כתב יד זה מתאר את ההליך כדי להמציא לאפיין את סיבי electrospun פולי Griffithsin-לאחרונה (חומצה לקטית-co-גליקולית) הממחישים דבק חזק ופעילות אנטי נגד זיהום מסוג 1 וירוס הכשל החיסוני האנושי במבחנה. שיטות השתמשו כדי לסנתז, שינוי פני השטח, לאפיין את המורפולוגיה וכתוצאה מכך, נטיה, ואת desorption של Griffithsin מסיבי השטח-השתנה מתוארים.
Electrospun סיבים (EFs) היה בשימוש נרחב במגוון יישומים טיפוליים; עם זאת, הם רק לאחרונה הוחלו כמו טכנולוגיה כדי למנוע ולטפל מינית המועברות במגע מיני (STIs). יתר על כן, טכנולוגיות רבות EF מתמקדים לבצע את הסוכן הפעיל, יחסי ניצול השטח כדי להקנות את biofunctionality. כאן נתאר שיטת לפברק ושינוי פני השטח-poly(lactic-co-glycolic) חומצה (PLGA) electrospun סיבים, עם לקטין אנטי-ויראלי חזק Griffithsin (GRFT). PLGA הוא פולימריים שאושרו על-ידי ה-FDA כי כבר בשימוש נרחב במשלוח סמים בשל תכונותיו כימית, ביולוגית יוצאת מן הכלל. GRFT הוא טבעי, חזק, בטוח לקטין שמחזיק פעילות רחבה נגד וירוסים רבים כולל סוג וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1. בשילוב, סיבי GRFT-לאחרונה הראו איון חזק של HIV-1 במבחנה. כתב יד זה מתאר את השיטות כדי להמציא לאפיין GRFT-השתנה EFs. ראשית, PLGA הוא electrospun ליצירת לפיגום סיבים. סיבי הם משטח שונה לאחר מכן עם GRFT באמצעות 1-אתיל – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) וכימיה N-hydroxysuccinimide (NHS). סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) נעשה שימוש כדי להעריך את גודל ואת המורפולוגיה של השטח-השתנה ניסוחים. בנוסף, gp120, או hemagglutinin (HA)-אליסה מבוסס עשוי לשמש כדי לכמת את כמות GRFT מצומדת כדי, וכן GRFT desorption מפני השטח סיבים. פרוטוקול זה ניתן להחיל באופן נרחב יותר כדי לבדות בסיבים השטח-השתנה עם מגוון רחב של חלבונים שונים.
השימוש ב- EFs כפלטפורמה משלוח אקטואלי יש הפוטנציאל לצמצום משמעותי STIs. כיום ישנם מעל ל-36 מיליון אנשים החיים עם HIV, עם יותר מ-2 מיליון מקרים חדשים של שדווחו ב 2015 לבד1,2. בנוסף, נגיף הרפס סימפלקס סוג 2 משפיע זיהום (HSV-2) מאות מיליוני אנשים ברחבי העולם, הוכח כדי לשפר את רכישת HIV על ידי 2-5 קיפול3. עקב היחס בין זיהום HSV-2 ורכישה HIV, יש עניין משמעותי בפיתוח סוכנים פעילים חדשים המספקים הגנה בו זמנית נגד STIs מרובים. יתר על כן, הפיתוח של כלי רכב חדשים כדי לשפר את המסירה של סוכנים אנטי ויראליים מציע את היכולת לשפר עוד יותר את עצמת המגן וטיפוליים. לקראת מטרה זו, נחקרו EFs כפלטפורמה משלוח חדש כדי להפחית את שכיחות דלקות HIV-1 ו- HSV-2.
במהלך שני העשורים האחרונים, EFs היו בשימוש נרחב בתחומים של הנדסת רקמות4והספקת סמים. לעתים קרובות, פולימרים מסתיימים נבחרים לתרגם בקלות ליישומים טיפוליים. כדי לבדות EFs פולימריים, הפולימר שנבחר הוא מומס אורגני ממס או מימית פתרון, ובהתאם למידת פולימר hydrophobicity5. סוכנים פעילים עניין ואז יתווספו הפתרון ממס או מימית לפני תהליך electrospinning. הפתרון פולימר aspirated ואז לתוך מזרק, נפלט לאט בזמן נתון זרם חשמלי. תהליך זה גורמת סיבי פולימר בגיליון ‘ או ‘ גלילי macrostructures (איור 1), קטרים סיבים הנעים בין מיקרו – כדי בקנה מידה ננו6. ליישומים טיפוליים ביותר, סוכנים פעילים משולבים בתוך הסיבים במהלך תהליך electrospinning, משתחררים מן הסיבים באמצעות דיפוזיה והשפלה סיבים עוקבות. הקצב של השפלה או שחרור עשויה להשתנות באמצעות סוגים שונים של פולימרים או פולימר תערובות להקים פרופיל לשחרר הרצוי, להקניית מאפיינים כימיים ייחודיים7, וקידום של העטיפה של כמעט כל מתחם. ככזה, EFs הוכיחו מועיל לפתחו של מולקולה קטנה וסמים ביולוגיים כולל חלבונים, פפטידים, oligonucleotides של גורמי גדילה6,8,9.
