الأخيرة، أبدى جل جرفت 0.1% لحماية الفئران ضد مهبلي HSV-2 التحدي، مما يجعل من مرشح واعدة للسطر الأول من الحماية ضد كل من هامبورغ-2 وفيروس نقص المناعة البشرية-132, 38-“لفيروس نقص المناعة البشرية” على وجه التحديد، جرفت يمنع الإصابة جسديا ملزمة gp120 أو المحطة الطرفية من بقايا جليكان ن ربط يطلق على الأسطح الفيروسية المغلف لمنع دخول38،،من3940،41 ،42. هذا التثبيط قوية للغاية، مع s50IC تقترب من 3 نانوغرام/مليلتر43. بالإضافة إلى منع الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، بينت الدراسات أيضا أن يحمي جرفت HSV-2 العدوى عن طريق منع انتشار الفيروسات32خلية بخلية. وفي جميع الحالات، أظهرت جرفت لتكون مادة لاصقة للجسيمات الفيروسية، مع إظهار مقاومة عالية تمسخ. آخر، قد أثبتت جرفت نشاط تعاوني مع مزيج من التنفوفير (تفف) و مضادات الفيروسات الأخرى44، مما يجعل من الممكن والمحتمل مفيدة لإدارة التعاون مع EFs. خصائص قوية جرفت جعله بيولوجيا على الأدوية المضادة للفيروسات مرشح ممتاز، الذي قد تحسين الأداء مع التكنولوجيا EF.
الاستفادة من هذه المعرفة بخصائص مضادة للفيروسات لاصقة والفطرية جرفت، سقالة ألياف البوليمرية صمم، يجمع بين هذه الخصائص توفر الطبقة الأولى من دخول الفيروس تثبيط29. العثور على الإلهام في الطريق أن المخاط سيرفيكوفاجينال يعوق نقل الفيروس أساسا عن طريق التفاعلات الميوسين موكواديسيفي، افترضنا أن عن طريق استخدام EFs سقالة وتساهمي تعديل السطح مع جرفت، بكثافة عالية أن إضعاف جرفت سطح مترافق وإلغاء تنشيط الفيروس في46،،من45نقطة الإدخال في47. هنا وضعت سقالة ثابتة لتوفير أساس البروتين، والفيروسية، يخمد لاصقة حاجز منصة EFs. وسعينا إلى الجمع بين خصائص مضادة للفيروسات قوية جرفت مع منصة بوليمر متوافق حيويا وقابلة للتعديل، ودائم، لخلق فيروس رواية “فخ”.
لتحقيق هذه الأهداف، كانت تتألف من بلجا ألياف اليكتروسبون، واستخدمت الكيمياء تنمية الصادرات–دائرة الصحة الوطنية في وقت لاحق تعديل السطح EF مع جرفت. بمثابة بلجا بوليمر نموذجي سبب استعماله واسعة النطاق في اليكتروسبينينج48، جنبا إلى جنب مع توافق مع الحياة والفعالية من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، تعديل السطح يستغل مساحة كبيرة من EFs، وتوفر بديلاً مفيداً يمكن دمجها مع تغليف لتعظيم فائدة الألياف49. خلافا لأساليب التغليف التقليدية حيث جزء فقط من جرفت متوفر (ويقدم فقط عابر في معاهدة سجل الأفلام)، يمكن تعديل السطح جرفت الإبقاء على الحد الأقصى بيواكتيفيتي طوال مدة العلاج. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي إدراج مركبات ماء مثل البروتينات، بالطرق التقليدية اليكتروسبينينج، أقل تغليف الكفاءة وفقدان البروتين نشاط50. ولذلك، جرفت تعديل سطح الألياف قد توفر أسلوب تسليم بديلة واعدة التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة مع اليكتروسبينينج لتعزيز الحماية ضد الإصابة بالأمراض المنقولة جنسياً.
بسبب هياكلها المليئة بالثغرات والمساحات الكبيرة، وجدت EFs مجموعة متنوعة من التطبيقات في مجال الرعاية الصحية، ويتضمن أحد التي تخدم كوسائل إيصال العلاجية. المخدرات وعناصر فاعلة أخرى يمكن إدراجها ضمن EFs لإيصال الانضباطي، في حين يمكن أن يكون مترافق البيولوجي والكيميائي يغاندس على سطح الأليا?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون “صندوق التراث اليهودي” للتميز لتمويل هذه البحوث. ونحن نشكر الدكتور ستوارت وليامز الثاني لتوفير استعمال النظام اليكتروسبينينج بسخاء. كما نشكر الدكتور كينيث بالمر لتزويدنا جريفيثسين. بالإضافة إلى ذلك نحن نشكر الدكتور نوبويوكي ماتوبا ومختبرة لتدريب لنا في أليسا جرفت العمل.
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | 147541000 | |
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
BD 3mL Syringe Luer-lok tip | VWR | 309657 | |
Parafilm (plastic film) | Sigma Aldrich | P7793 | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) | Sigma Aldrich | M3671 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | |
Hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
2-Mercaptoethanol | Fisher | BP176 | |
Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3355 | |
Influenza Hemagglutinin (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) | Santa Cruz | 2056 | |
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-00 |