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Biology

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Abstract

Zelluläre Kernprozesse wie DNA-Replikation und Segregation, Proteinsynthese, Zellwand-Biosynthese und Zellteilung verlassen sich auf die Funktion von Proteinen, die bakterielle überlebenswichtig sind. Eine Reihe von Farbstoffen gezielt kann verwendet werden, da diese Prozesse Sonden, um besser zu verstehen. Färbung mit lipophilen Farbstoffen ermöglicht die Beobachtung der Membran-Struktur, Visualisierung von Lipid Microdomains und Erkennung von Membran Blebs. Einsatz von Leuchtstoff-d-Aminosäuren (FDAAs), die Standorte der Peptidoglycan Biosynthese Sonde kann mögliche Mängel in Zellwand Biogenese oder Zelle Wachstum Musterung angeben. Nukleinsäure-Flecken können schließlich mögliche Defekte im DNA-Replikation oder Chromosom Segregation angeben. Cyanin DNA Flecken Label lebende Zellen und eignen sich für Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen der Nucleoid Morphologie beim Zellwachstum. Protokolle für die Zelle Kennzeichnung können auf Protein Erschöpfung Mutanten, defekte Membran-Struktur, Zellwand Biogenese oder Chromosom Abtrennung zu identifizieren angewendet werden. Darüber hinaus kann Zeitraffer-Mikroskopie, morphologische Veränderungen zu überwachen, wie ein essentielles Protein entfernt und zusätzliche in Proteinfunktion Einblicke kann verwendet werden. Beispielsweise führt die Erschöpfung der wesentlichen Zellteilung Proteine Filamentierung oder Verzweigungen, die Erschöpfung der Zelle Wachstum Proteine Zellen kürzer oder runder werden verursachen. Hier sind Protokolle für Zellwachstum, Target-spezifische Kennzeichnung und Zeitraffer Mikroskopie bakterielle Pflanzen Pathogen Agrobacterium Tumefaciensvorgesehen. Zusammen ermöglichen gezielt Farbstoffe und Zeitraffer Mikroskopie Charakterisierung der wesentlichen Prozesse in A. Tumefaciens. Schließlich können die Protokolle zur Verfügung gestellt leicht geändert werden, um wichtige Prozesse in anderen Bakterien zu untersuchen.

Introduction

Fortschreiten durch die bakterielle Zelle Zyklus erfordert die Koordination vieler Prozesse einschließlich der Membran und Zellwand Biosynthese, DNA-Replikation und Segregation und Zellteilung. Um die Komplexität der bakteriellen Zelle Biologie zu verstehen, ist es notwendig, diese wesentliche Ereignisse zu studieren; Dies ist jedoch eine nicht-triviale Aufgabe, da Zellviabilität gefährdet ist, wenn wichtige Komponenten dieser Wege mutagenisierter werden. Epifluoreszenz Mikroskopie gepaart mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe ist ein leistungsfähiger Ansatz, diese wesentlichen Prozesse in Wildtyp und Mutanten Bakterienstämme zu erforschen.

Peptidoglycan-spezifische Farbstoffe enthalten fluoreszierende Antibiotika (Vancomycin-FL, Bocillin-FL) und Leuchtstoff-d-Aminosäuren (z. B. 7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic Acid-3-amino-d-Alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-Alanin , NADA; Tetramethylrhodamine-3-amino-d-Alanin; TADA). In grampositiven Bakterien wurde die Verwendung von subletalen Konzentrationen von fluoreszierenden Antibiotika Analoga auf Seiten der Peptidoglycan Biosynthese Sonde eine wirksame Strategie zur Peptidoglycan einfügen Muster1,2zu offenbaren, 3,4. Während fluoreszierende Vancomycin Kennzeichnung verwendet wurde, um Einblicke in die Peptidoglycan einfügen Muster in festen Gram-negativen Bakterien5, bietet die äußere Membran in der Regel eine Durchlässigkeit Barriere, die verhindert, die Verwendung von Leuchtstofflampen dass Antibiotika als Sonde für Peptidoglycan Biosynthese in lebenden Zellen. Im Gegensatz dazu beschriften kurze Pulse von Leuchtstoff-d-Aminosäuren oder d-Aminosäuren mit Biorthogonal funktionellen Gruppen kovalent Regionen der jüngsten Peptidoglycan Insertion in einer Vielzahl von lebendigen Bakterienzellen6,7. Muster der Peptidoglycan Einfügung, die mit synthetischen d-Aminosäuren beobachtet gehören punctata und septal (Escherichia coli und Bacillus Subtilis), polar und septal (Agrobacterium Tumefaciens und Listeria Monocytogenes), septal nur (Staphylococcus Aureus) und apikal (Streptomyces Venezuelae)6,7. Diese Beobachtungen zeigen, dass Bakterien unterschiedliche Muster der Zellwand Biogenese weisen und die Verwendung von synthetischen d-Aminosäuren als Sonden für die Prüfung Wachstum Musterung eine sinnvolle Strategie in vielen Bakterien ist.

Farbstoffe, die bakterielle Chromosomen beschriften gehören der Desoxyribonukleinsäure (DNA) bestimmte kleinere Groove Binder (4,6-Diamidino-2-Phenylindole; DAPI) und hohe Affinität Cyanin-Farbstoffe (grün und Orange; siehe Materialliste). DAPI-Färbung der fixen Zellen hilft bei der Aufzählung der Bakterien aus Umweltproben8, wogegen DAPI-Färbung von lebenden Zellen verwendet wird, um bakterielle Lebensfähigkeit9anzugeben. Im Gegensatz dazu Farbstoffe Cyanin wie Orange und grün sind häufig beschrieben, wie impermeant "tote" Zelle Membrane Flecken, nicht lebensfähige Zellen9aufzulisten. Bemerkenswert ist, wenn diese Reagenzien verwendet werden, um die Morphologie der bakterielle Nucleoid während Zellwachstum Sonde, DAPI, Orange und grün alle erwiesen sich Membran permeationsfähigen und in der Lage, Kennzeichnung von lebenden Zellen10. In E. Coli Zellen Leben, DAPI-Färbung der DNA erscheint diffus durch Auto-Fluoreszenz von Zytoplasma und wiederholte Exposition des DAPI-gefärbten Zellen auf ultraviolettes (UV) Licht stört die Nucleoid Struktur10. Färbung E. Coli oder B. Subtilis mit Orange enthüllt, dass dieser Farbstoff Membran permeationsfähigen und lang anhaltende Fluoreszenz auf Bindung an DNA in lebenden Zellen bietet ohne Beeinträchtigung der Zelle Wachstum, DNA-Replikation oder Chromosom Abtrennung10 . Diese Beobachtungen legen nahe, dass Cyanin DNA-Farbstoffe verwendet werden können, um die Morphologie des ausgedehnt beim Zellwachstum in vielen Bakterien zu überwachen.

