Summary
了解细菌中基本过程的功能是很有挑战性的。荧光显微镜与靶向特定染料可以提供关键的洞察力的微生物细胞生长和细胞周期进展。在这里,农杆菌介导被用作一种模型细菌, 用来强调活细胞成像的方法, 用于描述基本过程。
Abstract
核心细胞过程, 如 DNA 复制和分离, 蛋白质合成, 细胞壁生物合成和细胞分裂依赖于蛋白质的功能, 这是必不可少的细菌生存。一系列的靶向染料可以作为探针, 以更好地理解这些过程。用亲油性染料染色可以观察膜结构、脂微的可视化以及膜泡的检测。使用荧光 d-氨基酸 (FDAAs) 来探测肽生物合成的地点, 可以显示细胞壁生物或细胞生长模式的潜在缺陷。最后, 核酸染色可以显示 DNA 复制或染色体分离可能存在的缺陷。青菁 DNA 染色标签活细胞和适用于定时显微镜, 使 real-time 观察的核形态学在细胞生长。细胞标记协议可应用于蛋白质耗竭突变体, 以识别膜结构、细胞壁生物或染色体分离的缺陷。此外, 延时显微镜可以用来监测形态学变化, 作为一个基本的蛋白质被删除, 并可以提供额外的洞察力的蛋白质功能。例如, 基本细胞分裂蛋白的耗尽导致丝或分支, 而细胞生长蛋白的耗竭可能导致细胞变得更短或更圆。在这里, 细胞生长的协议, 目标特定的标签, 和延时显微镜提供的细菌植物病原体农杆菌介导。同时, 目标特定的染料和延时显微镜能够在A.最后, 所提供的协议可以随时修改, 以探测其他细菌的基本过程。
Introduction
通过细菌细胞周期的进展需要协调许多过程, 包括细胞膜和细胞壁生物合成, DNA 复制和分离, 和细胞分裂。要充分了解细菌细胞生物学的复杂性, 就必须研究这些重要事件;然而, 这是一项不平凡的任务, 因为当这些通路的关键成分被 mutagenized 时, 细胞的生存能力就会受到影响。荧光显微镜结合靶向染料是一个强有力的方法, 以探索这些关键的过程中野生和突变菌株。
肽专用染料包括荧光抗生素 (万古霉素-fl, bocillin) 和荧光 d-氨基酸 (例如, 7-素-3-羧酸 acid-3-amino-d-alanine, 哈达; 4-氯-7-nitrobenzofurazan-3-氨基-d-丙氨酸纳达;tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanine;多)。在革兰氏阳性菌中, 使用致死浓度的荧光抗生素类似物来探测肽生物合成的位置是一个有效的策略, 以揭示肽插入模式1,2, 3,4。虽然荧光万古霉素标记已被用来获得洞察肽插入模式固定革兰阴性细菌5, 外膜一般提供了渗透屏障, 防止使用荧光抗生素作为活体细胞肽生物合成的探针。相比之下, 短脉冲的荧光 d-氨基酸或 d-氨基酸与双正交功能基团共价标签地区最近肽插入在广泛的活细菌细胞6,7。用合成 d-氨基酸观察到的肽插入模式包括点状和间隔 (大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、极性和间隔 (农杆菌介导和李斯特菌), 仅间隔 (金黄色葡萄球菌), 和顶端 (链霉菌 venezuelae)6,7。这些观察表明, 细菌表现出不同的细胞壁生物模式, 而使用合成 d-氨基酸作为探针来检测生长模式是许多细菌中的一个有价值的策略。
标记细菌染色体的染料包括脱氧核糖核酸 (脱氧核糖核酸) 具体小槽黏合剂 (46-diamidino-2-吲;DAPI) 和高亲和力菁染料 (绿色和橙色; 见材料清单)。DAPI 染色固定细胞协助计数细菌从环境样品8, 而 DAPI 染色的活细胞被用来表明细菌生存能力9。相比之下, 如橙和绿等菁染料经常被描述为膜 impermeant "死" 细胞污渍, 以枚举不细胞9。值得注意的是, 当这些试剂被用来探测细胞生长过程中细菌核的形态时, DAPI、橙和绿都被证明是膜 permeant, 能够标记活细胞10。在活着的大肠杆菌细胞中, DNA 的 DAPI 染色出现弥漫性, 这是由于荧光从细胞质和 DAPI 染色的细胞重复暴露到紫外线 (UV) 光 perturbs 核结构10。染色大肠杆菌或B. 枯草芽孢杆菌与橙色显示, 这种染料是膜 permeant 和提供持久荧光后, 结合到活细胞 dna, 而不影响细胞生长, dna 复制, 或染色体分离10.这些观察表明, 在许多细菌的细胞生长过程中, 可以使用菁核 DNA 染料来监测其形态。