בתחום של מניעת STI, EFs לאחרונה השתמשו כדי לשלב ולספק מתמשכת או inducible-שחרור של סוכנים אנטי ויראליים10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. באחד המחקרים המוקדמים, pH מגיבים סיבי פותחו כדי לשחרר סוכנים פעילים בתגובה לשינויים סביבתיים בתוך באיברי הרבייה הנקביים (והשפלתם), כמו שיטת לפי דרישה של הגנה נגד HIV-111. מאז, מחקרים אחרים יש חקר תערובות פולימר המורכב תחמוצת פוליאתילן (פאו) ו חומצה פולי-L-חומצת חלב (PLLA), כדי להעריך את המהדורה tunable של סוכנים אנטי-ויראלי ואנטי למניעת הריון עבור HIV-1 ומניעת אמצעי מניעה חוץ גופית בתוך 12. מחקרים נוספים הראו את הכדאיות של EFs כדי לספק את הנתונים הבאים: ממושך שחרורו של מולקולה קטנה antivirals14, חזקה וארכיטקטורות תכונות מכניות גמיש20, משלוח תלת-ממדי21 , עיכוב של זרע חדירה12, ואת היכולת למזג עם טכנולוגיות אחרות משלוח13. לבסוף, העבודות הקודמות יש הערכה סיבים פולימריים למסירה מתמשכת-של סוכנים אנטי נגד וירוסים co-infective נפוצים, HSV-2 ו- HIV-114. במחקר זה, סיבי פולימר מסופקים פעילות משלימה משלוח אנטי ויראליים על ידי שמירה על המבנה שלהם עד כחודש, מתן מכשול פיסי לערך ויראלי. מתוצאות אלה, זה היה ציין כי EFs עשוי לשמש הן מבחינה פיזית והן מבחינה כימית לעכב בנגיף.
בזמן שחרור tunable מאפיינים להפוך EFs פולימריים פלטפורמה מושכת משלוח למשלוח microbicide, EFs פותחו ביישומים אחרים כדי לשמש פיגומים השטח-לאחרונה7. EFs שימשו כדי לחקות את המורפולוגיה של מטריצות (ECM), לעיתים קרובות כסוכנות פיגומים כדי לשפר את התחדשות תאית22, ולשפר את השירות שלהם ב23,הנדסת רקמות,24. סיבים של פולימרים כגון פולי-חדוה-caprolactone (PCL) PLLA היה השטח-השתנה עם גורמי גדילה וחלבונים לאחר electrospinning להקנות תכונות כמו ECM כולל מוגברת הסלולר אדהזיה והתפשטות25 , 26. בנוסף, הוערכו מיקרוביאלית השטח-השתנה ב- EFs כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים פתוגניים מסוימים27,28. בשל רבגוניות זו ואת היכולת לגרום השפעות ביולוגיות, EF הטכנולוגיה ממשיכה להרחיב על פני מגוון רחב של שדות כדי לספק פונקציונליות מרובת מכניסטית. ובכל זאת, למרות השירות שלהם בתוך מגוון של יישומים, סיבי השטח-השתנה רק לאחרונה נחקרו על שדה microbicide29
במקביל עם התפתחות טכנולוגיות חדשות מסירה כדי למנוע ולטפל STIs, פותחו הריפוי ביולוגי. אחד מהמועמדים microbicide המבטיחים ביותר הוא דבק לקטין אנטי ויראליים, GRFT30. במקור נגזר מין אדומיות, GRFT הוכיח פעילות כמו מעכב חזק של HIV, HSV-2, הסארס, כמו גם הפטיטיס C וירוס31,32,33,34, 35 , 36. למעשה, בין מעכבי מבוסס מבחינה ביולוגית, GRFT יש את הפעילות נגד HIV הקטלניים ביותר, inactivating HIV-1 כמעט מיד על קשר30, תוך שמירה על יציבות ופעילות בנוכחות תרבות המדיה מן הנרתיק מיקרובים עבור עד 10 ימים37. לאחרונה, GRFT 0.1% ג’ל הוצגה להגן על עכברים נגד אתגר HSV-2 intravaginal, שהופך אותו מועמד מבטיח השורה הראשונה של הגנה מפני HSV-2 ו- HIV-132, 38. עבור HIV באופן ספציפי, GRFT מעכב זיהום על ידי איגוד פיזית gp120 או מסוף מנוז מקושרים-N glycan משקעים על מעטפת נגיפית משטחים למניעת כניסה38,39,40,41 ,42. עיכוב זה הוא חזק מאוד, עם s50IC מתקרב ng/mL 343. בנוסף מעכב הידבקות ב- HIV, מחקרים הראו גם כי GRFT מגן מפני זיהום HSV-2 על ידי עיכוב ההתפשטות לתא וירוס32. בכל המקרים, GRFT הוכח להיות דבק חלקיקים נגיפיים, תוך הפגנת עמידות גבוהה בפני דנטורציה. האחרון GRFT הוכיחה פעילות סינרגטיים עם שילובים של Tenofovir (TFV), אחרת עלולות44, שהופך אותו אפשרי וסביר מועיל לנהל יחד עם EFs. מאפייני GRFT חזק לעשות את זה מבוסס מבחינה ביולוגית נגיפים מועמד מצוין, שבו משלוח שעשויים להיות מוגברת עם טכנולוגיית EF.