Phospholipid-specific Stryl Farbstoffe wie z. B. N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridiniumdichromat Dibromide (4-64; siehe Materialliste) sind kationische Verbindungen und ordnen Sie bevorzugt negativ geladen Phospholipide wie Cardiolipin und Phosphatidylglycerol11. Verschiedene Muster werden beobachtet, wenn 4-64 verwendet wird, um die Membran von verschiedenen Bakterien zu beschriften. In Escherichia coli4-64 ist in Polen, in Bändern entlang der Seitenwand angereichert und in den Geschäftsbereich des späten pre-divisional12Zellen. In Bacillus Subtilisermöglicht 4-64 Kennzeichnung die Visualisierung der Lipid Spiralen13. In Agrobacterium Tumefaciens4-64 Etiketten die äußere Membran und ist in einem charakteristischen "Hufeisen"-Muster, in der die Wachstumspol ist frei von14,15Kennzeichnung, beobachtet. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass diese Bakterien heterogene Lipid-Distributionen aufgrund des Vorhandenseins von Lipid-Domains zeigen die zellulare Asymmetrie beitragen. Änderungen 4-64 Kennzeichnung Muster wie zum Beispiel das Vorhandensein von diffusen Kennzeichnung kann Blebs oder Vesikel, Invaginations oder Membran Schrumpfung informativ sein bei der Charakterisierung von Mutanten, die Einfluss auf die Verteilung oder die Biosynthese von Lipiden.

Hinausgeht, Färbung Zellen, ist bestimmen die Funktion von Proteinen, die Teilnahme an essentielle Prozesse erforderlich. Die Charakterisierung der wesentlichen Proteine ist technisch anspruchsvoll, denn es nicht möglich ist, löschen Sie wesentlichen Gene und die phänotypischen Auswirkungen zu studieren. So entstanden alternative Ansätze, die zu einem des Proteins Abbau. Beispielsweise kann ein wesentliches gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoter, anstatt seine native Veranstalter gestellt werden. Induzierbare Promotoren sind empfänglich für kleine Moleküle wie z. B.; Zink-16, Isopropyl β-d-1-Thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, Arabinose22, vanillate17,23, und Xylose23, damit die Transkription des Zielgens aufhört und das Protein des Interesses ist leer, wenn der Induktor entfernt wird. Alternative Ansätze für abbauende wesentlich interessierenden Proteine enthalten synthetische Riboschalter24 welche kleine Molekül-RNA Interaktionen verwenden, um die Transkription von Zielgenen, CRISPR Einmischung25,26 behindern , Block-Transkription von Zielgenen und induzierbaren Protein Degradation27,28 die Peptid-Tags Zielproteine für den Abbau von ClpXP Protease verwendet. Erschöpfung Stämme bieten nur kurze Zeit für die Charakterisierung, bevor die Zellen Lebensfähigkeit verlieren, daher mikroskopische Bildgebung von Zellen im Laufe der Zeit während der Protein-Abbau ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Charakterisierung. In der Tat ermöglichte Mikroskopie lebender bakterielle Zellen Forscher Einblicke in grundlegende biologische Prozesse, einschließlich der Mechanismen der Zelle Form Wartung, Sekretion und Abschottung29.

A. Tumefaciens ist eine bakterielle Pflanzen Pathogen30 und natürlichen genetischen Ingenieur31,32. Also, auch Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenität, Wirt-Pathogen Interaktionen33,34,35, Sekretion36und Host Transformation30,31, 37 ausgiebig untersucht. Um Strategien zu entwerfen, die A. Tumefaciens vermittelten Krankheiten vorbeugen oder verbessern Pflanzentransformation, A. Tumefaciens überlebensnotwendig Prozesse besser verstanden werden müssen. Die Verwendung von Farbstoffen gezielt und die jüngste Entwicklung einer Protein-Abbau-Strategie für A. Tumefaciens18 bietet eine Möglichkeit, wichtige Prozesse zu untersuchen.

Hier werden ausführliche Protokolle für die mikroskopische Analyse der Wildtyp und Mutanten Protein Erschöpfung Stämme von A. Tumefaciens bereitgestellt. Die ersten beiden Protokolle wird beschrieben, wie Zellen vorbereiten und beschriften Sie sie mit gezielt Farbstoffe. Das dritte Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Zubereitung von Agarose-Pads (Abbildung 1) und imaging die Bakterienzellen (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4). Diese Protokolle möglicherweise auch geeignet für andere Bakterien mit zusätzlichen Anpassungen an verschiedene Medien Bedingungen, Wachstumsraten, Sauerstoff-Anforderungen und Zellstrukturen zu berücksichtigen.