磷脂特定的 stryl 染料, 如 n-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(二乙胺) 苯基) hexatrienyl) 吡啶敌 (4-64; 见材料清单) 是阳离子化合物和副优先与负电荷磷脂, 如心和甘油11。当4-64 被用来标记不同细菌的细胞膜时, 观察到了截然不同的模式。在大肠杆菌中, 4-64 在极点、沿侧壁的带区中以及在晚期 pre-divisional 细胞的分裂部位12中富集。在枯草芽孢杆菌中, 4-64 标记使脂质螺旋的可视化显示为13。在农杆菌介导中, 4-64 标记外膜, 并在一个特征 "马蹄形" 模式中观察到生长极没有标记14,15。这些观察表明, 这些细菌表现出不同的脂质分布, 由于存在的脂肪领域, 导致细胞不对称。4-64 标记模式的变化, 如弥漫标记, 泡或囊泡, 内陷, 或膜萎缩, 可以在特征突变, 影响分布或生物合成的脂质的信息。
除了染色细胞, 确定参与基本过程的蛋白质的功能是必要的。基本蛋白质的定性是技术上的挑战, 因为它是不可能删除的基本基因和研究表型的后果。因此, 出现了消耗蛋白质的替代方法。例如, 一个基本的基因可以被置于一个可诱导的启动子的控制之下, 而不是它的本地启动子。诱导促进剂对小分子反应灵敏, 如;锌16, 异丙基β d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, 糖22, 酸 17,23,和木糖23, 因此靶基因的转录停止, 当诱导剂被移除时, 感兴趣的蛋白质就会耗尽。消耗必需蛋白质的替代方法包括合成开关24 , 它使用小分子 RNA 相互作用阻碍靶基因的转录, CRISPR 干扰25,26阻断靶基因的转录和诱导蛋白的降解27,28 , 它使用肽标签对蛋白质进行 ClpXP 蛋白酶降解。耗尽菌株在细胞丧失生存能力之前只提供了很短的时间来表征, 因此, 在蛋白质耗竭过程中, 细胞的显微成像是一种强有力的表征方法。事实上, 活体细菌细胞显微镜使研究人员能够深入了解基本的生物学过程, 包括细胞形状维护、分泌和条块分割的机制29。
a. 农杆菌是细菌植物病原体30和自然基因工程工程师31,32。因此, 与致病性相关的机制, 包括宿主-病原体相互作用33,34,35, 分泌36, 和主机转换30,31, 37已被广泛调查。要设计防止.. 农杆菌介导的疾病或增强植物转化的策略, 必须更好地了解a. 农杆菌的生存过程。使用目标特定的染料和最近开发的蛋白质耗尽策略. 农杆菌18提供了一种方法来调查基本过程。
在这里, 详细的协议, 显微镜分析的野生, 突变体, 蛋白质枯竭菌株的A. 农杆菌提供。前两个协议描述了如何准备细胞和标签与目标特定的染料。第三个协议为准备琼脂糖垫 (图 1) 和成像细菌细胞 (图 2、 图 3、 图 4) 提供了 step-by 步骤的指导。这些协议也可能适用于其他的细菌与其他的适应, 以考虑不同的媒体条件, 生长速率, 氧要求和细胞结构。
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Protocol
1. A. 农杆菌菌株的生长
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培养A. 农杆菌菌株
- 使用一个无菌木棒或吸管提示, 接种1毫升的 ATGN 生长培养基 (参见材料清单的食谱) 与一个单一的群体所需的应变。