ניצול הידע הזה של המאפיינים אנטי דבק ו מולדת של GRFT, לפיגום סיבים פולימריים תוכנן, המשלב מאפיינים אלה לספק את השכבה הראשונה של וירוס ערך עיכוב29. מוצאים השראה בדרך cervicovaginal ריר מעכבת וירוס תחבורה בעיקר באמצעות אינטראקציות mucin mucoadhesive, שיערנו כי באמצעות EFs בדומה לפיגום ו covalently שינוי פני השטח עם GRFT, צפיפות גבוהה של GRFT מצומדת השטח להחליש, בטל וירוס-46,45,שלה entrypoint47. כאן EFs פותחו בדומה לפיגום נייח לספק מבוססות חלבון נגיפי inactivating דבק מכשול פלטפורמה. חיפשנו לשלב את המאפיינים אנטי-ויראלי חזק של GRFT עם פלטפורמה פולימר מסתיימים, לשינוי ועמיד, כדי ליצור וירוס הרומן “מלכודת”.
כדי להשיג מטרות אלה, סיבי המורכב PLGA היו electrospun, כימיה EDC-NHS שימש לאחר מכן לשנות את פני השטח EF עם GRFT. PLGA שימש פולימר דגם בשל השימוש הנרחב שלה electrospinning48, בשילוב עם הביו וחסכון שלה. בנוסף, שינוי פני השטח מנצל את פני השטח גדולים של EFs, ומספק חלופה זה יכול להיות משולב עם עיטוף כדי למקסם את השירות הסיבים49. שלא כמו שיטות כימוס המסורתי שבו רק חלק GRFT זמין (ולהציג רק transiently והשפלתם), שינוי פני השטח עשוי לאפשר GRFT לשמור על אתריים המרבי במהלך משך הטיפול כולו. יתר על כן, שילוב של תרכובות הידרופילית כגון חלבונים, באמצעות שיטות מסורתיות electrospinning, עלול לגרום היעילות כימוס התחתון ואת אובדן חלבון פעילות50. לכן, GRFT שעבר שינוי משטח סיבי עשוי להציע שיטה למשלוח חלופית מבטיח כי ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם electrospinning כדי לשפר את ההגנה מפני זיהום STI.
בשל מבנה נקבובי שלהם ואת פני שטחים גדולים, מצאו EFs במגוון יישומים במערכת הבריאות, אחד מהם כולל הגשה כמו רכבי ההעברה טיפולית. סמים, סוכנים פעילים אחרים ניתן לשלב בתוך EFs למסירה tunable, ואילו תרופות/מוצרים ביולוגיים, כימיים ליגנדים יכול להיות מצומדת השטח סיבים עבור תאים ספציפיים מיקוד5…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים על הקרן למורשת למצוינות למימון מחקר זה. אנו מודים ד ר סטיוארט וויליאמס II למתן בנדיבות את השימוש של מערכת electrospinning. אנו מודים גם ד ר קנת פאלמר סיפק לנו Griffithsin. אנו מודים בנוסף ד ר נוביוקי Matoba ו במעבדתו לאימונים שאותנו אליסה GRFT לעבוד.
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | 147541000 | |
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
BD 3mL Syringe Luer-lok tip | VWR | 309657 | |
Parafilm (plastic film) | Sigma Aldrich | P7793 | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) | Sigma Aldrich | M3671 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | |
Hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
2-Mercaptoethanol | Fisher | BP176 | |
Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3355 | |
Influenza Hemagglutinin (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) | Santa Cruz | 2056 | |
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-00 |