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Protocol

1. Wachstum von A. Tumefaciens Stämme

  1. Kultivierung von A. Tumefaciens Stämme
    1. Verwenden Sie einen sterilen Holzen Stick oder Pipettieren Tipp impfen 1 mL ATGN Wachstumsmedien (siehe Materialliste für das Rezept) mit einer einzigen Kolonie der gewünschten Sorte.
      Hinweis: Für A. Tumefaciens Erschöpfung Stämme, sollte die ATGN 1 mM IPTG wie ein Induktor weiterhin Biosynthese von essentielles Protein enthalten.
    2. A. Tumefaciens Stämme über Nacht in ATGN bei 28 ° C mit Schütteln bei 225 u/min zu wachsen.
    3. Messung die optische Dichte der Zellen bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zellkultur auf einer OD600 = ~0.2 und weiter wachsen bis OD600 = ~0.6 erreicht ist. Für Erschöpfung Stämme weiter wachsen mit Induktor bis OD600 = ~0.6 erreicht ist.
    4. Verwenden Sie Wildtyp und Mutanten Stämme von A. Tumefaciens OD600 = ~0.6 für Target-spezifische Färbung und/oder Zeitraffer Mikroskopie (siehe § § 2 und 3.1). Für Erschöpfung Stämme Auswaschen der Induktor (siehe Abschnitt 1.2.)
  2. Entfernung der Induktor zur Charakterisierung von A. Tumefaciens Protein Erschöpfung Stämme
    1. Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge bei Raumtemperatur.
    2. Zum Waschen entfernen überstand und das Pellet in frische Medien ohne Induktor Aufschwemmen und pellet die Zellen wie oben (1.2.1) beschrieben. Waschen Sie den Zellen insgesamt 3 Mal in den neuen Medien.
    3. Aufschwemmen der letzten Pellet in frische Medien und konzentrieren sich die Zellen eines OD600 = ~0.8 für sofortige Färbung mit Ziel bestimmte Farbstoffe (Abschnitt 2 und Abbildung 4 b-D) oder Time-Lapse-Mikroskopie (Abschnitt 3.2 und Abbildung 4a).) . Alternativ vorab zum Abbau der Zellen für die gewünschte Menge an Zeit durch den Anbau von der Zellen in den Medien ohne Induktor vor Fleckenbildung und Bildgebung der Zellen.

(2) Target-spezifische Färbung von A. Tumefaciens Zellen

  1. Fluoreszierende d-amino Acid Zellwand Kennzeichnung
    Hinweis: FDAAs sind ungiftig fluoreszierende d-Aminosäuren die ohne weiteres in die A. Tumefaciens Peptidoglycan integriert sind. Dieses einfache Kennzeichnung Verfahren Sonden Wachstum in lebenden Zellen6Musterung. Protokolle für die Synthese von vier FDAAs sind verfügbar38.
    1. Pellet-500 µL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 100 µL der neuen Medien.
    2. Fügen Sie 5 µL 5 mM FDAA, gewaschen und Zellen konzentriert und 2 min im Dunkeln inkubieren.
      Hinweis: Maximal FDAA Lichteinwirkung. Die Zeit der Inkubation wird die Wachstumsrate der Belastung abhängig. In der Regel sollte die Inkubationszeiten zwischen 5-10 % der Verdoppelung Mal6.
    3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Zelle Pellets mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dreimal waschen.
    4. Aufschwemmen Sie Pellet in ~ 50 µL PBS.
      Hinweis: Die Lautstärke des PBS zur Wiederfreisetzung variieren basierend auf Pellet-Größe.
    5. Anwenden von 0,8-1 µL Zellen zu einer Agarose-Pad und Bild mit Epifluoreszenz Mikroskopie sofort (siehe Abschnitte 3.1 und 3.2).
      1. Alternativ weitere stoppen Sie Label Aufnahme durch die Fixierung der Zellen mit eiskalten 70 % Ethanol. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL eiskaltes 70 % Ethanol und 15 Minuten auf dem Eis inkubieren.
      2. Zellen durch Zentrifugation zu sammeln und in einem kleinen Volumen der PBS für die Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt erneut. Zellsuspensionen bei 4 ° C und Bild innerhalb von 48 Stunden zu speichern.
  2. DNA-Färbung mit DAPI oder Orange Fleck
    Hinweis: Um DNA zu beobachten Struktur, Zellen mit DAPI oder Orange (tote Zelle Fleck) gekennzeichnet sind. Obwohl klassisch als einen "Toten Zelle Fleck" beschrieben, ist Orange permeationsfähigen, photostabil, und hat keinen Einfluss auf das Wachstum von Bakterienzellen, ermöglicht live-Cell DNA imaging-10. In A. Tumefaciensorangefarbene Kennzeichnung Werke auch in lebenden Zellen und eignet sich für Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu, die ultraviolette (UV) Belichtung notwendig für bildgebende DAPI-gefärbten Zellen phototoxischen (Abbildung 3) und somit DAPI-Färbung eignet sich am besten zum Beizen von lebenden Zellen für sofortige imaging oder Färbung feste Zellen.
    1. DAPI-Färbung der Zellen
      1. Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge.
      2. Optional, um Zellen vor der Färbung zu beheben, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL eiskaltes Ethanol 70 %. Inkubation auf Eis für 10-15 min. sammeln die Zellen durch Zentrifugation als 2.2.1.1 beschrieben.
      3. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL PBS mit 1 µL der Stammlösung DAPI (1 mg/mL; siehe Materialtabelle). Mischen von pipettieren und 5 Minuten im Dunkeln inkubieren.
      4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min und in 1 mL PBS entfernen überschüssige DAPI aufzuwirbeln. Waschen der Zellen zwei weitere Male und das Pellet in 50 µL PBS oder Medien Aufschwemmen.
      5. Anwenden von 0,8-1 µL Zellen eine Agarose-Pad und Bild Epifluoreszenz Mikroskopie sofort verwenden. Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2.
        Hinweis: Dieses Protokoll ist nicht optimal für Zeitraffer-Mikroskopie, Chromosom Dynamik (Abbildung 3) zu beobachten. Erwägen Sie Orange Färbung als Alternative (siehe Abschnitt 2.2.2).
    2. Orange Färbung von lebenden Zellen
    3. Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge. Aufschwemmen Zelle Pellet in 1 mL PBS mit 1 µL Orange-Stammlösung (siehe Materialliste). Mischen von pipettieren und 5 min im Dunkeln inkubieren.
    4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Aufschwemmen in 1 mL PBS, überschüssige Orange zu entfernen. Waschen der Zellen zwei weitere Male und das Pellet in 50 µL PBS aufzuwirbeln.
    5. Anwenden von 0,8-1 µL Zellen eine Agarose-Pad und Bild Epifluoreszenz Mikroskopie sofort verwenden. Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2.
      Hinweis: Dieses Protokoll funktioniert gut mit lebenden Zellen und eignet sich für Zeitraffer-Mikroskopie, Chromosom Dynamik (Abbildung 3) zu beobachten. Wenn es nicht sofort Bild passt, können Zellen in eiskalte 70 % igem Ethanol (siehe Abschnitt 2.2.1.2) behoben werden.
  3. Membran zu beschriften
    Hinweis: Die lipophilen Styryl Fluoreszenzfarbstoff 4-64 ist beträchtlich, die Membran der Bakterienzellen beobachten benutzt worden. Im Gegensatz zu vielen Bakterien 4-64 mit der Bezeichnung A. Tumefaciens Zellen nicht einheitlich zu kennzeichnen, aber recht häufig ein "Hufeisen" Muster14,15aufweisen. Bemerkenswert ist die Wachstumspol fast frei von Flecken, während der alte Pol intensiv gekennzeichnet ist. Somit ermöglicht 4-64 Visualisierung der Zelle Wachstumsmuster und Membran-Struktur in A. Tumefaciens.
    1. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 8 µg/mL in 1 mL der exponentiellen Phase Zellkultur FM 4-64 und 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Pellet-markierte Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 Minuten in einer Desktop-Zentrifuge und Zelle Pellet in 1 mL PBS aufzuwirbeln. Waschen Sie den Zellen insgesamt dreimal, um überschüssige Farbe zu entfernen.
    3. Aufzuwirbeln Sie Zellen in einem kleinen Volumen der PBS und vor Ort auf eine Agarose-Pad, um sofort Bild. (Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2)
      Achtung: Zellen müssen sofort abgebildet werden, um charakteristische Kennzeichnung Muster zu beobachten.

