Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Live celle fluorescens mikroskopi å observere viktige prosesser under mikrobiell cellevekst

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

Forstå funksjonen av viktige prosesser i bakterier er utfordrende. Fluorescens mikroskopi med mål-spesifikke fargestoffer kan gi viktig innsikt i mikrobiell celle vekst og celle syklus progresjon. Her brukes Agrobacterium tumefaciens som en modell bakterie for å markere metoder for levende celle bildebehandling for kategorisering av viktige prosesser.

Abstract

Kjernen cellulære prosesser som utryddelse og segregering, proteinsyntese, cellevegg biosyntesen og celledeling stole på funksjon av proteiner som er essensielle for bakteriell overlevelse. En rekke mål-spesifikke fargestoffer kan brukes som sonder bedre forstår disse prosessene. Flekker med lipofile fargestoffer kan observasjon av membran struktur, visualisering av lipid microdomains og oppdagelsen av membran blebs. Bruk av fluorescerende-d-aminosyrer (FDAAs) å undersøke stedene i Peptidoglykan biosyntesen kan angi defekter i cellen vegg biogenesis eller celle vekst mønster. Endelig kan nukleinsyre flekker indikere mulige feil i DNA replikering eller kromosom raseskille. Cyanine DNA flekker etiketten levende celler og er egnet for time-lapse mikroskopi aktivering av real-time observasjoner av nucleoid morfologi under cellevekst. Protokoller for cellen merking kan brukes på protein uttømming mutanter å identifisere feil i membranen struktur, cellevegg biogenesis eller kromosom raseskille. Videre kan time-lapse mikroskopi brukes til å overvåke morfologiske endringer som en viktig protein er fjernet og kan gi ytterligere innsikt i protein-funksjonen. For eksempel fører uttømming av viktige celledeling proteiner til filamentation eller forgrening, mens uttømming av celle vekst proteiner kan føre til at celler blir kortere eller rundere. Her tilbys protokoller for cellevekst, mål-spesifikke merking og time-lapse mikroskopi for bakteriell anlegget patogen Agrobacterium tumefaciens. Sammen, mål-spesifikke fargestoffer og time-lapse mikroskopi aktiverer karakteristikk av viktige prosesser i A. tumefaciens. Til slutt, protokollene gitt kan lett endres for å undersøke viktige prosesser i andre bakterier.

Introduction

Fremdrift gjennom bakteriell cellen syklus krever koordinering av mange prosesser inkludert membran og cellevegg biosyntesen, utryddelse og segregering og celledeling. Å fullt ut forstå kompleksiteten av bakteriell cellebiologi, er det nødvendig å studere disse viktige hendelser; men er dette en ikke-triviell oppgave siden cellen levedyktighet er svekket når nøkkelkomponenter av disse er mutagenized. Epifluorescence mikroskopi kombinert med mål-spesifikke fargestoffer er en kraftig tilnærming å undersøke disse viktige prosesser i wildtype og mutant bakteriell stammer.

Peptidoglykan-spesifikke fargestoffer inkluderer fluorescerende antibiotika (vancomycin-FL, bocillin-FL) og fluorescerende-d-aminosyrer (for eksempel 7-hydroxycoumarin-3-karbonoxylsyre syre-3-amino-d-alanin, HADA, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). I Gram-positive bakteriene, har bruk av sublethal konsentrasjoner av fluorescerende antibiotika analogs å undersøke områder av Peptidoglykan biosyntesen vært en effektiv strategi å avsløre Peptidoglykan innsetting mønstre1,2, 3,4. Mens fluorescerende vancomycin merking er brukt til å få innsikt i Peptidoglykan innsetting mønstre i fast Gram-negative bakterier5, gir den ytre membranen generelt en permeabilitet barriere som forhindrer bruk av lysrør antibiotika som en sonde for Peptidoglykan biosyntesen i levende celler. Derimot merke korte pulser fluorescerende-d-aminosyrer eller d-aminosyrer med biorthogonal funksjonelle grupper covalently regioner i siste Peptidoglykan innsetting i et bredt spekter av levende bakterieceller6,7. Mønstre av Peptidoglykan innsetting som har blitt observert med syntetisk d-aminosyrer inkluderer vises punctate og septal (Escherichia coli og Bacillus subtilis), polar og septal (Agrobacterium tumefaciens og Listeria monocytogenes), septal eneste (Staphylococcus aureus) og apikale (Streptomyces venezuelae)6,7. Disse observasjonene indikerer at bakterier ha mangfoldig mønstre av cellen vegg biogenesis og at bruken av syntetiske d-aminosyrer som sonder for å undersøke vekst mønster er en verdifull strategi i mange bakterier.