注: 对于A. 农杆菌衰竭菌株, ATGN 应包含1毫米 IPTG 作为诱导剂, 以维持必需蛋白的生物合成。 - 在28° c 的 ATGN 中, 以 225 rpm 的震动在夜间将A. 农杆菌菌株生长。
- 使用分光光度计测量 600 nm (OD600) 的细胞的光学密度。将单元格区域性稀释到 od600 = ~ 0.2, 并继续增长, 直到达到 od600 = ~ 0.6 为止。对于耗尽菌株, 继续增长与诱导直到 OD600 = ~ 0.6 达到。
- 使用野生和突变株的A. 农杆菌在 OD600 = 〜0.6 为目标特定的染色和/或延时显微镜 (见2和 3.1)。对于耗尽菌株, 冲洗出诱导剂 (见1.2 节)。
- 使用一个无菌木棒或吸管提示, 接种1毫升的 ATGN 生长培养基 (参见材料清单的食谱) 与一个单一的群体所需的应变。
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移除诱导剂用于表征A. 农杆菌蛋白耗竭菌株
- 颗粒1毫升的指数培养 (OD600 = 〜 0.4-0.6) 通过离心在 7000 x g 为5分钟在台式离心机在室温下。
- 清洗, 去除上清和重的新鲜介质中的颗粒, 没有诱导剂和颗粒的细胞如上所述 (1.2.1)。在新鲜培养基中共洗涤3次细胞。
- 重最后的颗粒在新鲜的媒体和集中的细胞到 OD600 = 〜 0.8, 立即染色与目标特定染料 (第2和图 4BD) 或延时显微镜 (第3.2 和图 4A).或者, 通过在细胞的染色和成像之前, 在没有诱导剂的培养基中培养细胞, pre-deplete 细胞达到预期的时间。
2. 针对A. 农杆菌细胞的靶向染色
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荧光 d-氨基酸细胞壁贴标
注: FDAAs 是无毒的荧光 d-氨基酸, 很容易被纳入到A. 农杆菌肽。这个简单的标记过程在活细胞中探测生长模式6。用于合成四 FDAAs 的协议可用38。- 颗粒500µL 的指数培养 (OD600 = 〜 0.4-0.6) 离心在 7000 x g 为 5 min 在台式离心机。重100µL 新鲜培养基中的细胞颗粒。
- 在洗涤和浓缩细胞中加入5µL 5 毫米 FDAA, 在黑暗中孵育2分钟。
注意: 限制 FDAA 暴露在光线下。潜伏期的变化取决于菌株的生长速率。通常, 潜伏期应该是5-10% 倍的时间6。 - 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 三次, 通过离心和洗涤细胞颗粒将细胞颗粒化。
- 重颗粒在 ~ 50 µL PBS。
注: 用于悬浮的 PBS 体积可能根据颗粒大小而变化。 - 使用荧光显微镜立即应用 0.8-1 µL 细胞到琼脂糖垫和图像 (见3.1 和3.2 节)。
- 另外, 通过用 ice-cold 70% 乙醇固定细胞来阻止进一步的标签合并。在1毫升的 ice-cold 70% 乙醇中重细胞团, 在冰上孵育15分钟。
- 收集细胞的离心和重在一个小体积的 PBS, 以成像在以后的时间。储存细胞悬浮在4° c 和图像在48小时内。
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DAPI 或橙染色的 DNA 染色
注意: 为了观察 DNA 结构, 细胞被标记为 DAPI 或橙色 (死细胞染色)。虽然经典描述为 "死细胞染色", 橙色是 permeant, photostable, 并不会影响细菌细胞的生长, 使活细胞 DNA 成像10。在A. 农杆菌中, 橙色标记在活细胞中很有效, 适合于延时显微镜 (图 3)。相比之下, 成像 DAPI 染色细胞所需的紫外线 (UV) 光曝光是光 (图 3), 因此 DAPI 染色最适合于染色活细胞以立即成像或染色固定细胞。- 细胞 DAPI 染色
- 1毫升的指数培养 (OD600 = 〜 0.4-0.6) 通过离心在 7000 x g 为5分钟的台式离心机。