3. Darstellung der A. Tumefaciens Zellen

  1. Agarose-Pad-Vorbereitung
    Hinweis: Abbildung 1 enthält eine Bildsequenz (zentrale A) und Schaltplan (Gruppe B) eines typischen Agarose-Pads für Zeitraffer-Mikroskopie vorbereitet. Agarose-Pads sind in der Regel bereit, je nach Bedarf.
    1. 3.1.1 verwenden Sie ein Deckglas als Wegweiser und Schnitt eine 22 x 22 mm Quadrat des Labors mit einem Skalpell an den Rändern film (siehe Materialliste).
    2. Schneiden Sie ein Quadrat aus dem Zentrum des Labor-Films verlassen ~ 2-5 mm Grenze als eine Dichtung für die Agarose-Pad zu dienen. Verwerfen Sie den Center-Ausschnitt.
    3. Legen Sie die Film-Dichtung auf einen Objektträger (75 mm x 25 mm) mit Ammoniak und Alkohol Reiniger (siehe Materialliste) gereinigt und erhitzen, bis der Film auf Glas (obere Bild in Abbildung 1A) leicht geschmolzen ist. Labor Film schmelzen, benutzen Sie den Rand von einem Block Heatset auf 70 ° C oder über einer Flamme leicht schmelzen.
    4. Bereiten Sie Agarose-Lösung durch Mischen ~0.075 g Agarose (siehe Materialliste) in 5 mL Medien in eine kleine Flasche. Erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle mit periodischen Wirbeln zu mischen, bis die Agarose aufgelöst wird und die Lösung klar ist. Halten Sie die Agarose-Lösung bei 55-70 ° C und für den Bau von mehreren Agarose-Pads innerhalb von 48 Stunden.
    5. Pipette Medien mit 1,2 – 1,5 % Agarose in der Mitte der Dichtung.
      Hinweis: Die Lautstärke der Medien ist in der Regel 50-60 µL aber variiert je nach Größe der Dichtung. Hinzufügen von Medien zu einer kalten Folie die Agarose, vorschnell zu verfestigen verursachen können, sollte daher die Folie auf eine warme Oberfläche gehalten werden. Der Rand von einem Heizblock auf 70 ° C arbeiten gut eingestellt. Wasser-Agarose oder gepufferten Agarose Lösungen wie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) können verwendet werden, anstelle von Medien, die Agarose für Anwendungen, in denen weitere Zellwachstum nicht erforderlich ist. Für imaging Erschöpfung Stämme, Induktor kann präsentieren oder abwesend in den Medien. Präsenz der Induktor kann als Kontrolle verwendet werden, während das Fehlen der Induktor den Erschöpfung Phänotyp offenbaren wird.
    6. Platzieren Sie ein Deckglas über die Dichtung um die Agarose gleichmäßig zu verteilen.
    7. Legen Sie die Folie auf einen kühlen Untergrund für ~ 2 min. vermeiden Übertrocknetes der Agarose Pad da dies eine runzlige Oberfläche auf die Agarose-Pad und Bündelung der Zellsuspension bei Anwendung auf der Oberfläche führt zu festigen.
    8. Schieben Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Agarose-Pad.
      Achtung: Dieser Schritt keine Eile. Die Agarose-Pad kann leicht reißen und eine ungleichmäßige Agarose-Pad kann Bildgebung erschweren.
    9. Lassen Sie die Agarose-Pad an der Luft trocknen für 1 – 2 min. bei Raumtemperatur bis die Oberfläche des Pads trocken erscheint. Mit einem Skalpell entfernen Sie einen schmaler Streifen der Agarose erstelle ich ein Luftpolster (mittlere Bild, Abbildung 1A); das Luftpolster ist in der Regel ~ 2 x 7-10 mm und A. Tumefaciens Zellen sind in der Regel wachsen am besten in der Nähe der Atemhöhle (Abbildung 1).
      Hinweis: Für die Bildgebung der fixen Zellen oder unter Bedingungen, wo Wachstum nicht überwacht wird, ist ein Luftpolster nicht erforderlich.
    10. Spot 0,8-1 µL Zellen auf die Agarose-Pad und mit einem neuen Deckgläschen abdecken. Legen Sie das Deckglas vorsichtig über den oberen Teil der Agarose-Pad auf die Oberfläche des Pads Agarose Zellen verteilt.
    11. Seal die Ränder der das Deckglas mit geschmolzenen VALAP (siehe Materialtabelle für Rezept; Abbildung 1A, Bild unten). Entlang der Kanten und Ecken von dem Deckglas versiegeln können fehlschlägt Trocknung von der Agarose-Pad, die zu das Auseinanderdriften der Zellen während der Bildgebung führen wird. Hinweis: Abdichtung von das Deckglas ist nur für die langfristige Zeitraffer Bildgebung erforderlich.