Fargestoffer som etiketten bakteriell kromosomene inkluderer deoksyribonukleinsyre (DNA) bestemt mindre groove dokumentordneren (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) og høy affinitet cyanine fargestoffer (grønn og oransje; se materialer liste). DAPI farging av fast celler hjelper opplisting av bakterier fra miljøprøver8, mens DAPI farging av levende celler brukes til å angi bakteriell levedyktighet9. Derimot fargestoffer cyanine som oransje og grønn er ofte beskrevet som membran impermeant "død" celle flekker liste opp ikke-levedyktige celler9. Bemerkelsesverdig, når skal disse reagensene brukes å undersøke morfologi av bakteriell nucleoid under cellevekst, DAPI, oransje og grønn var alle vist seg membran permeant og i stand til merking lever celler10. Lever E. coli celler, DAPI farging av DNA vises diffus på grunn av auto-fluorescens cytoplasma og gjentatte eksponeringer av DAPI-farget celler til ultrafiolett (UV) lys perturbs nucleoid struktur10. Farging E. coli eller B. subtilis med oransje avslører at dette fargestoffet membran permeant og gir langvarig fluorescens ved binding til DNA i lever celler uten at cellevekst, utryddelse eller kromosom raseskille10 . Disse observasjonene foreslår at cyanine DNA fargestoffer kan brukes til å overvåke morfologi av nucleoids under cellevekst i mange bakterier.

Phospholipid-Specific stryl fargestoffer som N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64, se materialer liste) er kationisk forbindelser og knytte fortrinnsvis negativt ladet fosfolipider som cardiolipin og phosphatidylglycerol11. Ulike mønstre er observert når 4-64 brukes til å merke membran av forskjellige bakterier. Escherichia coli, 4-64 er beriket i polene, i band langs den laterale veggen, og i divisjon områder av pre-divisional celler12. I Bacillus subtiliskan 4-64 merking visualisering av lipid spiraler13. I Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketter den ytre membranen og er observert i et karakteristisk "hestesko" mønster der vekst pole er blottet for merking14,15. Disse observasjonene indikerer at disse bakteriene ha heterogene lipid distribusjoner på grunn av tilstedeværelsen av lipid domener som bidrar til mobilnettet asymmetri. Endringer i 4-64 merking mønstre som tilstedeværelse av diffus merking, blebs eller blemmer, invaginations eller membran krymping kan være informativ karakteriserer mutanter som påvirker distribusjon eller biosyntesen av lipider.

Utover flekker celler, er bestemme funksjonen av protein delta i viktige prosesser nødvendig. Karakterisering av essensielle proteiner er teknisk utfordrende fordi det ikke er mulig å slette viktige gener og studere fenotypiske konsekvensene. Dermed har alternative tilnærminger som tømmer protein dukket opp. For eksempel kan en viktig genet settes under kontroll av en induserbart arrangøren i stedet for sitt opprinnelige promoter. Induserbart arrangører er mottakelig for små molekyler som; sink16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, xylose23, dermed transkripsjon av målet genet opphører og protein av interesse er oppbrukt når induser fjernes. Alternative tilnærminger for å tappe essensielle proteiner av interesse inkluderer syntetisk riboswitches24 som bruker små molekyl-RNA interaksjoner for å hindre transkripsjon av målet gener, CRISPR forstyrrelser25,26 til blokk transkripsjon av målet gener og induserbart protein fornedrelse27,28 som bruker peptid tags målet proteiner til fornedrelse som ClpXP protease. Uttømming stammer gir bare en kort tid for karakterisering før cellene mister levedyktighet, derfor mikroskopiske imaging celler over tid under protein uttømming er en kraftig metode for karakterisering. Faktisk har mikroskopi levende bakterielle celler aktivert forskere å få innsikt i grunnleggende biologiske prosesser, herunder mekanismer for cellen figur vedlikehold og sekresjon compartmentalization29.

A. tumefaciens er en bakteriell anlegget patogen30 og naturlige genetiske ingeniør31,32. Dermed mekanismer knyttet til virusets, inkludert vert-patogen interaksjoner33,34,35, sekresjon36og vert transformasjon30,31, 37 har blitt grundig undersøkt. Utforme strategier som forhindre A. tumefaciens mediert sykdom eller forbedre anlegget transformasjon, må prosessene avgjørende for A. tumefaciens overlevelse bli bedre forstått. Bruk av mål-spesifikke fargestoffer og den siste utviklingen av en protein uttømming strategi for A. tumefaciens18 gir et middel til å undersøke viktige prosesser.

Her tilbys detaljert protokoller for microscopic analyse av wildtype, mutant og protein uttømming stammer av A. tumefaciens . De første to protokollene beskriver hvordan å forberede celler og merke dem med mål-spesifikke fargestoffer. Tredje protokollen gir trinnvise instruksjoner om forbereder agarose pads (figur 1) og tenkelig bakterieceller (figur 2, Figur 3, Figur 4). Disse protokollene kan også være egnet for andre bakterier med ytterligere tilpasninger å ta hensyn til ulike medier forhold, vekst, oksygen krav og celle strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vekst av A. tumefaciens stammer