- (可选) 在染色前固定细胞, 在1毫升的 70% ice-cold 乙醇中重细胞颗粒。在冰上孵育10-15 分钟, 用离心法收集细胞, 如2.2.1.1 所述。
- 重1毫升 PBS 中的细胞团, 含有1µL 的 DAPI 库存溶液 (1 毫克/毫升; 请参见材料表)。用移轻轻地混合, 在黑暗中孵育5分钟。
- 在1毫升 PBS 中离心 7000 x g 的5分钟和重的颗粒细胞去除过量的 DAPI。再清洗两次细胞, 重50µL PBS 或培养基中的颗粒。
- 使用荧光显微镜立即应用 0.8-1 µL 细胞到琼脂糖垫和图像。见3.1 和3.2 节。
注意: 该协议不是最佳的延时显微镜观察染色体动力学 (图 3)。考虑使用橙色染色作为替代 (参见2.2.2 节)。
- 活细胞的橙色染色
- 1毫升的指数培养 (OD600 = 〜 0.4-0.6) 通过离心在 7000 x g 为5分钟的台式离心机。重细胞颗粒在1毫升 PBS 含有1µL 橙库存溶液 (见材料清单)。用移轻轻地混合, 在黑暗中孵育5分钟。
- 通过离心和重1毫升的 PBS 去除多余的橙颗粒细胞。再冲洗两次细胞, 重50µL PBS 中的颗粒。
- 使用荧光显微镜立即应用 0.8-1 µL 细胞到琼脂糖垫和图像。见3.1 和3.2 节。
注: 本协议适用于活细胞, 适合于定时显微镜观察染色体动力学 (图 3)。如果不方便立即图像, 细胞可以固定在 ice-cold 70% 乙醇 (见第 2.2.1.2)。
- 细胞 DAPI 染色
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膜贴标
注: 亲油性苯乙烯荧光染料4-64 已被广泛用于观察细菌细胞的细胞膜。与许多细菌相比, 4-64 标记为a. 农杆菌细胞不统一标签, 而是经常出现 "马蹄形" 模式14,15。值得注意的是, 生长极几乎没有污点, 而老极点是强烈的标签。因此, 4-64 在A. 农杆菌中实现了细胞生长模式和膜结构的可视化。- 在1毫升的指数相细胞培养中添加 FM 4-64 到最后浓度8µg/毫升, 在室温下孵育5分钟, 在黑暗中。
- 在1毫升的 PBS 中, 在台式离心机和重细胞颗粒中, 在 7000 x g 处离心5分钟的颗粒标记细胞。清洗细胞共三次, 去除多余的染料。
- 重细胞在一小体积的 PBS 和当场的琼脂糖垫上立即图像。(见3.1 和3.2 节)
警告: 细胞必须立即成像, 以观察特征标记模式。
3. A. 农杆菌细胞的成像
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琼脂糖垫制备
注:图 1包含一个典型的琼脂糖垫的图像序列 (面板 a) 和示意图 (面板 B), 用于延时显微镜。琼脂糖垫通常是根据需要准备的。- 3.1.1. 使用片作为指导, 并削减了22毫米 x 22 毫米的实验室胶片 (见材料清单), 通过运行手术刀周围的边缘。
- 从实验室胶片的中心切出一个正方形, 留下一个2-5 毫米的边界, 作为琼脂糖垫的衬垫。丢弃中心切口。
- 将胶片垫片放在玻璃滑梯上 (75 mm x 25 mm), 用氨水和无酒精清洗剂 (见材料清单) 和热量进行清洗, 直到胶片稍微融化在玻璃上 (图 1A中的顶部图像)。要熔化实验室胶片, 请将热块的边缘设置为70° c 或在火焰上轻轻地熔化。
- 用0.075 克琼脂糖 (见材料清单) 在5毫升的培养基中用小烧瓶制备琼脂糖溶液。在微波中加热溶液, 周期性旋转, 直到琼脂糖溶解, 溶液清晰。保持琼脂糖溶液在55-70 ° c, 并使用在48小时内建设多个琼脂糖垫。
- 吸管介质含有 1.2-1.5% 琼脂糖进入垫片的中心。