Figure 1
Abbildung 1: Agarose Pad Vorbereitung. (A) Bild-Sequenz des Protokolls Agarose Pad Vorbereitung. Bild 1 ist eine Folie mit der Labor-Film-Dichtung. In Abbildung 2 sind die Agarose-Pad und Atemhöhle visualisiert. Zu guter Letzt Bild 3 zeigt die komplette Agarose-Pad mit den Zellen unter einem Deckglas und mit VALAP versiegelt. (B) eine schematische Darstellung einer Agarose-Pad für Zeitraffer-Mikroskopie steht zur Verfügung. Hauptmerkmale des Agarose-Pads sind im Schaltplan gekennzeichnet. (C) die Atemhöhle förderte Wachstum von A. Tumefaciens auf Agarose-Pads. Gezeigt werden Bilder der Wildtyp A. Tumefaciens Zellen gewachsen auf einem Agarose-Pad für 20 Stunden. Bilder wurden an Positionen immer weit entfernt von der Atemhöhle. Die Entfernung von der nächsten Kante des Bildes in die Atemhöhle wird über jedes Bild angezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Bildgebung
    Hinweis: Differential Interferenz-Kontrast, Phasenkontrast und Epifluoreszenz Bildgebung erfolgt mit einem inversen Mikroskop mit Hardware-basierte Autofokus, 60 X Ölimmersion automatisierte frühzeitig, Standardfilter, eine LED-Lichtquelle ausgestattet Ziele (1,4 NA) für Phasenkontrast oder differential Interferenz-Kontrast (DIC), und ein 1K Elektron-Multiplikation-gepaart-Ladegerät (EMCCD) Kamera. Das Mikroskop sollte in einem klimatisierten Raum platziert werden. Alternativ kann eine Stufe wärmer oder Kammer weiterhin konsequente Temperaturen während der Aufnahme verwendet werden.
    1. Epifluoreszenz Mikroskopie
      Hinweis: Für die Fluoreszenz-Bildgebung von lebenden Zellen ist es notwendig, die Anzahl der Bild Akquisitionen und optimieren Sie die Belichtungszeit um Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren. Für die Darstellung von jeder Farbstoff empfiehlt es sich, eine optimale Belichtungszeit zu finden, die ausreichend Fluoreszenz-Detektion bietet aber führt nicht zur Immunofluoreszenz oder Phototoxizität. In den Abbildungen 2-4dienten alle Fluoreszenzbilder Belichtungszeiten von 200 ms. Für die Zeitraffer-Sequenzen in Abbildung 3dargestellt wurden die Bilder alle 10 min für 3 h erworben.
      1. Immersionsöl auf das angestrebte Ziel und legen Sie die invertierte Folie in den Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie die Fokussierung-Regler, um die Zellen in den Fokus zu bringen.
      2. Bilder in Phase (oder DIC) und den gewünschten Fluoreszenz-Filter zu erwerben.
        Hinweis: Die maximale Anregung und Emission Wellenlängen für die Flecken verwendet in Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4 sind wie folgt: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Zeitraffer-Mikroskopie
      Hinweis: Während der Time-Lapse-Mikroskopie die folgenden Features sind Computer gesteuert: x-, y- und Z-Position, Fensterläden und Fluoreszenz-Filter. Eine Hardware-basierte Autofokus-System ist optimal zu konzentrieren während der Time-Lapse Bildgebung. Alternativ kann eine Software-basierte Autofokus-Schleife verwendet werden.
      1. Immersionsöl auf das angestrebte Ziel und legen Sie die invertierte Folie in den Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie die Fokussierung-Regler, um die Zellen in den Fokus zu bringen.
      2. Optional: Erwerben mehrere (X, y) Positionen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Felder von Zellen in unmittelbarer Nähe der Atemhöhle der Agarose-Pads.
      3. Einrichtung der Sequenz Erwerb Bild in Phase oder DIC auf das gewünschte Zeitintervall.
        Hinweis: Für die Zeitraffer-Sequenz, die in Abbildung 4dargestellt, DIC-Bilder mit 30 ms Exposition alle 10 min für 14 h erworben wurden. Bei der Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebung im Zeitraffer Mikroskopie anpassen der Erfassungszeit Intervall und Belichtung, Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren.

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Representative Results

Target-spezifische Kennzeichnung der Wildtyp A. Tumefaciens Zellen
Um zu verdeutlichen, dass Zellmorphologie werden nicht beeinflusst durch das Waschen Stufen oder Behandlung mit 1 % DMSO (die verwendet wird, um die Fluoreszenz-Farbstoffen verdünnen), Zellen wurden direkt von Kultur (Abb. 2A, weit links), nach dem Waschen der Zellen durch abgebildet Zentrifugation wie beschrieben in 1.2 (Abb. 2A, linken) oder nach der Inkubation der Zellen mit 1 % DMSO für 10 min und das Waschen der Zellen (Abb. 2A, rechts). Diese Bilder zeigen, dass Morphologie durch Waschen oder das Vorhandensein von DMSO nicht beeinträchtigt wird. Darüber hinaus ist Zellwachstum durch Waschen oder DMSO Behandlung basierend auf Wachstum Kurvenanalyse (Daten nicht gezeigt) nicht betroffen. Darüber hinaus verursacht Befestigung A. Tumefaciens mit eiskaltem Ethanol nicht grobe Änderungen in der Morphologie (Abb. 2A, ganz rechts Panel).