  1. Dyrking A. tumefaciens stammer
    1. Bruk en steril tre pinne eller Pipetter tips for å vaksinere 1 mL av ATGN vekst medier (se materialer liste for oppskriften) med en enkelt koloni av ønsket belastningen.
      Merk: For A. tumefaciens uttømming stammer, ATGN bør inneholde 1 mM IPTG som en induser å opprettholde biosyntesen av viktige protein.
    2. Vokse A. tumefaciens stammene overnatter i ATGN på 28 ° C med skjelvende på 225 rpm.
    3. Måle den optiske densitet for cellene på 600 nm (OD600) bruker et spektrofotometer. Fortynne cellekultur et OD600 = ~0.2 og fortsetter å vokse til OD600 = ~0.6 er nådd. For uttømming stammer, fortsette å vokse med induser til OD600 = ~0.6 er nådd.
    4. Bruke wildtype og mutant stammer av A. tumefaciens på OD600 = ~0.6 for mål-spesifikke flekker og/eller time-lapse mikroskopi (se pkt. 2 og 3.1). For uttømming stammer, bleke induser (se paragraf 1.2.)
  2. Fjerning av induser for karakterisering av A. tumefaciens protein uttømming stammer
    1. Pellets 1 mL av eksponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) med sentrifugering 7000 x g i 5 minutter i en desktop sentrifuge ved romtemperatur.
    2. For å vaske, fjerne nedbryting og resuspend pellet i frisk media uten induser og pellets cellene som beskrevet ovenfor (1.2.1). Vask cellene totalt 3 ganger i frisk medier.
    3. Resuspend den endelige pellet i frisk media og konsentrere cellene til en OD600 = ~0.8 for umiddelbar flekker med målet spesifikke fargestoffer (inndeling 2 og figur 4BD) eller time-lapse mikroskopi (kapittel 3.2 og figur 4A) . Eventuelt utarme pre cellene i den ønskede periode av voksende cellene i media uten induser før farging og tenkelig cellene.

2. mål-spesifikk farging av A. tumefaciens celler

  1. Fluorescerende d-amino acid cellevegg merking
    Merk: FDAAs er giftfri fluorescerende d-aminosyrer som er lett innlemmet i A. tumefaciens Peptidoglykan. Denne enkel merking prosedyre sonder vekst mønstre i lever celler6. Protokoller for syntese av fire FDAAs er tilgjengelige38.
    1. Pellets 500 µL eksponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) med sentrifugering 7000 x g i 5 minutter i en desktop sentrifuge. Resuspend celle pellet i 100 µL av fersk media.
    2. Legge til 5 µL av 5 mM FDAA til vasket og konsentrert celler og ruge i 2 minutter i mørket.
      Merk: Begrense FDAA eksponering for lys. Tidspunktet for inkubasjon vil variere avhengig av veksten av belastningen. Vanligvis skal inkubasjon ganger 5-10% av dobling tid6.
    3. Pellets cellene med sentrifugering og vask celle pellets med fosfat bufret saltvann (PBS) tre ganger.
    4. Resuspend pellets i ~ 50 µL PBS.
      Merk: Volumet på PBS brukes for rørets kan variere basert på pellet størrelse.
    5. Bruke 0,8-1 µL av celler agarose pad og bildet med epifluorescence mikroskopi umiddelbart (se avsnitt 3.1 og 3.2).
      1. Også stoppe videre etiketten innlemmelse ved å feste cellene med iskald 70% etanol. Resuspend celle pellet i 1 mL av iskalde 70% etanol og ruge på isen i 15 minutter.
      2. Samle celler med sentrifugering og resuspend i et lite volum på PBS for bildebehandling senere. Lagre celle suspensjoner på 4 ° C og bilde innen 48 timer.
  2. DNA flekker med DAPI eller Orange flekker
    Merk: Å observere DNA struktur, celler er merket med enten DAPI eller oransje (død celle flekken). Selv om klassisk beskrevet som en "døde celler flekk", Orange er permeant, photostable, og påvirker ikke veksten av bakterielle celler, slik at live-celle DNA imaging10. I A. tumefaciens, oransje merking fungerer bra i levende celler og er egnet for time-lapse mikroskopi (Figur 3). I kontrast, ultrafiolett (UV) lys eksponering nødvendig for bildebehandling DAPI-farget celler er fototoksisk (Figur 3), og dermed DAPI flekker er best egnet til farging levende celler for umiddelbar imaging eller flekker fast celler.
    1. DAPI farging av celler
      1. Pellets 1 mL av eksponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) med sentrifugering 7000 x g i 5 minutter i en desktop sentrifuge.
      2. Eventuelt for å fastsette celler før farging, resuspend celle pellet i 1 mL av 70% iskald etanol. Ruge på is 10-15 min. samle cellene med sentrifugering som beskrevet i 2.2.1.1.
      3. Resuspend celle pellet i 1 mL av PBS som inneholder 1 µL DAPI lager løsning (1 mg/mL, se Materialer tabell). Bland forsiktig av pipettering og ruge i 5 minutter i mørket.
      4. Pellets celler med sentrifugering 7000 x g i 5 min og resuspend i 1 mL av PBS fjerne overflødig DAPI. Vask cellene to ganger og resuspend pellets i 50 µL PBS eller media.
      5. Bruke 0,8-1 µL av celler agarose pad og bildet med epifluorescence mikroskopi umiddelbart. Se avsnittene 3.1 og 3.2.
        Merk: Denne protokollen er ikke optimal for time-lapse mikroskopi å observere kromosom dynamics (Figur 3). Vurder å bruke oransje flekker som et alternativ (se avsnitt 2.2.2).
    2. Oransje flekker av levende celler
    3. Pellets 1 mL av eksponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) med sentrifugering 7000 x g i 5 minutter i en desktop sentrifuge. Resuspend celle pellet i 1 mL av PBS som inneholder 1 µL av oransje lagerløsning (se materialer liste). Bland forsiktig av pipettering og ruge i 5 min i mørket.
    4. Pellets celler med sentrifugering og resuspend i 1 mL av PBS fjerne overflødig Orange. Vask cellene to ganger og resuspend pellet i 50 µL PBS.
    5. Bruke 0,8-1 µL av celler agarose pad og bildet med epifluorescence mikroskopi umiddelbart. Se avsnittene 3.1 og 3.2.
      Merk: Denne protokollen fungerer godt med levende celler og er egnet for time-lapse mikroskopi å observere kromosom dynamics (Figur 3). Hvis det ikke er praktisk å image umiddelbart, kan celler være løst i iskalde 70% etanol (se avsnitt 2.2.1.2).
  3. Membran merking
    Merk: Lipofile styryl fluorescerende fargestoff 4-64 er brukt mye å observere membran av bakterielle celler. I motsetning til mange bakterier, 4-64 merket A. tumefaciens celler etiketten ikke jevnt, men ganske ofte viser en "hestesko" mønster14,15. Bemerkelsesverdig, vekst pole er nesten uten flekk mens gamle pole er intenst merket. Dermed kan 4-64 visualisering av både celle vekst mønstrene og membran strukturen i A. tumefaciens.
    1. Legge FM 4-64 til en siste konsentrasjon av 8 µg/mL i 1 mL av eksponentiell fase cellekultur og ruge ved romtemperatur i 5 minutter i mørket.
    2. Pellets merket celler med sentrifugering 7000 x g i 5 minutter i en desktop sentrifuge og resuspend celle pellet i 1 mL av PBS. Vask cellene totalt tre ganger å fjerne overflødig fargestoff.
    3. Resuspend celler i et lite volum på PBS og flekk på en agarose pad å image umiddelbart. (Se avsnittene 3.1 og 3.2)
      FORSIKTIG: Celler må avbildes umiddelbart for å observere karakteristiske merking mønstre.