注: 介质的体积通常是 50-60 µL, 但会因垫片大小而异。将介质添加到冷滑块中会导致琼脂糖固化得太快, 因此幻灯片应保持在温暖的表面上。热块的边缘设置到70° c 工作很好。水琼脂糖或缓冲琼脂糖溶液, 如磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 可以使用, 而不是培养基中含有琼脂糖的应用, 其中持续细胞生长是不需要的。对于成像损耗的应变, 诱导剂可以存在或缺席的媒体。诱导剂的存在可以作为一种控制, 而诱导因子的缺乏将会暴露出衰竭表型。 - 将片在垫圈上均匀地分布琼脂糖。
- 将滑块放置在阴凉、平面上, 固化为〜2分钟. 避免 overdrying 琼脂糖垫, 因为这将导致在琼脂糖垫上的皱纹表面和池的细胞悬浮时, 适用于表面。
- 小心地把片从琼脂糖垫上滑下来。
注意: 不要急于迈出这一步。琼脂糖垫很容易撕裂, 不均匀的琼脂糖垫可以使成像困难。 - 允许琼脂糖垫的空气干燥1-2 分钟的室温, 直到表面的垫似乎干燥。使用手术刀, 取出一小条琼脂糖创建一个气囊 (中间图像,图 1A);空气袋通常是〜2毫米 x 7-10 毫米和A. 农杆菌细胞往往生长最好的靠近空气袋 (图 1C)。
注: 对于固定细胞的成像或在不监测生长的条件下, 不需要空气袋。 - 点 0.8-1 µL 的细胞在琼脂糖垫和覆盖新的片。轻轻地将片放在琼脂糖垫的顶端, 将细胞分布在琼脂糖垫的表面。
- 使用熔融 VALAP 密封片的边缘 (请参阅材料表中的配方;图 1A, 底部图像)。没有密封沿所有的边缘和角落的片可能会导致干燥的琼脂糖垫, 这将导致细胞在成像过程中漂移。注: 片的密封只需要长期的延时成像。
图 1: 琼脂糖垫准备.(A) 琼脂糖垫制备协议的图像序列。图1是一张带有实验室胶片衬垫的幻灯片。在图2中, 琼脂糖垫和空气袋是可视化的。最后, 图像3显示完整的琼脂糖垫与细胞下的 coverglass 和密封 VALAP。(B) 提供了用于延时显微镜的琼脂糖垫示意图。在示意图上标注了琼脂糖垫的主要功能。(C) 空气袋促进了在琼脂糖垫上的A. 农杆菌的生长。显示了在琼脂糖垫上生长的野生. 农杆菌细胞的图像20小时。图像拍摄的位置越来越远离空气袋。从图像最接近的边缘到空气袋的距离显示在每个图像的上方。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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成像
注: 差分干扰对比度、相位对比度和荧光成像采用倒置显微镜, 配备基于硬件的自动、自动化阶段、标准过滤器、LED 光源、60X 油浸目的 (1.4 NA) 的相位对比或差分干扰对比 (DIC), 和1K 电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD) 相机。显微镜应该放在一个温度控制的房间里。或者, 在成像过程中, 可以使用舞台加温或腔室来保持一致的温度。- 荧光显微镜
注意: 对于活细胞的荧光成像, 有必要限制图像采集的次数, 并优化曝光时间, 以最小化漂白和光。对于每个染料的成像, 建议找到一个最佳曝光时间, 提供足够的荧光检测, 但不导致漂白或光。在图 2-4中, 所有荧光图像都使用了200毫秒的曝光时间。对于图 3中显示的延时序列, 每10分钟获取3小时的图像。- 将浸入式油放在所需的目标上, 并将倒滑梯放在舞台上的滑动架上。使用聚焦旋钮使细胞进入焦点。
- 获取相 (或 DIC) 和所期望的荧光过滤器的图像。
注: 在图 2中使用的污点的最大激发和发射波长,图 3和图 4如下所示: 哈达 (405/460), 纳 (450/555), 多 (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), 橙色 (547/570)。
- 延时显微镜
注意: 在延时显微镜下, 以下功能是计算机控制的: x、y、z 位置、百叶窗和荧光过滤器。一个基于硬件的自动系统是最佳的, 以保持重点在延时成像。或者, 可以使用基于软件的自动循环。- 将浸入式油放在所需的目标上, 并将倒滑梯放在舞台上的滑动架上。使用聚焦旋钮使细胞进入焦点。