Als nächstes wurden Ziel bestimmte Farbstoffe zur Zellwand Biogenese Membrandomänen und DNA innerhalb Wildtyp A. Tumefaciens Zellen zu beobachten. Die Muster der neuen Peptidoglycan Insertion beobachtet nach Kennzeichnung mit drei Leuchtstoffröhren-d-Aminosäuren: HADA (Abbildung 2 b, links Panel), NADA (Abb. 2 b, Mittelkonsole) und TADA (Abbildung 2, rechts). In allen drei Kennzeichnung versuchen wurde die neue Peptidoglycan Kennzeichnung am Wachstumspol oder Septum der Zellen bereichert. Diese Wachstumsmuster beobachtet konsequent mit allen drei FDAAs, die darauf hinweist, dass die FDAA Auswahl geändert werden kann, um doppelte Kennzeichnung mit anderen Flecken oder Zellen, die mit dem Ausdruck Eindringmittel markierte Proteine zu ermöglichen. Der lipophile Farbstoff 4-64 Etiketten bevorzugt die alten Pol Region von A. Tumefaciens Zellen, was zu einem charakteristischen Hufeisen Muster (Abbildung 2). Orange (Abbildung 2D, links) und DAPI (Abbildung 2D, rechts) Label DNA innerhalb Leben A. Tumefaciens Zellen. In den späten pre-divisional Zellen zwei unterschiedliche ausgedehnt werden mit Orange Färbung beobachtet, während DNA Kennzeichnung erscheint diffuser mit DAPI Färbung (Abb. 2D) Einklang mit Ergebnissen der Experimente beobachtet in E. Coli10.

Eignung des DNA-Farbstoffe für Zeitraffer-Mikroskopie
Um festzustellen, ob entweder DAPI oder Orange eignen sich für Zeitraffer-Aufnahmen von Nucleoid Morphologie beim Zellwachstum, waren ein gleicher Anteil unbeschriftete, DAPI-Label und Orange-mit der Bezeichnung Wildtyp A. Tumefaciens Zellen gemischt und auf entdeckt Agarose-Pads. Zum Zeitpunkt 0, erste Bilder wurden mit Phasenkontrast, DAPI und TRITC Filter um festzustellen, ob jede Zelle gekennzeichnet war. Die Zelle-Mischungen wurden dann unter drei verschiedenen Bedingungen abgebildet: (1) Phasenkontrastmikroskopie nur, (2) Phase Kontrast und Epifluoreszenz Mikroskopie mit den TRITC Filter und (3) Phase Kontrast und Epifluoreszenz Mikroskopie mit DAPI-Filter. Bilder wurden alle 10 Minuten für 3 Stunden erworben. Alle Zellen wuchsen auch unabhängig von den fluoreszierenden Fleck verwendet, wenn mit Phase Kontrast-Mikroskopie, die darauf hinweist, dass weder Orange oder DAPI-Färbung beeinträchtigen Zellwachstum (Abbildung 3, oben). Alle Zellen wuchs auch gut als Phase-Mikroskopie und Epifluoreszenz-Mikroskopie mit dem TRITC Filter (Abbildung 3, Mittelkonsole) abgebildet. Das orangefarbene Etikett Immunofluoreszenz unterliegt jedoch beobachtet werden, für mindestens 2 h (13 insgesamt Aufnahmen von 200 ms), zeigt die Eignung dieser Farbstoff für kurzfristige Mikroskopie von lebenden Zellen. Unabhängig von der Kennzeichnung, alle Zellen aufhören zu wachsen innerhalb einer Stunde bei Phase-Mikroskopie und Epifluoreszenz Mikroskopie mit DAPI-Filter (Abbildung 3, Bodenplatte) abgebildet. Diese Beobachtung zeigt, dass A. Tumefaciens empfindlich gegen UV-Bestrahlung ist und zeigt, dass Farbstoffe erfordern einen UV Filter für die Abbilderstellung für Zeitraffer-Mikroskopie Experimente vermieden werden sollte.

Time-Lapse Bildgebung und Target-spezifische Kennzeichnung von einer A. Tumefaciens Erschöpfung Belastung
Sowohl Transposon Mutagenese39 zu sättigen und nicht zu einer Löschung Belastung18,40 konstruieren zeigen, dass das master Regulator-Protein, CtrA, A. Tumefaciensunerlässlich ist. Um den Wert der mikroskopischen Analyse von Erschöpfung Stämmen zu demonstrieren, wurde ein zuvor beschriebenen CtrA Erschöpfung Belastung18 Charakterisierung von Mikroskopie unterworfen. In Abbildung 4A, Time-Lapse Mikroskopie wurde verwendet, um das Wachstum von CtrA Erschöpfung Zellen in welcher CtrA Ausdruck vergleichen wurde induziert (oben) und uninduced (unten). In Anwesenheit von CtrA führte eine einzelne Zelle zu einer Microcolony innerhalb von 14 h. Im Gegensatz dazu wenn CtrA erschöpft war, Zellen lysiert oder Fehler beim aufteilen. Zellen, die nicht teilen ausgestellt Brutto morphologische Veränderungen einschließlich der Rundung von Mitte Zelle und an den Polen der Zelle. Diese Beobachtungen legen nahe, dass CtrA eine wichtige Funktion bei der Regulation der Zellteilung hat.