3. imaging A. tumefaciens celler

  1. Agarose pad forberedelse
    Merk: Figur 1 inneholder en bildesekvens (panel A) og skjematisk (panel B) av en typisk agarose pad forberedte time-lapse mikroskopi. Agarose pads er vanligvis utarbeidet etter behov.
    1. 3.1.1. Bruk en dekkglassvæske som en guide og kuttet en 22 x 22 mm for laboratoriet film (se materialer liste) ved å kjøre en skalpell rundt kantene.
    2. Kutte en firkant utenfor sentrum av laboratoriet filmen forlater en ~ 2-5 mm kantlinje som en pakning for agarose pad. Kast center utskjæringen.
    3. Plasser den filmen pakningen på et glass lysbilde (75 mm x 25 mm) med en ammoniakk og alkoholfritt renere (se materialer liste) og varme til filmen er litt smeltet på glass (topp bilde i figur 1A). Smelte laboratorium film, brukes kanten av en varme blokk sett til 70 ° C eller smelte lett over varme.
    4. Forberede agarose løsning ved å blande ~0.075 g agarose (se materialer liste) i 5 mL av media i en liten bolle. Varme løsningen i mikrobølgeovn med periodiske virvlende bland til agarose er oppløst og løsningen er klart. Holde agarose løsningen på 55-70 ° C og bruk for bygging av flere agarose pads innen 48 timer.
    5. Pipetter mediet som inneholder 1.2-1,5% agarose i sentrum av pakningen.
      Merk: Volumet av media er vanligvis 50-60 µL men varierer basert på pakningen størrelse. Legger til medier i et kaldt lysbilde kan føre agarose å stivne for fort, bør dermed lysbildet holdes på en varm overflate. Kanten av en varme blokk satt til 70 ° C fungerer godt. Vann agarose eller bufret agarose løsninger som fosfat bufret saltvann (PBS) kan brukes i stedet for mediet som inneholder agarose for programmer som fortsatt cellevekst ikke er nødvendig. For imaging uttømming stammer induser kan presentere eller mangler i media. Tilstedeværelsen av induser kan brukes som en kontroll mens fravær av induser vil avdekke uttømming fenotypen.
    6. Plass en dekkglassvæske over pakningen å jevnt distribuere agarose.
    7. Plasser lysbildet på en kjølig og plan overflate å stivne for ~ 2 min. unngå uttørring av agarose puten som dette vil resultere i en rynkete overflate agarose pad og sammenslåing av cellen suspensjon når overflaten.
    8. Forsiktig skyve dekkglassvæske av agarose puten.
      Forsiktig: Ikke rush dette trinnet. Agarose puten kan lett rive og en ujevn agarose pad kan gjøre imaging vanskelig.
    9. La agarose pad til luft tørr i 1-2 min ved romtemperatur til overflaten av puten vises tørr. Bruker en skalpell, fjerne en liten stripe av agarose opprette en luftlomme (midterste bildet figur 1A); air lommen er vanligvis ~ 2 x 7-10 mm og A. tumefaciens celler pleier å vokser best i nærheten luftlomme (figur 1 c).
      Merk: For imaging fast celler eller under forhold der vekst ikke er overvåket, en luftlomme er ikke nødvendig.
    10. Spot 0,8-1 µL av celler på agarose pad og dekk med en ny dekkglassvæske. Forsiktig plassere dekkglassvæske over toppen av agarose pad å distribuere cellene over overflaten på agarose puten.
    11. Forsegle kantene på dekkglassvæske med smeltet VALAP (se Materialer tabell for oppskrift; Figur 1A, nederste bilde). Forsegle langs alle kanter og hjørner av dekkglassvæske kan føre til tørking av agarose pad, som vil føre til drivende celler under bildebehandling. Merk: Tetting av dekkglassvæske er bare nødvendig for langsiktig tidsinnstilt bildebehandling.