- 可选: 获取多个 (x、y) 位置。随机选择10个单元格, 接近于琼脂糖衬垫的空气袋。
- 在所需的时间间隔内, 在相或 DIC 中设置时间序列获取图像。
注意: 对于图 4中所示的延时序列, 在 14 h 中每10分钟就获得了 DIC 图像和30毫秒曝光。当在延时显微镜中使用荧光成像时, 调整采集间隔和曝光时间, 以最小化漂白和光。
- 荧光显微镜
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Representative Results
野生的目标特定标记A. 农杆菌单元格
为了说明细胞形态不受洗涤步骤或处理的影响, 1% 甲基亚砜 (这是用来稀释荧光染料), 细胞直接成像从文化 (图 2A, 远左面板), 洗后的细胞离心的描述在 1.2 (图 2A, 左面板), 或后孵化细胞与1% 亚砜10分钟和洗涤细胞 (图 2A, 右面板)。这些图像表明, 形态不受洗涤或存在的亚甲基亚砜的影响。此外, 基于生长曲线分析的洗涤或亚砜处理不影响细胞生长 (数据未显示)。此外, 使用 ice-cold 乙醇固定. 农杆菌并不会导致形态学上的总变化 (图 2A, 远右面板)。
接下来, 目标特定染料被用来观察细胞壁生物, 膜域, 和 DNA 在野生.新的肽插入的模式观察后, 标记三荧光 d-氨基酸: 哈达 (图 2B, 左面板), 纳 (图 2B, 中心面板), 和多 (图 2C, 右面板)。在所有三标记实验中, 新的肽标记在细胞的生长极或隔膜中得到了丰富。这些生长模式一直观察与所有三 FDAAs, 表明 FDAA 选择可以修改, 使双标记与其他污渍或细胞表达荧光标记蛋白。亲油性染料4-64 优先标签的老极地区的a. 农杆菌细胞产生的特点马蹄形模式 (图 2C)。橙色 (图 2D, 左面板) 和 DAPI (图 2D, 右面板) 标签的 DNA 在活体内A.在晚期 pre-divisional 细胞, 两个不同的核被观察与橙色染色, 而 DNA 标记显得更加弥漫与 DAPI 染色 (图 2D) 与实验结果一致, 在大肠杆菌10。
DNA 染料用于延时显微镜的适用性
为了确定 DAPI 或橙色是否适合在细胞生长过程中核形态的时间推移成像, 同样比例的未标记, DAPI 标记, 和橙色标记的野生. 农杆菌细胞混合和发现琼脂糖垫。在0时, 初始图像使用相衬、DAPI 和 TRITC 滤镜来确定每个单元格是否标记。细胞混合物在三不同的情况下被成像: (1) 仅相衬显微镜, (2) 相衬和荧光显微镜使用 TRITC 过滤器和 (3) 相衬和荧光显微镜使用 DAPI 过滤器。每10分钟采集一次图像3小时。所有细胞生长良好, 无论是使用的荧光染色, 当图像与相对比显微镜表明, 无论是橙色或 DAPI 染色损害细胞生长 (图 3, 顶部面板)。使用 TRITC 滤镜 (图 3, 中心面板) 的相位显微镜和荧光显微镜成像时, 所有细胞也都生长良好。橙色标签是受漂白, 但可以观察至少2小时 (13 总曝光 200 ms), 表明该染料适合短期显微镜的活细胞。无论标签, 所有细胞停止生长在一个小时内, 当影像的相位显微镜和荧光显微镜使用 DAPI 滤镜 (图 3, 底部面板)。这一观察结果表明, a. 农杆菌对紫外线照射很敏感, 并表明需要使用 uv 滤镜进行成像的染料应避免进行延时显微镜实验。
时间推移成像和目标特定的标记A. 农杆菌耗尽应变
两个饱和转诱变39和未能构造删除应变18,40表明主调节器蛋白, CtrA, 是必不可少的在a. 农杆菌。为了证明损耗菌株的显微分析的价值, 先前描述的ctrA损耗应变18被用显微镜进行了表征。在图 4A中, 使用了延时显微镜来比较ctrA耗尽单元的生长情况, 其中ctrA表达式被诱导 (顶部) 和 uninduced (底部). 在 CtrA 的存在下, 一个单细胞在14小时内产生了一个菌落。相比之下, 当 CtrA 耗尽时, 细胞要么裂解, 要么没有分裂。没有分裂的细胞表现出大体的形态学变化, 包括从 mid-cell 和细胞两极的舍入。这些观察表明, CtrA 在细胞分裂的调控中具有重要作用。