In Abbildung 4 b-Ddienten Fluoreszenzfarbstoffen die Belastungen CtrA Erschöpfung zu charakterisieren, nach Induktion oder Erschöpfung der CtrA für 10 h. Zellen wurden Pulse mit NADA für 2 min (Abbildung 4 b) gekennzeichnet. Wenn CtrA anwesend war (Oberseite), polar Peptidoglycan Biosynthese wurde beobachtet. Im Gegensatz dazu umfangreiche NADA Kennzeichnung ereignete sich in Polen und große Mitte Zelle Schwellungen aufgetreten wenn CtrA erschöpft war. Diese Beobachtung steht im Einklang mit weiteren Peptidoglycan Synthese trotz einer Nichtbeachtung der Zellen teilen. Die Cyanin DNA-Farbstoff Orange wurde verwendet, um DNA-Verteilung in der CtrA Erschöpfung Belastung (Abbildung 4) charakterisieren. Als CtrA anwesend war, eine gleichmäßige Verteilung der DNA hatte wachsenden Zellen und Trennung von ausgedehnt zeigte sich in einer späten pre-divisional Zelle; im Gegensatz dazu wenn CtrA aufgebraucht war, wurde DNA in den Zellen ungleich verteilt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass CtrA zum richtigen DNA-Replikation oder Ausgrenzung beiträgt. Zu guter Letzt wurden CtrA Erschöpfung Zellen mit 4-64 (Abbildung 4) beschriftet. In Anwesenheit von CtrA war der Zellmembran mit einem charakteristischen Hufeisen Muster bezeichnet, in denen die Wachstumspol frei von Makel war. In den Zellen der CtrA erschöpft erschienen 4-64 kennzeichnen die gesamte Membran, obwohl ein Pol intensiver gefärbt wurde. Diese Beobachtung legt nahe, dass Membranen intakt bleiben, obwohl die Lipid Microdomain Organisation gestört werden kann, wenn CtrA erschöpft ist.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Wildtyp Agrobacterium Tumefaciens Zellen mit bestimmten Farbstoffen Ziel beschriftet. (A) Phase Kontrast Aufnahmen von A. Tumefaciens Zellen vor und nach dem Waschen-Protokoll, wenn Sie mit 1 % DMSO behandelt oder nach der Fixierung mit eiskaltem Ethanol. (B) Polar Wachstum von A. Tumefaciens Zellen wird durch die Kennzeichnung mit dem fluoreszierenden d-Aminosäuren HADA, NADA und TADA angezeigt. (C) Färbung von A. Tumefaciens mit den lipophilen 4-64 Fleck. (D)-Färbung von A. Tumefaciens Zellen mit der DNA-spezifischen Farben Orange und DAPI. Für Platten B-D Phasenkontrast (oben) und Epifluoreszenz (unten) Bilder gezeigt. Zelle umrissen sind Fluoreszenzbilder zu Referenzzwecken zur Verfügung gestellt. Maßstabsleiste = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich der DAPI und Orange Kennzeichnung von DNA in live A. Tumefaciens Zellen. Gleiche Anteilen der unbeschrifteten DAPI-beschriftet und Orange-mit der Bezeichnung Wildtyp A. Tumefaciens Zellen gemischt und entdeckt auf Agarose-Pads. Zum Zeitpunkt 0, erste Bilder wurden mit Phasenkontrast, TRITC und DAPI Filter um festzustellen, ob die Zellen gekennzeichnet waren. (A) Zeitraffer der unbeschrifteten, DAPI-beschriftet und Orange-markierten Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie abgebildet. (B) Zeitraffer der unbeschrifteten DAPI-beschriftet und Orange markiert Zellen durch Phase-Mikroskopie und Epifluoreszenz-Mikroskopie mit dem TRITC Filter abgebildet. (C) Zeitraffer der unbeschrifteten DAPI-beschriftet und Orange markiert Zellen durch Phase-Mikroskopie und Epifluoreszenz Mikroskopie mit DAPI-Filter abgebildet. Maßstabsleiste = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Bilder der CtrA Erschöpfung Belastung induzierte und uninduced. (A) Zeitraffer Mikroskopie der CtrA Erschöpfung Belastung unter Bedingungen, wo CtrA induziert (oben) oder leer (unten). Die Zahlen oben jedes Panel geben die Zeit in Stunden. (B) Phase Kontrast (links) und Epifluoreszenz (rechts) Aufnahmen von Zellen mit NADA beschriftet. (C) Phase Kontrast (links) und Fluoreszenz (rechts) Aufnahmen von Zellen mit Orange gekennzeichnet. (D) Phase Kontrast (links) und Fluoreszenz (rechts) Aufnahmen von Zellen mit 4-64 beschriftet. Zelle umrissen wurden Fluoreszenzbilder zu Referenzzwecken zur Verfügung gestellt. Maßstabsleiste = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll enthält eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von A. Tumefaciens Wildtyp, Mutanten und Erschöpfung Stämme. Es ist erwähnenswert, dass alle im Abschnitt Protokoll aufgeführten Verfahren für andere Bakterienstämme mit zusätzlichen Modifikationen ausmachen Wachstumsmedien, Temperaturen und Wachstumsraten leicht angepasst werden kann.

Die Verwendung von Farbstoffen gezielt ist ein wertvolles Werkzeug für die Bereitstellung einer detaillierte Charakterisierung der Zellzyklus Veranstaltungen in Bakterienzellen. Hier Peptidoglycan einfügen Muster wurden beobachtet mit Leuchtstoff-d-Aminosäuren, Lipid-Domains wurden mit 4-64, visualisiert und ausgedehnt wurden beschriftet mit DAPI oder Orange. Jedes Protokoll kann angepasst für den Einsatz in anderen Bakterien nach dem Waschen Protokoll zu optimieren und sicherzustellen, dass die DMSO Behandlung Wachstum oder Morphologie nicht beeinträchtigt werden. Wichtige Überlegungen gehören die Auswahl eines Puffers für Waschanlagen Schritte, Inkubationszeiten für Label-Einbindung und die Auswahl einer geeigneten Fluorophor, Auto-Fluoreszenz zu vermeiden oder Multiplex-Kennzeichnung Studien ermöglichen. Zum Beispiel ist eine Alternative zu den lipophilen rot fluoreszierende Membran Fleck (4-64) grün-fluoreszierende Membran Fleck (1-43). In ähnlicher Weise, blau, grün und rot-fluoreszierend-d-Aminosäuren sind verfügbar6,38 und d-Aminosäuren mit Biorthogonal griffen zu gemeinsamen Fluorophore durch Klick Chemie6,7konjugiert werden können. Schließlich, neben der Orange fluoreszierend Cyanin DNA Farbstoff, eine grüne fluoreszierende Cyanin DNA-Farbstoff steht zur Verfügung und führt nun mit live Bakterienzellen10. Visualisierung der wichtige Zellstrukturen beschriftet mit Farbstoffen gezielt kombinierbar mit der Beobachtung von fluoreszierenden Proteinen mechanistische Einblicke in wichtige Prozesse in Bakterien.

Diese Protokolle enthalten die notwendigen Bedingungen für die mikroskopische Beobachtung von A. Tumefaciens Erschöpfung Flecken und es sollte möglich sein, diese Ansätze zu Protein Erschöpfung Stämme in anderen Bakterien zu verlängern. Die Charakterisierung der Erschöpfung Stämme kann besonders schwierig sein, da gibt es ein begrenzter Zeitraum zu Untersuchungen abgeschlossen sein, bevor die Zellen aufhören zu wachsen oder aufzulösen. Es ist wichtig, ausreichend waschen die Zellen, um alle Spuren von der überschüssigen Farbstoff während Beschriftung entfernen; jedoch haben einige Zellen erschöpft wesentliche Proteine Mängel in ihren Zelloberflächen verursachen sie empfindlich auf Schritte waschen zu können. Steigerung des Zellkulturen Start kann helfen, Verlust von Zellen während der Wäsche Schritte zu kompensieren. Erschöpfung-Stämme, die Zellmembranen oder Zellwände in Mitleidenschaft gezogen haben möglicherweise anfällig für Zell-Lyse wenn in Flüssigkultur ohne Induktor angebaut. Aufnahme eines Osmoprotectant (5 % Saccharose eignet sich gut für A. Tumefaciens) kann helfen, pflegen Zellmorphologie und lyse der Zelle während der Erschöpfung zu begrenzen. Es ist notwendig, die entsprechende Menge an Zeit, um die Zellen vor der Färbung mit Fluoreszenzfarbstoff vorab zum Abbau empirisch bestimmen. Zellen mit permeablized Membranen oder Zellwände möglicherweise anfällig für Zell-Lyse oder nicht-selektiven Etikettierung mit fluoreszierenden Reagenzien Bildgebung des späten Erschöpfung Zeitpunkten besonders schwierig machen.

Ein entscheidender Schritt für die Zeitraffer-Mikroskopie von A. Tumefaciens (oder andere bakterielle Zellen) ist die Vorbereitung des Agarose-Pads. Die Agarose-Pad muss um guten Fokus während Zeitraffer Mikroskopie Experimente sicherzustellen. Darüber hinaus muss das Deckglas vollständig abgedichtet sein, um das Agarose-Pad von Trocknung und ändern der Brennebene zu verhindern. A. Tumefaciensbenötigt Sauerstoff für das Zellwachstum. Bildgebung in der Nähe ein Luftpolster ist notwendig, um robuste Wachstum von A. Tumefaciens während langer Zeitraffer Mikroskopie Experimente (Abbildung 1). Wenn Zellen nicht wachsen oder aufhören zu wachsen nach ein paar Stunden, ist es ratsam, eine Agarose-Pad mit einem größeren Luftpolster und Bild in der Nähe der Lufteinschlüsse vorzubereiten. Auch eine gut ausgebaute Agarose Pad mit einer richtigen Atemhöhle kann nur für maximal ~ 24 h A. Tumefaciens Wachstum unterstützen. Wenn mehr Zeitraffer-Sequenzen notwendig sind, Ansätze Alternative wie Mikrofluidik oder Flow Zellen berücksichtigt werden sollten. Wenn die Zellen außerhalb des Fokus während der Bildgebung treiben, sicherzustellen Sie, dass die Agarose-Pad Ebene und unter dem Deckglas ordnungsgemäß versiegelt ist. Beachten Sie, dass auch bei einem in der Nähe von perfekten Agarose Pad, ist es möglich, dass einige Zellen aus dem Fokus, drift werden somit imaging mehrere Felder und häufige Neuausrichtung sind sehr zu empfehlen. Für andere Bakterien sollten alternative Ansätze der Vorbereitung Agarose Pads41,42,43 gelten am besten den Wachstum Anforderungen für das Bakterium. Agarose-Pads eignen sich auch für Immobilisierung Zellen während der Bildgebung beschriftete oder festen Zellen, beim Zeitraffer nicht notwendig ist. In diesem Fall versiegeln das Deckglas ist nicht notwendig und alternative Ansätze für den Bau von Agarose-Pads, die erst gespeichert werden, können später möglicherweise geeignete43.

Alles in allem bieten die Verwendung von Farbstoffen gezielt und Zeitraffer Mikroskopie Einblicke in grundlegende Prozesse in Bakterien. Hier zeigen wir die üblichen Hufeisen Muster der Markierung mit der lipophilen 4-64-Farbstoff und die charakteristische polare und septal Kennzeichnung mit Leuchtstoff-d-Aminosäuren in A. Tumefaciens. Beobachtungen dieser Muster in A. Tumefaciens stehen im Einklang mit dem polar Wachstum dieses Bakteriums44 und es ist wahrscheinlich, dass ähnliche Studien Informationen über Wachstum in anderen Bakterien Musterung zeigen können. Die Feststellung, dass Cyanin-Farbstoffe wie Orange für Zeitraffer-Mikroskopie10 (Abbildung 3 Studien) geeignet sind sorgfältige Studien der Nucleoid Morphologie beim Zellwachstum im Wildtyp und Mutanten-Stämme ermöglicht. Imaging Fluoreszenzfarbstoffen gezielt während der Erschöpfung der ein essentielles Protein bieten wichtige Beobachtungen, um die Funktion des Proteins zu bestimmen. Schließlich, da viele dieser Farbstoffe mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften vorliegen, sollte Studien mit mehrere Etiketten gleichzeitig Einblicke in die Koordinierung der wesentlichen Prozesse während Zellzyklus Progression ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Michael VanNieuwenhze (Indiana University) für das Geschenk des FDAAs, die in Abbildung 2 und Abbildung 4verwendet. Wir danken Mitglieder des braunen Lab for Feedback während der Vorbereitung dieser Handschrift. Forschung in die braunen Lab on A. Tumefaciens Zelle Wachstum und Teilung wird von der National Science Foundation (IOS1557806) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

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