Figure 1
Figur 1: Agarose pad forberedelse. (A) bildet sekvens av agarose pad forberedelse protokollen. Bilde 1 er et lysbilde med laboratoriet filmen pakningen. I bildet 2 er agarose puten og luftlomme visualisert. Endelig bilde 3 viser komplett agarose pad med celler under en coverglass og forseglet med VALAP. (B) en skjematisk av en agarose pad for time-lapse mikroskopi er gitt. Nøkkel vise egenskaper av agarose pad er merket på skjematisk. (C) luftlomme forfremmet veksten av A. tumefaciens på agarose pads. Bilder av wildtype A. tumefaciens celler dyrket på en agarose pad i 20 timer vises. Bildene ble tatt på posisjoner stadig fjernt fra air lommen. Avstanden fra nærmeste kanten av bildet til luftlomme vises over hvert bilde. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Bildebehandling
    Merk: Differensiell forstyrrelser kontrast, kontrast og epifluorescence imaging utføres med en invertert mikroskop utstyrt med maskinvarebasert autofokus, et automatisert Stadium, standardfiltre, en LED-lyskilde, 60 X oljeneddyp mål (1,4 NA) for kontrast eller differensiell forstyrrelser kontrast (DIC), og en 1K elektron-multiplisere kostnad-sammen-enhet (EMCCD) kameraet. Mikroskopet skal plasseres i et temperaturkontrollerte rom. Alternativt kan en scenen varmere eller kammer brukes til å opprettholde konsekvent temperaturer under bildebehandling.
    1. Epifluorescence mikroskopi
      Merk: For fluorescens avbildning av levende celler er det nødvendig å begrense antall bilde oppkjøp og optimalisere eksponeringstid å minimere photobleaching og Phototoksisitet. For bildebehandling hver fargestoff anbefales det å finne en optimal eksponering som inneholder tilstrekkelig fluorescens oppdaging, men ikke føre til photobleaching eller Phototoksisitet. I tallene 2-4, ble eksponeringstider på 200 ms brukt for alle fluorescens bilder. For time-lapse sekvensene vises i Figur 3, ble bildene anskaffet hvert 10 min 3 h.
      1. Plasser neddyppingsolje på ønsket målet, og plasser invertert lysbildet i lysbildeholderen på scenen. Bruk fokus knotter for å bringe cellene i fokus.
      2. Få bilder i fase (eller DIC) og ønsket fluorescens filteret.
        Merk: Maksimal eksitasjon og utslipp bølgelengdene for flekker i figur 2og Figur 3 Figur 4 er som følger: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Time-lapse mikroskopi
      Merk: Under time-lapse mikroskopi følgende funksjoner er datastyrte: x, y og z posisjon, skodder og fluorescens filtre. En maskinvarebasert autofokus er optimalt å opprettholde fokus under tidsinnstilt bildebehandling. Alternativt kan en software-basert auto-fokus loop brukes.
      1. Plasser neddyppingsolje på ønsket målet, og plasser invertert lysbildet i lysbildeholderen på scenen. Bruk fokus knotter for å bringe cellene i fokus.
      2. Valgfritt: Skaffe flere (x, y) posisjoner. Tilfeldig velge 10 felt av celler i nærheten air lommen agarose pads.
      3. Oppsettet tid sekvens oppkjøpet bildet i fase eller DIC på det ønskede tidsintervallet.
        Merk: For time-lapse rekkefølgen vist i Figur 4, DIC bildene ble anskaffet med 30 ms eksponering hvert 10 min 14 h. Når du bruker fluorescens imaging under time-lapse mikroskopi, justere oppkjøpet intervall og eksponering tid å minimere photobleaching og Phototoksisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mål-spesifikke merking av wildtype A. tumefaciens celler
For å illustrere at celle morfologi er ikke påvirket av vask trinn eller behandling med 1% DMSO (som brukes til å fortynne de fluorescerende fargestoffer), celler ble fotografert direkte fra kultur (figur 2A, venstre panel), etter vask cellene av sentrifugering som beskrevet i 1.2 (figur 2A, venstre) eller etter rugende cellene med 1% DMSO på 10 min og vask cellene (figur 2A, høyre panel). Disse bildene illustrerer at morfologi ikke påvirkes av vask eller tilstedeværelse av DMSO. I tillegg er cellevekst ikke påvirket av vask eller DMSO behandling basert på vekst kurve analyse (data ikke vist). I tillegg bestemmer A. tumefaciens med iskald etanol fører ikke til brutto endringer i morfologi (figur 2A, høyre panel).