在图 4B-d中, 使用荧光染料来表征ctrA在感应或耗尽ctrA后耗尽应变 10 h. 细胞被脉冲标记为2分钟 (图 4B)。当 CtrA 存在 (顶部面板), 极性肽生物合成观察。与此相反, 在极和大的 mid-cell 肿胀发生时, CtrA 被耗尽。这种观察与持续的肽合成是一致的, 尽管细胞分裂的失败。在ctrA损耗应变 (图 4C) 中, 用菁染料 dna 染色法来表征 dna 的分布。当 CtrA 存在时, 生长中的细胞有均匀分布的 DNA, 核的分离在晚期 pre-divisional 细胞中明显;相比之下, 当 CtrA 耗尽时, DNA 在整个细胞中分布不均匀。这些观察表明, CtrA 有助于适当的 DNA 复制或分离。最后, ctrA耗尽单元格被标记为 4-64 (图 4D)。在 CtrA 的存在下, 细胞膜被标记为具有特征的马蹄形模式, 其中生长极没有污点。在细胞衰竭的 CtrA, 4-64 似乎标签整个膜, 虽然一杆更强烈染色。这一观察表明, 细胞膜保持完好, 虽然脂 microdomain 组织可能会被打乱, 当 CtrA 被耗尽。
图 2: 野生农杆菌的代表性图像细胞标记为靶向特定染料.(a) 在洗涤协议前后, 使用1% 二甲基亚砜或 ice-cold 乙醇固定后, 对a.. (B) A. 农杆菌细胞的极性生长通过荧光 d-氨基酸哈达、纳和多的标记显示。(C) 染色的A. 农杆菌) 与亲油性4-64 染色。(D) 使用带有特定于 DNA 的染料橙色和 DAPI 的A. 农杆菌细胞染色。对于面板 B-d, 相位对比度 (顶部) 和荧光 (底部) 图像显示。在荧光图像中提供细胞轮廓以供参考。缩放栏 = 2 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在活的A. 农杆菌细胞中 DNA 的 DAPI 和橙色标记的比较.相同比例的未标记、DAPI 标记和橙色标记的野生A. 农杆菌细胞是混合的, 并在琼脂糖垫上发现。在0时, 初始图像使用相衬、TRITC 和 DAPI 滤镜来确定是否标记了细胞。(A) 无标记、DAPI 标记和橙色标记的细胞的时间间隔, 由相衬显微镜成像。(B) 未标记的、DAPI 标记的和橙色标记的细胞的时间间隔, 用相显微镜和荧光显微镜对 TRITC 滤镜进行成像。(C) 未标记的、DAPI 标记的和橙色标记的细胞的时间间隔, 用相显微镜和荧光显微镜对 DAPI 滤镜进行成像。缩放栏 = 2 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 在诱导和 uninduced 条件下的ctrA损耗应变的代表性图像.(A) 在ctrA被诱导 (顶部) 或耗尽 (底部) 的情况下, ctrA耗尽应变的延时显微镜。每个面板上的数字表示小时数。(B) 相衬 (左) 和荧光 (右) 图像的细胞标记与纳。(C) 相衬 (左) 和荧光 (右) 图像的细胞标记为橙色。(D) 相衬 (左) 和荧光 (右) 图像的细胞标记为4-64。在荧光图像中提供细胞轮廓以供参考。缩放栏 = 2 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
此协议包含一系列用于调查a. 农杆菌野生、突变体和耗尽菌株的过程。值得注意的是, 《议定书》一节所列的所有程序都可以很容易地适用于其他细菌菌株, 并对培养基、温度和生长速率进行了额外的修改。
