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Bioengineering

Herstellung und Charakterisierung von Griffithsin-modifizierte Faser Gerüste für die Prävention von sexuell übertragbare Infektionen

Published: October 31, 2017
doi:
10.3791/56492
, ,
1Department of Chemistry,University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine,University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville, 5Department of Bioengineering,University of Louisville

Summary

Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren zu fabrizieren und zu charakterisieren Griffithsin veränderten Poly (Milchsäure-co-Glykol Säure) Electrospun Fasern, die starke Klebe- und antivirale Aktivität gegen humane Immundefizienz-Virus Typ 1-Infektion nachweisen in Vitro. Methoden zur Synthese, Fläche zu ändern, und die daraus resultierende Morphologie, Konjugation, prägen und Desorption des Griffithsin von oberflächenmodifizierten Fasern werden beschrieben.

Abstract

Electrospun Fasern (EFs) haben in einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen am meisten benutzt worden; jedoch wurden sie erst vor kurzem übernommen wie eine Technologie zur Vorbeugung und Behandlung von sexuell Infektionen (STI übertragenen). Darüber hinaus konzentrieren sich viele EF Technologien auf Kapselung des Wirkstoffs im Verhältnis zu der Nutzung der Oberfläche Biofunktionalität zu vermitteln. Hier beschreiben wir eine Methode um zu fabrizieren und poly(lactic-co-glycolic) Säure (PLGA) Electrospun Fasern, mit der potente antivirale Lektin Griffithsin (GRFT) Fläche zu ändern. PLGA ist ein FDA-zugelassene Polymer, das bei der Medikamentenabgabe aufgrund seiner herausragenden Eigenschaften von chemischen und biokompatiblen verbreitet. GRFT ist ein natürliches, potent, und sichere Lektine, die breite Wirkung gegen zahlreiche Viren einschließlich der humanen Immundefizienz-Virustyp 1 (HIV-1) besitzt. In Kombination haben GRFT veränderten Fasern potente Inaktivierung von HIV-1 in Vitronachgewiesen. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zu fabrizieren und zu charakterisieren EFs GRFT geändert. Erstens ist PLGA Electrospun ein Faser-Gerüst zu erstellen. Fasern sind anschließend oberflächenmodifizierten mit GRFT mit 1-Ethyl – 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Chemie. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde verwendet, um die Größe und Morphologie der oberflächenmodifizierten Formulierungen zu beurteilen. Darüber hinaus ein gp120 oder Hämagglutinin (HA)-basierte ELISA verwendet werden, um die Menge an GRFT konjugiert sowie GRFT Desorption von der Faseroberfläche zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann mehr weit angewendet werden, um Fasern herzustellen, die Oberfläche mit einer Vielzahl verschiedener Proteine modifiziert sind.

Introduction

Die Verwendung von EFs als eine topische Delivery-Plattform hat das Potenzial, sexuell übertragbaren Krankheiten deutlich zu reduzieren. Derzeit gibt es mehr als 36 Millionen Menschen mit HIV, mit mehr als 2 Millionen neue Fälle von berichtet in 2015 allein1,2. Darüber hinaus sind Herpes-Simplex-Virus Typ 2 (HSV-2) Infektion wirkt sich auf Hunderte von Millionen von Menschen weltweit und wurde gezeigt, dass die Übernahme von HIV zu verbessern um 2-5 fach3. Aufgrund dieser Beziehung zwischen HSV-2 Infektionen und HIV Erwerb gibt es erhebliches Interesse an der Entwicklung neuer Wirkstoffe, die gleichzeitigen Schutz gegen mehrere sexuell übertragbaren Krankheiten bieten. Darüber hinaus bietet die Entwicklung von neuen Fahrzeugen zur Verbesserung dieser antivirale Wirkstoffe weiter verbessern, schützende und therapeutische Potenz. Dieses Ziel zu erreichen wurden EFs als neue Lieferung Plattform zur Verringerung der Prävalenz von HIV-1 und HSV-2 Infektionen untersucht.