Deretter ble målet spesifikke fargestoffer brukt til å observere cellevegg biogenesis membran domener og DNA i wildtype A. tumefaciens celler. Mønstre av nye Peptidoglykan innsetting ble observert etter merking med tre fluorescerende-d-aminosyrer: HADA (finne 2B, etterlatt panelet), NADA (figur 2B, omslaget) og TADA (figur 2C, høyre panel). Alle tre merking eksperimenter anriket nye Peptidoglykan merkingsteknikker på vekst stang eller septum cellene. Disse vekst mønstrene var konsekvent observert med alle tre FDAAs, som indikerer at FDAA utvalget kan endres for å aktivere doble merking med andre flekker eller celler som uttrykker fluorescently merket proteiner. Lipofile fargestoff 4-64 etiketter fortrinnsvis gamle pole regionen A. tumefaciens celler som resulterer i et karakteristisk hestesko mønster (figur 2C). Både oransje (figur 2D, venstre panel) og DAPI (figur 2D, høyre panel) etiketten DNA i live A. tumefaciens celler. I slutten pre-divisional celler, to forskjellige nucleoids er observert med oransje flekker, mens DNA merking vises mer diffus med DAPI flekker (figur 2D) samsvarer med eksperimenter resultater observert i E. coli10.

Hensiktsmessigheten av DNA fargestoffer for time-lapse mikroskopi
For å finne ut om DAPI eller oransje er egnet for tidsinnstilt bildebehandling i nucleoid morfologi under cellevekst, ble en lik andel av umerkede, DAPI-merket og Orange-merket wildtype A. tumefaciens celler blandet og oppdaget på agarose pads. Gangen 0 første bildene ble tatt med kontrast, DAPI og TRITC filtre som bestemmer om hver celle var merket. Cellen blandinger ble deretter fotografert under tre ulike forhold: (1) fase kontrast mikroskopi bare, (2) fase kontrast og epifluorescence mikroskopi bruker den TRITC filter og (3) fase kontrast og epifluorescence mikroskopi ved hjelp av DAPI-filteret. Bildene ble anskaffet 10 minutter i 3 timer. Alle celler vokste godt uansett fluorescerende flekken når fotografert med fase kontrast mikroskopi indikerer at verken oransje eller DAPI flekker svekke cellevekst (Figur 3toppanelet). Alle celler vokste også bra når fotografert av fase mikroskopi og epifluorescence mikroskopi ved hjelp av TRITC filteret (Figur 3midtre panel). Den oransje etiketten kan photobleaching men kan observeres minst 2 h (13 totalt eksponeringer av 200 ms), som angir egnetheten av dette fargestoffet for kortsiktige mikroskopi levende celler. Uansett merking, alle celler slutte å vokse i en time når fotografert av fase mikroskopi og epifluorescence mikroskopi ved hjelp av DAPI filteret (Figur 3nedre panelet). Denne observasjonen viser at A. tumefaciens er følsom for UV-stråling og angir at fargestoffer krever en UV-filter for bildebehandling bør unngås for time-lapse mikroskopi eksperimenter.

Tidsinnstilt bildebehandling og mål-spesifikke merking av en A. tumefaciens uttømming belastning
Både mette transposon mutagenese39 og unnlater å konstruere en sletting belastningen18,40 indikerer at master regulator protein, CtrA, er avgjørende i A. tumefaciens. For å demonstrere verdien av mikroskopisk analyse av uttømming stammer, ble en tidligere beskrevet ctrA uttømming belastningen18 utsatt for karakterisering av mikroskopi. I figur 4A, time-lapse mikroskopi ble brukt til å sammenligne veksten av ctrA uttømming celler i som ctrA uttrykk ble indusert (øverst) og uninduced (nederst). I nærvær av CtrA ga en enkeltcelle opphav til en microcolony innen 14 h. I kontrast, når CtrA var oppbrukt, enten lysed eller kunne dele. Celler som kunne dele utstilt brutto morfologiske endringer inkludert avrunding fra midten av cellen og celle polakkene. Disse observasjonene foreslår at CtrA har en viktig funksjon i regulering av cellen divisjon.