使用靶向染料是一个很有价值的工具, 可以为细菌细胞中的细胞周期事件提供详细的描述。在这里, 肽插入模式观察使用荧光 d-氨基酸, 血脂领域是可视化与 4-64, 核被标记为 DAPI 或橙色。每种协议都可以在优化洗涤协议后用于其他细菌, 并确保二甲基亚砜的治疗不会损害生长或形态学。主要考虑因素包括选择洗涤步骤的缓冲液、标签注册的孵化时间, 以及选择合适的荧光以避免荧光或允许多重标记研究。例如, 一个替代的亲油性的红色荧光膜染色 (4-64) 是绿色荧光膜染色 (1-43)。同样地, 蓝色, 绿色, 和红色荧光 d 氨基酸是可利用的6,38和 d-氨基酸以双正交把柄可以被共轭到共同的荧光通过点击化学6,7。最后, 除了橙色荧光菁染料, 绿色荧光菁 dna 染料是可用的, 并执行良好的活细菌细胞10。用靶向染料标记的关键细胞结构的可视化可以与荧光蛋白的观察相结合, 从而在细菌的基本过程中获得机械的洞察力。
这些协议包括必要的条件, 显微镜观察的A. 农杆菌耗竭污渍, 应该有可能扩大这些方法的蛋白质耗尽菌株的其他细菌。由于在细胞停止生长或溶解之前完成调查的时间有限, 因此对耗竭菌株的定性可能特别具有挑战性。在贴标过程中, 充分清洗细胞去除多余染料的痕迹是至关重要的;然而, 一些细胞中的基本蛋白质的衰竭在其细胞表面有缺陷, 这可能导致他们对洗涤步骤敏感。增加细胞培养物的起始体积可以帮助补偿洗涤步骤中细胞的损失。在没有诱导剂的液体培养中生长的细胞膜或细胞壁上的耗尽菌株可能容易发生细胞裂解。包括一个 osmoprotectant (5% 蔗糖工作良好的. 农杆菌) 可以帮助保持细胞形态学和限制细胞裂解过程中耗尽。在用荧光染料染色之前, 有必要用经验来确定 pre-deplete 细胞的适当时间。具有 permeablized 膜或细胞壁的细胞可能易于细胞裂解或非选择性标记与荧光试剂, 使成像的后期耗尽时间点特别具有挑战性。
对a. 农杆菌(或其他细菌细胞) 的延时显微镜的关键步骤是琼脂糖垫的制备。琼脂糖垫需要的水平, 以确保良好的重点在整个延时显微镜实验。此外, 片必须完全密封, 以防止琼脂糖垫干燥和改变焦平面。对于A. 农杆菌, 细胞生长需要氧气。在长时间的延时显微镜实验 (图 1C) 中, 需要在气囊附近进行成像, 才能使A..如果细胞在短短几个小时后无法生长或停止生长, 最好在空气袋附近准备一个有较大气囊和图像的琼脂糖垫。即使是一个良好的琼脂糖垫与适当的空气袋只能支持.如果需要较长的延时序列, 应考虑微或流细胞等替代方法。如果细胞在成像过程中偏离焦点, 请确保琼脂糖垫是水平和正确地密封在片。请注意, 即使是一个近乎完美的琼脂糖垫, 也有可能是一些细胞漂移的焦点, 从而成像多个领域和频繁重新对焦是强烈建议。对于其他细菌, 制备琼脂糖垫的替代方法应考虑41,42,43 , 以最符合细菌生长的要求。琼脂糖垫也是有用的固定细胞在成像的标记或定细胞时, 不需要定时。在这种情况下, 密封片是不必要的, 可供选择的方法建造琼脂糖垫, 可以存储, 直到后来可能是适当的43。
总的来说, 使用目标特定的染料和延时显微镜可以提供关于细菌的基本过程的洞察。在这里, 我们说明了通常马蹄形的标签与亲油性4-64 染料和特征极性和间隔标记与荧光 d-氨基酸在. 农杆菌。在A. 农杆菌中对这些模式的观察与这种细菌的极性生长是一致的44 , 类似的研究可能会揭示其他细菌生长模式的信息。发现, 如橙色的菁染料是适合的时移显微镜研究10 (图 3) 将有助于仔细研究野生和突变株细胞生长过程中的核形态学。在基本蛋白质耗尽过程中, 成像荧光靶向染料可以提供关键的观察, 以确定蛋白质的功能。最后, 由于许多这些染料都有不同的光谱特性, 同时使用多个标签的研究应该能够洞察细胞周期进展过程中的关键过程的协调。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢迈克尔 VanNieuwenhze (印第安纳大学) 在图 2和图 4中使用的 FDAAs 的礼物。我们感谢布朗实验室的成员在准备这份手稿时的反馈。研究在褐色实验室在A. 农杆菌细胞成长和分裂由国家科学基金会 (IOS1557806) 支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
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