In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben EFs intensiv im Bereich der Drug-Delivery und Tissue engineering4genutzt. Oft werden biokompatible Polymeren ausgewählt, um leicht zu therapeutischen Anwendungen zu übersetzen. Um Polymere EFs zu fabrizieren, ist das ausgewählte Polymer in einer organischen Lösungsmittel oder wässrige Lösung, je nach dem Grad der Polymer Hydrophobie5gelöst. Wirkstoffe von Interesse sind dann die Lösungsmittel oder wässrige Lösung vor dem Elektrospinnen Prozess hinzugefügt. Die Polymerlösung ist dann in eine Spritze aspiriert und langsam ausgeworfen, während abhängig von elektrischem Strom. Dieser Prozess führt in der Regel Polymerfasern mit Blatt oder zylindrische Performance (Abbildung 1) und Faserdurchmesser von der Mikro-Nano-Maßstab-6. Für die meisten therapeutischen Anwendungen Wirkstoffe fließen innerhalb der Fasern während der Elektrospinnen Prozess und werden von der Faser über Diffusion und anschließende Faser Abbau freigegeben. Die Rate der Degradierung oder Entlassung kann geändert werden, durch die Verwendung unterschiedlicher Arten von Polymeren oder Polymer mischt, um eine gewünschte Version profilieren, Vermittlung von einzigartigen chemischen und physikalischen Eigenschaften7sowie die Förderung der Kapselung von praktisch jedem zusammengesetzte. Als solche haben EFs vorteilhaft für die Lieferung von kleinen Molekül-Drogen und biologischen Arbeitsstoffen einschließlich Proteine, Peptide, Oligonukleotide und Wachstumsfaktoren6,8,9bewährt.

Auf dem Gebiet der STI-Prävention haben EFs vor kurzem verwendet worden, zu integrieren oder induzierbaren-retard – antivirale Mittel10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In einer der frühesten Studien wurden pH-responsive Fasern entwickelt, um Wirkstoffe in Reaktion auf Veränderungen der Umwelt innerhalb der weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT), loslassen als eine Methode des Schutzes gegen HIV-1-11. Da haben andere Studien untersucht Polymerblends bestehend aus Polyethylen-Oxid (PEO) und Poly-L-Milchsäure (PLLA), die einstellbaren Version antivirale und empfängnisverhütende Mittel für HIV-1-Prävention und Verhütung in Vitro testen 12. weitere Studien haben gezeigt, die Machbarkeit der EFs, Folgendes anzugeben: verlängerte Freisetzung niedermolekularer Virostatika14, starke und flexible mechanische Eigenschaften20, 3-d-Lieferung Architekturen21 , Hemmung der Spermien eindringen12und die Fähigkeit, mit anderen Lieferung Technologien13zu verschmelzen. Zu guter Letzt hat Vorarbeiten Polymere Fasern für die nachhaltige Bereitstellung von antivirale Wirkstoffe gegen gemeinsame co-infective Viren, HSV-2 und HIV-1-14ausgewertet. In dieser Studie bereitgestellt Polymerfasern ergänzende Tätigkeit zu antiviralen Lieferung durch Beibehaltung ihrer Struktur für bis zu 1 Monat und eine physische Barriere, virale Eintrag. Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, dass EFs verwendet werden können, sowohl physisch als auch chemisch Virus-Infektion zu verhindern.

Während abstimmbaren Trenneigenschaften Polymeren EFs eine attraktive Plattform für Mikrobizide Lieferung machen, entwickelten EFs in anderen Anwendungen als oberflächenmodifizierten Gerüste7dienen. EFs wurden verwendet, um die Morphologie der extrazellulären Matrix (ECM), oft als Gerüste zur Zellregeneration22, verbessern und ihre Nützlichkeit in Tissue engineering23,24zu imitieren. Fasern bestehend aus Polymeren wie Poly-ε-Caprolacton (PCL) und PLLA wurden oberflächenmodifizierten mit Wachstumsfaktoren und Proteine nach Elektrospinnen ECM-ähnliche Eigenschaften, einschließlich erhöhte zelluläre Adhäsion und Verbreitung25 zu vermitteln , 26. Darüber hinaus antimikrobielle oberflächenmodifizierten EFs ausgewertet wurden, um zu verhindern das Wachstum von spezifischen pathogenen Bakterien27,28. Aufgrund dieser Vielseitigkeit und die Fähigkeit, biologische Wirkungen induzieren weiterhin EF-Technologie in den unterschiedlichsten Bereichen Multi-mechanistischen Funktionalität bereitstellen. Noch, haben trotz ihrer Dienstprogramm in einer Vielfalt von Anwendungen, oberflächenmodifizierten Fasern erst vor kurzem in der Mikrobizide Feld29erforscht.

Parallel mit der Entwicklung der neuen-Delivery-Technologien zur Vorbeugung und Behandlung von sexuell übertragbaren Krankheiten neuer biologischer Therapeutika entwickelt worden. Eines der vielversprechendsten Microbicide Kandidaten ist der Klebstoff antivirale Lektin, GRFT30. Ursprünglich abgeleitet von einer Spezies von Rotalgen, GRFT zeigte Aktivität als ein potenter Inhibitor von HSV-2, HIV, SARS, sowie Hepatitis C Virus31,32,33,34, 35 , 36. In der Tat unter biologisch-basierten Inhibitoren, GRFT hat die stärkste Anti-HIV-Aktivität, Inaktivierung HIV-1 fast sofort nach Kontakt30, unter Beibehaltung der Stabilität und Aktivität im Beisein von Kulturmedien von vaginalen Mikroben für bis zu 10 Tagen37. Vor kurzem wurde eine 0,1 % GRFT Gel gezeigt, Mäuse gegen intravaginale HSV-2-Challenge, so dass es einen viel versprechender Kandidat für die erste Verteidigungslinie gegen HSV-2 und HIV-1-32 zu schützen, 38. für HIV insbesondere GRFT hemmt Infektion durch physisch verbindliche gp120 oder Terminal Mannose N verbunden Glycan Rückstände auf Oberflächen der Virushülle Eintrag38,39,40,41 zu verhindern ,42. Diese Hemmung ist hochwirksames, mit IC50s 3 ng/mL43nähert. Neben der Hemmung der HIV-Infektion, haben Studien auch gezeigt, dass GRFT gegen HSV-2-Infektion schützt, durch die Hemmung der Zelle zu Zelle Ausbreitung des Virus32. In allen Fällen nachweislich GRFT Klebstoff auf virale Partikel werden und hohe Beständigkeit gegen Denaturierung demonstriert. Schließlich zeigte GRFT synergistische Tätigkeit mit einer Kombination von Tenofovir (TFV) und anderen antiviralen Medikamenten44, machen es möglich und wahrscheinlich vorteilhaft zusammen mit EFs zu verwalten. Die potenten Eigenschaften von GRFT machen es einen ausgezeichneten biologisch basierten antiviralen Kandidat, in dem Lieferung mit EF-Technologie verbessert werden kann.

Mit Hilfe dieses Wissens der Klebe- und angeborenen antiviralen Eigenschaften von GRFT, wurde leski Polymeren Faser entwickelt, die diese Eigenschaften bieten die erste Schicht des Virus Eintrag Hemmung29integriert. Finden Inspiration in der Weise, dass Cervicovaginal Schleim Virus Transport in erster Linie durch mucoadhäsiven Mucin Wechselwirkungen behindert, theoretisierte wir, daß durch die Verwendung von EFs als Gerüst und kovalent ändern die Oberfläche mit GRFT, eine hohe Dichte an GRFT Oberfläche konjugiert würde Schwächen und inaktivieren Virus bei ihrer Entrypoint45,46,47. Hier wurden EFs als stationäre Gerüst um eine Protein-basierten, virale Klebstoff-Inaktivierung Barriere Plattform entwickelt. Wir wollten die potenten antiviralen Eigenschaften der GRFT mit einer biokompatiblen, modifizierbar und langlebig Polymer Plattform, einen neuartigen Virus erstellen “Falle.” kombinieren

Um diese Ziele zu erreichen, wurden Fasern bestehend aus PLGA Electrospun und EDC-NHS Chemie wurde verwendet, um die EF-Fläche mit GRFT nachträglich zu ändern. PLGA diente als Modell Polymer aufgrund seines umfangreichen Einsatzes Elektrospinnen48, kombiniert mit seiner Biokompatibilität und Wirtschaftlichkeit. Darüber hinaus Oberflächenmodifizierung nutzt die große Fläche von EFs und bietet eine sinnvolle Alternative, die mit Kapselung, Faser-Dienstprogramm49zu maximieren kombiniert werden können. Im Gegensatz zu traditionellen Kapselung Methoden, wo nur ein Teil des GRFT ist verfügbar (und nur vorübergehend in der FRT), kann Oberflächenmodifizierung GRFT maximale Bioaktivität während der gesamten Dauer der Behandlung zu ermöglichen. Darüber hinaus kann die Aufnahme von hydrophilen Verbindungen wie Proteinen, durch traditionelle Elektrospinnen Methoden, untere Kapselung Effizienz und Verlust von Protein Aktivität50führen. GRFT oberflächenmodifizierten Fasern bieten daher eine viel versprechende alternative Übermittlungsmethode, die allein oder in Kombination mit Elektrospinnen verwendet werden können, um STI Infektionsschutz zu verbessern.

Protocol

1. Vorbereitung und Herstellung des Gerüstes Electrospun Fiber Vorsicht: alle Arbeiten mit Lösungsmitteln oder Polymerlösungen durchgeführt werden, in einem chemischen Abzug . Siehe Datenblatt Materialsicherheit jedes Reagenz vor Beginn des Protokolls. Electrospin eine 3 mL 15 % w/w PLGA Polymerlösung, Gewicht von 720 mg 50: 50 Poly (Milchsäure-co-glykolische Säure) (PLGA; 0,55 bis 0,75 dL/g, 31-57 kDa) in ein 10 mL-Fläschchen funkeln. Das Volumen der Lösung basie…

Representative Results

Faser-Morphologie hat erhebliche Auswirkungen auf die Fähigkeit der oberflächenmodifizierten EFs zum Schutz vor Viren. Obwohl Elektrospinnen eine bequeme und einfache Prozedur ist, können nicht optimierte Polymer Formulierungen in unregelmäßigen Faser Morphologie (Abbildung 5B-C) führen. Veränderungen im Elektrospinnen Bedingungen, die bei der Bildung von Perlen oder amorphen Mat-ähnlichen Morphologien, entstehen oft durch Lösungsmit…

Discussion

Aufgrund ihrer porösen Strukturen und große Flächen fanden EFs eine Vielzahl von Anwendungen im Gesundheitswesen, die eines davon dient als therapeutische Lieferfahrzeuge umfasst. Drogen und andere Wirkstoffe können eingebaut werden in EFs für durchstimmbare Lieferung während Biologics und chemische Liganden an der Faseroberfläche zellspezifische targeting52 oder Biosensoren53konjugiert werden können. Hier oberflächenmodifizierten die Herstellung von GRFT PLGA EFs,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar, die Jewish Heritage Fund for Excellence für die Finanzierung dieser Forschung. Wir danken Dr. Stuart Williams II für die großzügige Bereitstellung Nutzung des Systems Elektrospinnen. Wir danken Dr. Kenneth Palmer für uns Griffithsin zur Verfügung zu stellen. Wir danken außerdem Dr. Nobuyuki Matoba und seinem Labor für die Ausbildung, die uns im GRFT ELISA arbeiten.

Materials

Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
 Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00
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Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).
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