I figur 4BD, ble fluorescerende fargestoffer brukt til å beskrive ctrA uttømming belastningen etter induksjon eller nedbryting av ctrA for 10 h. cellene var puls merket med NADA i 2 minutter (figur 4B). Da CtrA var tilstede (topp panel), polar Peptidoglykan biosyntesen ble observert. I kontrast, omfattende NADA merking skjedde i polakkene og store midten av cellen swellings oppstod da CtrA var oppbrukt. Denne observasjonen er konsistent med fortsatt Peptidoglykan syntese tross en svikt i cellene å dele. Cyanine DNA fargestoff Orange ble brukt til å beskrive DNA distribusjon i ctrA uttømming belastningen (figur 4C). Da CtrA var til stede, voksende cellene hadde en jevn distribusjon av DNA og segregering av nucleoids var tydelig i en sen pre-divisional celle; i kontrast, når CtrA var oppbrukt, var DNA ujevnt fordelt hele celler. Disse observasjonene foreslår at CtrA bidrar til riktig utryddelse eller raseskille. Endelig ble ctrA uttømming celler merket med 4-64 (Figur 4 d). I nærvær av CtrA, ble cellemembranen merket med en karakteristisk hestesko mønster der vekst pole var fri for flekker. I celler utarmet av CtrA, syntes 4-64 å merke hele membranen, selv om en Pol var mer intenst farget. Denne observasjonen antyder at membraner beholdes selv om lipid microdomain organisasjonen kan bli avbrutt når CtrA er oppbrukt.

Figure 2
Figur 2: Representant bilder av wildtype Agrobacterium tumefaciens celler merket med målet spesifikke fargestoffer. (A) fase kontrast bilder av A. tumefaciens celler før og etter vask protokollen, når behandlet med 1% DMSO eller etter fiksering med iskald etanol. (B) Polar veksten av A. tumefaciens celler vises ved merking med fluorescerende d-amino syrer HADA, NADA og TADA. (C) Beising av A. tumefaciens med lipofile 4-64 flekken. (D) Beising A. tumefaciens celler med DNA-spesifikke fargestoffer Orange og DAPI. For paneler B-D vises kontrast (øverst) og epifluorescence (nederst) bilder. Cellen skisserer finnes i fluorescens bilder for referanse. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av DAPI og oransje merking av DNA i live A. tumefaciens celler. Lik andelen umerket, DAPI-merket og Orange wildtype A. tumefaciens celler ble blandet og oppdaget på agarose pads. Gangen 0 første bildene ble tatt med kontrast, TRITC og DAPI filtre som bestemmer om cellene var merket. (A) Time-lapse umerket, DAPI-merket og Orange celler fotografert av fase kontrast mikroskopi. (B) Time-lapse umerket, DAPI-merket og Orange celler fotografert av fase mikroskopi og epifluorescence mikroskopi ved hjelp av TRITC-filteret. (C) Time-lapse umerket, DAPI-merket og Orange celler fotografert av fase mikroskopi og epifluorescence mikroskopi ved hjelp av DAPI-filteret. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representant bilder av ctrA uttømming belastningen i indusert og uninduced. (A) Time-lapse mikroskopi av ctrA uttømming belastningen under forhold der ctrA ble indusert (øverst) eller oppbrukt (nederst). Tallene ovenfor hvert panel angir tiden i timer. (B) fase kontrast (venstre) og epifluorescence (høyre) bilder av celler merket med NADA. (C) fase kontrast (venstre) og fluorescens (høyre) bilder av celler merket med oransje. (D) fase kontrast (venstre) og fluorescens (høyre) bilder av celler merket med 4-64. Cellen skisserer ble gitt i fluorescens bilder for referanse. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen inneholder en rekke prosedyrer for etterforskningen av A. tumefaciens wildtype mutant og uttømming stammer. Det er verdt å merke seg at alle prosedyrene i delen protokollen kan lett tilpasset andre bakterielle stammer med ytterligere modifiseringer å ta hensyn til vekst medier, temperaturer og vekst.

Bruk av mål-spesifikke fargestoffer er et verdifullt verktøy for å gi en detaljert karakterisering av cellen syklus hendelser i bakterielle celler. Her Peptidoglykan innsetting mønstre ble observert med fluorescerende-d-aminosyrer, lipid domener ble visualisert med 4-64, og nucleoids ble merket med enten DAPI eller oransje. Hver av protokollene kan tilpasses for bruk i andre bakterier etter optimalisere vask protokollen og sikre at DMSO behandling ikke svekke vekst eller morfologi. Nøkkelfaktorer omfatter valg av en buffer for vask trinn, inkubasjon ganger for etiketten innlemmelse og valg av en passende fluorophore å unngå auto-fluorescens eller aktivere multiplex merking studier. Et alternativ til lipofile rød-fluorescerende membran flekken (4-64) er for eksempel grønne-fluorescerende membran flekken (1-43). Tilsvarende blå, grønn og rød-fluorescerende-d-aminosyrer er tilgjengelig6,38 og d-aminosyrer med biorthogonal håndtak kan være konjugert til vanlige fluorophores til Klikk kjemi6,7. Til slutt, i tillegg til oransje-fluorescerende cyanine DNA fargestoff, en grønn fluorescerende cyanine DNA fargestoff finnes og virker bra med live bakterieceller10. Visualisering av nøkkelcellen strukturer merket med mål-spesifikke fargestoffer kan kombineres med observasjon av fluorescerende proteiner å få mekanistisk innsikt i viktige prosesser i bakterier.

Disse protokollene ta vilkår nødvendige for mikroskopiske observasjon av A. tumefaciens uttømming flekker og det bør være mulig å utvide disse tilnærminger til protein uttømming stammer i andre bakterier. Karakterisering av uttømming stammer kan være spesielt utfordrende som det er en begrenset tidsramme å fullføre undersøkelser før cellene slutte å vokse eller lyse. Det er viktig å vaske tilstrekkelig cellene for å fjerne alle spor av overflødig fargestoff under merking; men har noen celler utarmet av essensielle proteiner feil i deres cellen flater som kan føre dem til å være følsom å vaske trinnene. Øke Start volumet av cellekulturer kan bidra til å kompensere for tap av celler under vask trinnene. Uttømming stammer som har svekket cellemembraner eller cellevegger kan være utsatt for celle lysis når dyrket i flytende kultur uten induser. Inkludering av en osmoprotectant (5% sukrose fungerer godt for A. tumefaciens) kan bidra til å opprettholde celle morfologi og holdt cellen lysis uttømming. Det er nødvendig å bestemme riktig mengde tid til pre deplete cellene før farging med fluorescerende farge empirisk. Celler med permeablized membraner eller cellevegger kan være utsatt for celle lyse eller ikke-selektive merking med fluorescerende reagenser gjør imaging sen uttømming tidspunkt spesielt utfordrende.

Et kritisk punkt for time-lapse mikroskopi A. tumefaciens (eller andre bakterielle celler) er utarbeidelsen av agarose puten. Agarose pad må være å sikre god fokus hele time-lapse mikroskopi eksperimenter. I tillegg må til dekkglassvæske være helt forseglet for å unngå agarose pad tørking og endre fokalplanet. A. tumefacienser oksygen nødvendig for cellevekst. Bildebehandling nær en luftlomme er nødvendig å få robust vekst av A. tumefaciens under lange time-lapse mikroskopi eksperimenter (figur 1 c). Hvis celler ikke vokse eller slutte å vokse etter bare noen få timer, er det tilrådelig å forberede en agarose pad med en større luftlomme og nær luftlommer. Enda en godt konstruert agarose blokk med en skikkelig luftlomme kan bare støtte A. tumefaciens vekst for maksimalt ~ 24 h. Hvis lenger time-lapse sekvenser nødvendig, tilnærminger alternative som anses som microfluidics eller flyt. Hvis cellene drive ut under bildebehandling, sikre at agarose pad er nivå og riktig forseglet under dekkglassvæske. Merk at selv med en nær perfekt agarose pad, er det mulig at noen celler vil drive ut av fokus, dermed tenkelig flere felt og hyppige refocusing anbefales sterkt. For andre bakterier, bør alternative tilnærminger forberede agarose pads vurderes41,42,43 til best oppfyller vekst for bakterien. Agarose pads er også nyttige for immobilizing celler under bildebehandling merket eller fast celler når time-lapse ikke er nødvendig. I dette tilfellet tetting av dekkglassvæske er ikke nødvendig og alternative tilnærminger for å konstruere agarose pads som kan lagres til senere kan være riktig43.

Generelt kan bruk av mål-spesifikke fargestoffer og time-lapse mikroskopi gi innsikt om grunnleggende prosesser i bakterier. Her viser vi vanlige hestesko mønster av merking med lipofile 4-64 fargestoff og karakteristiske polar og septal merkingen med fluorescerende-d-aminosyrer i A. tumefaciens. Observasjoner av disse mønstrene i A. tumefaciens er forenlig med polar veksten av denne bakterien44 er det sannsynlig at lignende studier kan avsløre informasjon om vekst mønstre i andre bakterier. Funn at cyanine fargestoffer som oransje er egnet for time-lapse mikroskopi studier10 (Figur 3) vil aktivere forsiktig studier av nucleoid morfologi under cellevekst i wildtype og mutant stammer. Imaging fluorescerende mål-spesifikke fargestoffer under uttømming av en viktig protein kan gi viktige observasjoner for å bestemme funksjonen av protein. Til slutt, siden mange av disse fargestoffer er tilgjengelig med forskjellige spectral egenskaper, studier med flere etiketter samtidig bør aktivere innsikt i koordineringen av viktige prosesser i cellen syklus progresjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Michael VanNieuwenhze (Indiana University) for gave FDAAs brukes i figur 2 og Figur 4. Vi takker medlemmer av brun laboratoriet for tilbakemelding under utarbeidelsen av dette manuskriptet. Forskning i brun lab på A. tumefaciens cellevekst og deling er støttet av National Science Foundation (IOS1557806).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Tags

Mikrobiologi problemet 129 Agrobacterium essentiality time-lapse mikroskopi agarose pads fluorescerende d-aminosyrer DNA flekker membran flekker epifluorescence mikroskopi
Live celle fluorescens mikroskopi å observere viktige prosesser under mikrobiell cellevekst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. … More

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. J. B. Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth. J. Vis. Exp. (129), e56497, doi:10.3791/56497 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter