Summary
Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.
Abstract
Principais processos celulares tais como a replicação do DNA e segregação, síntese proteica, biossíntese da parede celular e divisão celular dependem a função das proteínas que são essenciais para a sobrevivência bacteriana. Uma série de corantes de destino específico pode ser usada como sondas para melhor compreender estes processos. Coloração com corantes lipofílicos permite a observação da estrutura da membrana, visualização de lipídios microdomains e detecção de bolhas de membrana. Uso de fluorescentes-d-amino ácidos (FDAAs) para sondar os locais da biossíntese do peptidoglicano pode indicar potenciais defeitos na parede celular biogênese ou padronização do crescimento celular. Finalmente, as manchas de ácidos nucleicos podem indicar possíveis defeitos na segregação de replicação ou cromossomo de DNA. Cianina DNA manchas rótulo células vivas e são adequado para microscopia de lapso de tempo permitindo observações em tempo real de morfologia nucleoide durante o crescimento celular. Protocolos para a rotulagem de célula podem ser aplicados para os mutantes de depleção de proteína para identificar defeitos na estrutura da membrana, parede celular biogênese ou segregação do cromossomo. Além disso, a microscopia de lapso de tempo pode ser usada para monitorar alterações morfológicas como uma proteína essencial é removida e pode fornecer insights adicionais em função da proteína. Por exemplo, o esgotamento das proteínas essenciais a divisão celular resulta em filamentação ou ramificação, Considerando que a depleção das proteínas de crescimento celular pode causar células tornar-se mais curtos ou mais redondo. Aqui, os protocolos para crescimento celular, destino-específico marcação e microscopia de lapso de tempo são fornecidos para o patógeno bacteriano planta Agrobacterium tumefaciens. Juntos, alvos tintas e microscopia de lapso de tempo permitem a caracterização de processos essenciais em a. tumefaciens. Finalmente, os protocolos fornecidos podem ser facilmente modificados para sondar os processos essenciais em outras bactérias.
Introduction
Progressão através do ciclo celular bacteriano requer a coordenação de muitos processos, incluindo a biossíntese de membrana e parede celular, replicação do DNA e segregação e divisão celular. Para compreender a complexidade da biologia da célula bacteriana, é necessário estudar esses eventos essenciais; no entanto, essa é uma tarefa não trivial desde a viabilidade celular fica comprometida quando componentes-chave destas vias são mutagenized. Microscopia de epifluorescência juntamente com corantes de destino específico é uma poderosa abordagem para investigar estes processos essenciais em sua e estirpes de bactérias mutantes.
Corantes de peptidoglicano específicos incluem fluorescente-d-amino ácidos (por exemplo, 7-Hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina e fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) , NADA; diversos-3-amino-d-alanina; TADA). Em bactérias gram-positivas, o uso de concentrações subletais de análogos de antibióticos fluorescentes para sondar sites da biossíntese do peptidoglicano tem sido uma estratégia eficaz para revelar o peptidoglicano inserção padrões1,2, 3,4. Enquanto rotulagem fluorescente vancomicina tem sido usada para obter insights sobre o peptidoglicano padrões de inserção em bactérias Gram-negativas fixa5, a membrana externa geralmente fornece uma barreira de permeabilidade que impede o uso de fluorescentes antibióticos como uma sonda para a biossíntese do peptidoglicano em células vivas. Em contraste, pulsos de fluorescente-d-amino ácidos ou d-amino ácidos com grupos funcionais de biorthogonal covalentemente rotulam regiões de inserção de peptidoglicano recentes em uma ampla gama de vida células bacterianas6,7. Padrões de inserção de peptidoglicano que têm sido observados com d-aminoácidos sintéticos incluem punctate e septal (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e septal (Agrobacterium tumefaciens e Listeria monocytogenes), único do septo (Staphylococcus aureus) e apical (Streptomyces venezuelae)6,7. Estas observações indicam que as bactérias apresentam diversos padrões de biogênese de parede celular e que o uso de ácidos d-aminoácido sintéticos como sondas para examinar a padronização de crescimento é uma estratégia valiosa em muitas bactérias.
Corantes que rotulam cromossomos bacterianos incluem o fichário de sulco menor específicas do Ácido desoxirribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e corantes de cianina de alta afinidade (verde e laranja; consulte a lista de materiais). DAPI coloração de células fixas auxilia na enumeração de bactérias a partir de amostras ambientais8, Considerando que a DAPI coloração de células vivas é usada para indicar a viabilidade bacteriana9. Em contraste, cianina corantes tais como laranja e verde são frequentemente descritos como manchas de célula "morto" impermeant de membrana para enumerar as células não-viáveis9. Notavelmente, quando estes reagentes são usados para sondar a morfologia de nucleoide bacteriana durante o crescimento celular, DAPI, laranja e verde foram todos mostrado membrana permeant e capaz de rotulagem de células vivas10. Em células de Escherichia coli vivas, DAPI coloração de DNA aparece difusa devido a autofluorescência de citoplasma e repetidas exposições de células manchadas de DAPI à luz ultravioleta (UV) perturba o nucleoide estrutura10. Coloração de e. coli ou b. subtilis com laranja revela que este corante é membrana permeant e fornece fluorescência de longa duração com ligação ao DNA em células vivas, sem afetar o crescimento da pilha, o replication do DNA ou segregação do cromossomo10 . Estas observações sugerem que cyanine tinturas de DNA podem ser usadas para monitorar a morfologia da nucleoids durante o crescimento celular de muitas bactérias.
Phospholipid-specific stryl corantes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibrometo de piridínio (4-64; consulte a lista de materiais) são compostos catiônicos e associar preferencialmente com carga negativa fosfolípidos como cardiolipina e fosfatidilglicerol11. Padrões distintos são observados quando 4-64 é usado para rotular a membrana de bactérias diferentes. Em Escherichia coli, 4-64 é enriquecido nos polos, em faixas ao longo da parede lateral e nos sites de divisão de tarde pre-divisional células12. Em Bacillus subtilis, 4-64 rotulagem permite a visualização de lipídios espirais13. Em Agrobacterium tumefaciens, 4-64 rotula a membrana externa e é observado em um padrão característico "ferradura" no qual o polo de crescimento é desprovido de rotulagem de14,15. Estas observações indicam que essas bactérias apresentam distribuições de lipídios heterogênea devido à presença de domínios de lipídios que contribuem para a assimetria celular. Mudanças nos padrões de rotulagem 4-64 como a presença de rotulagem difusa, bolhas ou vesículas, invaginações ou encolhimento de membrana pode ser informativo em caracterizando mutantes que impactam a distribuição ou a biossíntese de lipídios.
Além da coloração de células, é necessário determinar a função das proteínas que participam em processos essenciais. A caracterização das proteínas essenciais é tecnicamente desafiador, porque não é possível excluir genes essenciais e estudar as consequências fenotípicas. Assim, surgiram a abordagens alternativas que empobrecem a proteína. Por exemplo, um gene essencial pode ser colocado sob o controle de um promotor inducible, ao invés de seu promotor nativo. Promotores inducible são sensíveis a pequenas moléculas, tais como; 16, isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, de zinco e xilose23, assim, a transcrição do gene alvo cessa e a proteína de interesse é empobrecida quando o indutor é removido. Abordagens alternativas para esgotar as proteínas essenciais de interesse incluem riboswitches sintético24 que utilizam interações pequena molécula-RNA para dificultar a transcrição dos genes-alvo, CRISPR interferência25,26 para bloco de transcrição dos genes-alvo e Proteína inducible degradação27,28 que usa etiquetas de peptídeos de proteínas alvo para degradação pela ClpXP protease. Cepas de depleção fornecem apenas um curto período de tempo para caracterização antes que as células perdem a viabilidade, portanto, imagens microscópicas de células ao longo do tempo durante a depleção de proteína é uma poderosa abordagem para caracterização. Com efeito, microscopia das células bacterianas vivas permitiu aos pesquisadores obter insights sobre os processos biológicos fundamentais, incluindo os mecanismos de manutenção de forma celular, secreção e compartimentalização29.
A. tumefaciens é uma planta bacteriana patógeno30 e natural engenheiro genético31,32. Assim, os mecanismos relacionados a patogenicidade, incluindo3534,33,do interações patógeno-hospedeiro, secreção36e anfitrião transformação30,31, 37 tem sido extensivamente investigada. Para a concepção de estratégias que impedem a. tumefaciens mediada por doença ou reforçar a transformação da planta, os processos essenciais para a sobrevivência da . tumefaciens precisam ser melhor compreendida. O uso de corantes de destino específico e o recente desenvolvimento de uma estratégia de depleção de proteína pela . tumefaciens18 fornece um meio para investigar os processos essenciais.
Aqui, protocolos detalhados para análise microscópica de cepas de depleção de proteína, mutante e sua da . tumefaciens são fornecidos. Os dois primeiros protocolos descrevem como preparar células e rotulá-los com corantes de destino específico. O terceiro Protocolo fornece instruções passo a passo para preparar pastilhas de agarose (Figura 1) e imagem latente as células bacterianas (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Esses protocolos também podem ser adequados para outras bactérias com adaptações adicionais para condições de diferentes mídias, taxas de crescimento, exigências de oxigênio e estruturas celulares.
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Protocol
1. crescimento de cepas da . tumefaciens
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Cultivo de cepas da . tumefaciens
- Use uma ponta de madeira estéril da vara ou pipeta para inocular 1 mL de meio de crescimento ATGN (ver lista de materiais para a receita) com uma única colônia da estirpe desejada.
Nota: Para as estirpes de depleção da . tumefaciens , o ATGN deve conter 1 mM IPTG como um indutor para manter a biossíntese da proteína essencial. - Crescem as cepas da . tumefaciens pernoite em ATGN a 28 ° C, com agitação a 225 rpm.
- Medir a densidade óptica das células em 600 nm (OD600), utilizando um espectrofotômetro. Diluir a cultura de pilha para uma OD600 = ~0.2 e continuar a crescer até OD600 = ~0.6 é alcançado. Para cepas de depleção, continuar a crescer com indutor até OD600 = ~0.6 é alcançado.
- Use sua e mutante cepas da . tumefaciens em OD600 = ~0.6 para mancha alvo-específica e/ou microscopia de lapso de tempo (ver as seções 2 e 3.1). Para cepas de depleção, lavar o indutor (ver ponto 1.2).
- Use uma ponta de madeira estéril da vara ou pipeta para inocular 1 mL de meio de crescimento ATGN (ver lista de materiais para a receita) com uma única colônia da estirpe desejada.
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Remoção de indutor para caracterização de cepas de depleção de proteína a. tumefaciens
- 1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga desktop à temperatura ambiente.
- Para lavar, remover o sobrenadante e resuspenda o pellet em mídia fresca sem indutor da pelota e as células conforme descrito acima (1.2.1). Lave as células de um total de 3 vezes na nova mídia.
- Resuspenda o pellet final na mídia fresca e concentrar-se as células de uma OD600 = ~0.8 para coloração imediata com corantes específicos do alvo (secção 2 e Figura 4B-D) ou microscopia de lapso de tempo ( Figura 4Ae seção 3.2) . Alternativamente, pre-empobrecem as células para a quantidade de tempo desejada pelo crescimento de células em meios sem indutor antes da coloração e da imagem latente das células.
2. destino-específicos de coloração de células da . tumefaciens
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Parede celular d-amino ácido de fluorescente rotulagem
Nota: FDAAs são tóxicos fluorescentes d-aminoácidos prontamente incorporadas o . tumefaciens peptidoglicano. Este procedimento simples rotulagem sondas crescimento padronização em células vivas6. Protocolos para a síntese de quatro FDAAs estão disponíveis38.- 500 µ l de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho. Resuspenda o pellet de células em 100 µ l de mídia fresca.
- Adicione 5 µ l de 5mm FDAA para lavado e concentrado de células e incuba por 2 min no escuro.
Nota: Limitar a exposição à luz FDAA. O tempo de incubação irá variar dependendo da taxa de crescimento da tensão. Normalmente, tempos de incubação devem ser de 5-10% do tempo dobrando6. - Pelotas as células por centrifugação e lavar pelotas de célula com solução salina tamponada fosfato (PBS) três vezes.
- Resuspenda o pellet em ~ 50 µ l PBS.
Nota: O volume de PBS usado para ressuspensão pode variar com base no tamanho da pelota. - Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente (ver secções 3.1 e 3.2).
- Como alternativa, pare mais incorporação de rótulo, fixando as células com etanol a 70% gelado. Ressuspender as células em 1 mL de etanol a 70% gelado e incubar no gelo por 15 minutos.
- Coletar as células por centrifugação e Resuspenda em um pequeno volume de PBS para a imagem latente em um momento posterior. Loja de suspensões celulares a 4 ° C e imagem dentro de 48 horas.
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DNA de coloração com DAPI ou mancha laranja
Nota: Observar DNA estrutura, as células são rotuladas com DAPI ou laranja (mancha de célula morta). Embora classicamente descrita como uma "mancha de mortos-célula", o laranja é permeant, fotoestável e não afeta o crescimento de células bacterianas, permitindo viver-pilha DNA imagem10. Em a. tumefaciens, laranja rotulagem funciona bem em células vivas e é adequada para microscopia de lapso de tempo (Figura 3). Em contraste, o ultravioleta (UV) luz ambiente necessário para células de imagem manchada de DAPI é fototóxico (Figura 3) e assim DAPI coloração é o mais adequado para a coloração de células vivas para imediata de imagem ou manchando pilhas fixas.- DAPI coloração de células
- 1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho.
- Opcionalmente, para corrigir as células antes da coloração, resuspenda o pellet de células em 1 mL de etanol a 70% gelado. Incube no gelo por 10-15 min.. coletar as células por centrifugação como descritas em 2.2.1.1.
- Ressuspender as células em 1 mL de PBS contendo 1 µ l de solução-mãe de DAPI (1 mg/mL; Veja a Tabela dos materiais). Misture suavemente pipetando e incubar durante 5 minutos no escuro.
- Células de pelotas por centrifugação a 7.000 x g durante 5 min e ressuspender em 1 mL de PBS para remover o excesso DAPI. Lavar as células mais duas vezes e resuspenda o pellet em 50 µ l PBS ou mídia.
- Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente. Consulte as seções 3.1 e 3.2.
Nota: Este protocolo não é ideal para microscopia de lapso de tempo observar a dinâmica do cromossomo (Figura 3). Considere o uso de coloração laranja como alternativa (ver secção 2.2.2).
- Coloração laranja de células vivas
- 1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS contendo 1 µ l de solução-mãe de laranja (veja a lista de materiais). Misture suavemente pipetando e incubar durante 5 min no escuro.
- Células de pelotas por centrifugação e ressuspender em 1 mL de PBS para remover excesso laranja. Lavar as células mais duas vezes e resuspenda o pellet em 50 µ l PBS.
- Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente. Consulte as seções 3.1 e 3.2.
Nota: Este protocolo funciona bem com células vivas e é adequado para microscopia de lapso de tempo observar a dinâmica do cromossomo (Figura 3). Se não for conveniente para a imagem imediatamente, as células podem ser fixadas em etanol a 70% gelada (consulte a seção 2.2.1.2).
- DAPI coloração de células
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Rotulagem de membrana
Nota: A tintura fluorescente lipofílico styryl 4-64 tem sido amplamente utilizada para observar a membrana das células bacterianas. Em contraste com muitas bactérias, 4-64 rotulado a. tumefaciens células não rotular uniformemente, mas prefiro frequentemente exibem um padrão de "ferradura"14,15. Notavelmente, o polo de crescimento é quase desprovido de mancha, enquanto que o antigo poste intensamente é rotulado. Assim, 4-64 permite a visualização de ambos os padrões de crescimento celular e a estrutura da membrana na . tumefaciens.- Adicionar FM 4-64 para uma concentração final de 8 µ g/mL em 1 mL de cultura de células de fase exponencial e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos no escuro.
- Pelota pilhas etiquetadas por centrifugação a 7.000 x g durante 5 minutos em uma centrífuga de área de trabalho e resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS. Lave as células de um total de três vezes para remover o corante em excesso.
- Ressuspender as células em um pequeno volume de PBS e local sobre uma almofada de agarose a imagem imediatamente. (Consulte as seções 3.1 e 3.2)
Atenção: As células devem ser fotografadas imediatamente para observar padrões característicos de rotulagem.
3. imagem latente da . tumefaciens células
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Preparação de almofada de agarose
Nota: Figura 1 contém uma sequência de imagens (painel A) e esquema (painel B) de uma almofada de agarose típicos preparada para microscopia de lapso de tempo. Almofadas de agarose são tipicamente preparadas conforme necessário.- 3.1.1. use uma lamela como guia e corte uma 22 x 22 mm quadrada do laboratório de cinema (veja lista de materiais) executando um bisturi em torno das bordas.
- Corte um quadrado do centro do filme laboratório deixando um ~ 2-5 fronteira mm para servir como uma junta para a almofada de agarose. Descarte o recorte do centro.
- Coloque a gaxeta do filme numa lâmina de vidro (75 x 25 mm) limpada com uma amônia e líquido de limpeza sem álcool (ver lista de materiais) e aqueça até que o filme é ligeiramente derretido sobre vidro (imagem superior na figura 1A). Para derreter o filme do laboratório, use a borda de um bloco de calor conjunto a 70 ° C ou derreter levemente sobre uma flama.
- Preparar a solução de agarose misturando ~0.075 g agarose (veja a lista de materiais) em 5 mL de mídia em um pequeno frasco. Aqueça a solução em um microondas com agitação periódica para misturar até que a agarose é dissolvido e a solução é clara. Manter a solução de agarose em 55-70 ° C e usar para construção de várias almofadas de agarose em 48 horas.
- Pipeta de mídia contendo 1,2-1,5% de agarose no centro da gaxeta.
Nota: O volume de mídia é tipicamente 50-60 µ l mas irá variar com base no tamanho da gaxeta. Adicionando mídia a um slide frio pode causar o agarose solidificar demasiado rapidamente, assim o slide deve ser mantido sobre uma superfície quente. A borda de um bloco de calor bem definido para obras de 70 ° C. Agarose de água ou soluções de agarose em buffer como salina tamponada fosfato (PBS) podem ser usadas em vez de mídia contendo agarose para aplicações em que o crescimento contínuo da célula não é necessário. Para cepas de depleção de imagem, pode ser indutor de presentes ou ausentes na mídia. Presença do indutor pode ser usada como um controle, Considerando que a ausência de indutor irá revelar o fenótipo de depleção. - Coloque uma lamela sobre a gaxeta para distribuir uniformemente o agarose.
- Coloque slide sobre uma superfície fresca, nível para solidificar por ~ 2 min. Evite excessos da agarose almofada, pois isso resultará em uma superfície enrugada sobre a almofada de agarose e pool de suspensão de célula quando aplicados à superfície.
- Deslize cuidadosamente a lamela a esponja de agarose.
Atenção: Não se apresse este passo. A almofada de agarose pode facilmente rasgar e uma almofada de agarose desigual pode dificultar a imagem latente. - Permitir que a almofada de agarose ao ar seco para 1-2 min à temperatura ambiente até que a superfície da almofada parece seca. Usando um bisturi, remover uma pequena faixa de agarose para criar uma bolsa de ar (meio imagem, figura 1A); a bolsa de ar é tipicamente ~ 2 x 7-10 mm e a. tumefaciens células tendem a crescer melhor perto da bolsa de ar (Figura 1).
Nota: Para a imagem latente de células fixas ou em condições onde o crescimento não é monitorizado, uma bolsa de ar não é necessária. - Ponto 1-0,8 µ l de células sobre a almofada de agarose e cobrir com uma lamela de nova. Coloque delicadamente a lamela por cima da almofada do agarose para distribuir as células em toda a superfície da almofada do agarose.
- Selar as bordas da lamela usando VALAP derretida (consulte a Tabela de materiais para a receita; Figura 1A, imagem de fundo). A vedação ao longo de todas as bordas e cantos da lamela pode causar secagem do pad agarose, que levará para a derivação de células durante a imagem latente. Nota: A selagem da lamela é necessária somente para a imagem latente de lapso de tempo a longo prazo.
Figura 1: preparação de almofada Agarose. (A) sequência do protocolo de preparação de almofada de agarose de imagem. Imagem 1 é um slide com a junta de filme de laboratório. Na imagem 2, a almofada de agarose e a bolsa de ar são visualizados. Finalmente, a imagem 3 mostra a almofada de agarose completa com as células sob uma lamela e selado com VALAP. (B), um diagrama esquemático de uma almofada de agarose para microscopia de lapso de tempo é fornecido. Características-chave do pad agarose são etiquetadas no esquema. (C), a bolsa de ar promoveu o crescimento da . tumefaciens em almofadas de agarose. São mostradas imagens de sua a. tumefaciens células cultivadas em uma almofada de agarose para 20 horas. Imagens foram tiradas em posições cada vez mais distantes da bolsa de ar. A distância da borda mais próxima da imagem para o bolso de ar é mostrada acima de cada imagem. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Imagem latente
Nota: Contraste de interferência diferencial, contraste de fase e imagem latente de epifluorescência é realizada com um microscópio invertido equipado com focagem automática baseada em hardware, um palco automatizado, filtros padrão, uma fonte de luz LED, imersão de óleo 60 X objectivos (at 1.4) para contraste de fase ou contraste de interferência diferencial (DIC) e uma câmera de-acoplado-dispositivo de carga (EMCCD) de elétrons-multiplicação de 1K. O microscópio deve ser colocado em uma sala de temperatura controlada. Alternativamente, um palco mais quente ou câmara pode ser usada para manter temperaturas consistentes durante a imagem latente.- Microscopia de epifluorescência
Nota: Para a imagem latente de fluorescência das células vivas, é necessário limitar o número de aquisições de imagem e otimizar o tempo de exposição, para minimizar o fotobranqueamento e fototoxicidade. Para a imagem latente de cada corante, é aconselhável encontrar um tempo de exposição ideal que fornece detecção de fluorescência suficientes, mas não conduz à fotobranqueamento ou fototoxicidade. Nas figuras 2-4, tempos de exposição de 200 ms foram usados para todas as imagens de fluorescência. Para as sequências de lapso de tempo mostradas na Figura 3, imagens foram adquiridas a cada 10 min para 3h.- Coloque óleo de imersão em atingir o objectivo pretendido e o slide invertido no suporte do slide no palco. Use os botões de focalização para colocar as células em foco.
- Adquira imagens em fase (ou DIC) e o filtro de fluorescência desejado.
Nota: Os máximas excitação e emissão de comprimentos de onda para as manchas usados na Figura 2, Figura 3e Figura 4 são os seguintes: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), laranja (547/570).
- Microscopia de lapso de tempo
Nota: Durante a microscopia de lapso de tempo os seguintes recursos são controlados pelo computador: x, y e z filtros de posição, obturadores e fluorescência. Um sistema de foco automático baseado em hardware é ideal para manter o foco durante a imagem latente de lapso de tempo. Alternativamente, pode ser usado um loop de auto-foco baseados em software.- Coloque óleo de imersão em atingir o objectivo pretendido e o slide invertido no suporte do slide no palco. Use os botões de focalização para colocar as células em foco.
- Opcionalmente: Adquirir múltiplas (x, y) posições. Selecione aleatoriamente 10 campos de células em estreita proximidade com o bolso de ar das almofadas do agarose.
- Set-up a tempo sequência aquisição de imagem em fase ou DIC no intervalo de tempo desejado.
Nota: Para a lapso de tempo sequência mostrada na Figura 4, DIC imagens foram adquiridas com a exposição de 30 ms cada 10min para 14 h. Quando utilizando imagens de fluorescência durante a microscopia de lapso de tempo, ajuste o tempo de exposição e intervalo de aquisição para minimizar fotobranqueamento e fototoxicidade.
- Microscopia de epifluorescência
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Representative Results
Destino-específico marcação de sua A. tumefaciens células
A fim de ilustrar essa morfologia celular não é afetada pelas etapas de lavagem ou tratamento com 1% de DMSO (que é usada para diluir os corantes fluorescentes), as células foram fotografadas diretamente da cultura (Figura 2A, painel de extrema-esquerdo), depois de lavar as células por centrifugação conforme descrito no ponto 1.2 (Figura 2A, painel esquerdo), ou após a incubação das células com 1% DMSO por 10 min e lavar as células (Figura 2A, painel direito). Estas imagens ilustram que a morfologia não é afetada por lavagem ou a presença de DMSO. Além disso, o crescimento celular não é afetado por lavagem ou tratamento de DMSO com base na análise de curva de crescimento (dados não mostrados). Além disso, fixando a. tumefaciens com etanol gelado não causa mudanças brutas em morfologia (Figura 2A, painel de extrema-direito).
Em seguida, corantes específicos alvo foram usados para observar a biogênese de parede celular, domínios de membrana e DNA dentro das células da . tumefaciens sua. Observaram-se os padrões de nova inserção de peptidoglicano etiquetando com três fluorescente-d-amino ácidos a seguir: HADA (Figura 2B, deixada o painel), NADA (Figura 2B, painel central) e TADA (Figura 2, painel direito). Em todos os três experimentos de rotulagem, rotulagem de peptidoglicano novo foi enriquecido no polo de crescimento ou septo das células. Esses padrões de crescimento foram observadas consistentemente com todos os três FDAAs, indicando que a seleção de FDAA pode ser modificada para permitir a rotulagem dupla com outras manchas ou celulas que expressam proteínas fluorescente etiquetadas. O corante lipofílico 4-64 etiquetas preferencialmente nas regiões polo da . tumefaciens células resultando em um padrão característico de ferradura (Figura 2). Tanto laranja (Figura 2D, painel esquerdo) e DAPI (Figura 2D, painel direito) rótulo DNA dentro de vivem a. tumefaciens células. Nas células pre-divisional tarde, duas nucleoids distintas são observados com coloração laranja, Considerando que a rotulagem do DNA aparece mais difuso com DAPI coloração (Figura 2D) consistente com resultados de experimentos observados em Escherichia coli10.
Adequação dos corantes de DNA para microscopia de lapso de tempo
A fim de determinar se ou DAPI ou laranja são adequados para a imagem latente de lapso de tempo da morfologia nucleoide durante o crescimento de células, uma proporção igual de sem rótulo, DAPI-etiquetada e sua laranja-etiquetadas a. tumefaciens células foram misturados e manchado em almofadas de agarose. No tempo 0, imagens iniciais foram tiradas usando contraste de fase, DAPI e TRITC filtros para determinar se cada célula foi rotulada. As misturas de células foram então fotografadas em três condições diferentes: microscopia de contraste de fase (1) apenas, microscopia de contraste e de epifluorescência (2) fase usando o TRITC filtro e (3) fase de contraste e epifluorescência microscopia usando o filtro DAPI. Imagens foram adquiridas a cada 10 minutos para 3 horas. Todas as células cresceram bem independentemente da mancha fluorescente usada quando imaginada com fase de microscopia de contraste, indicando que nem laranja ou DAPI coloração afectar o crescimento de células (Figura 3, painel superior). Todas as células também cresceram bem quando imaginada por microscopia de fase e microscopia de epifluorescência usando o filtro TRITC (Figura 3, painel central). A etiqueta laranja está sujeito fotobranqueamento mas pode ser observada pelo menos 2 h (13 exposições totais de 200 ms), indicando a adequação deste corante para microscopia de curto prazo de células vivas. Independentemente da rotulagem, todas as células param de crescer dentro de uma hora quando imaginada por microscopia de fase e microscopia de epifluorescência usando o filtro DAPI (Figura 3, painel inferior). Esta constatação demonstra que a. tumefaciens é sensível a exposição aos raios UV e indica que os corantes que exigem um filtro UV para a imagem latente devem ser evitadas para experimentos de microscopia de lapso de tempo.
Imagem de lapso de tempo e o destino-específico marcação de um A. tumefaciens estirpe de depleção
Tanto saturando transposon mutagênese39 e não conseguir construir uma estirpe de exclusão18,40 indicam que a proteína do regulador mestre, CtrA, é essencial na . tumefaciens. Para demonstrar o valor da análise microscópica de cepas de esgotamento, um descrito anteriormente ctrA depleção estirpe18 foi submetida a caracterização por microscopia. Na Figura 4A, microscopia de lapso de tempo foi utilizada para comparar o crescimento de células de depleção ctrA no qual expressão ctrA foi induzido (parte superior) e uninduced (baixo). Na presença de CtrA, uma única célula deu origem a uma microcolônias dentro de 14 h. Em contraste, quando CtrA foi esgotado, células ou lysed ou falharam dividir. Células que não conseguiram dividir exibiram alterações morfológicas brutas incluindo arredondamento do meio do celular e nos polos da célula. Estas observações sugerem que CtrA tem uma função importante na regulação da divisão celular.
Na Figura 4B-D, corantes fluorescentes foram usados para caracterizar a estirpe de depleção ctrA após indução ou esgotamento de ctrA para 10 h. células foram pulso rotulado com NADA por 2 min (Figura 4B). Quando CtrA estava presente (painel superior), a biossíntese do peptidoglicano polar foi observada. Em contraste, extensa NADA rotulagem ocorreu nos polos e grandes inchaços mid celulares ocorreram quando CtrA foi esgotado. Esta observação é consistente com a síntese de peptidoglicano continuou, apesar de um fracasso das células para dividir. O corante de ADN cianina laranja foi utilizado para caracterizar a distribuição de DNA na estirpe de depleção ctrA (Figura 4). Quando CtrA estava presente, crescer células tinha uma distribuição uniforme de DNA e segregação de nucleoids era aparente em uma célula pre-divisional final; em contraste, quando CtrA foi esgotado, DNA foi desigualmente distribuída as células. Estas observações sugerem que CtrA contribui para adequada a replicação do DNA ou segregação. Finalmente, as células de depleção ctrA foram rotuladas com 4-64 (Figura 4). Na presença de CtrA, membrana celular foi rotulada com um padrão característico de ferradura em que o polo de crescimento era desprovida de mancha. Em células empobrecidas de CtrA, 4-64 apareceu para rotular a membrana inteira, embora um polo mais intensamente estava manchado. Esta observação sugere que as membranas permanecem intactas, apesar da organização de microdomain de lipídios pode ser interrompida quando CtrA está esgotada.
Figura 2: Imagens representativas de sua Agrobacterium tumefaciens células rotuladas com corantes específicos alvo. (A) fase de contraste imagens da . tumefaciens células antes e após o protocolo de lavagem, quando tratados com 1% DMSO ou após fixação com etanol gelado. (B) Polar crescimento de células da . tumefaciens é mostrado através da marcação com os fluorescentes d-amino ácidos HADA, NADA e TADA. (C) coloração da a. tumefaciens com a mancha lipofílicos 4-64. (D) coloração da . tumefaciens células com as tinturas de DNA específico laranja e DAPI. Para painéis B-D, são mostradas imagens de epifluorescência (inferior) e contraste de fase (em cima). Contornos de célula são fornecidos em imagens de fluorescência para referência. Barra de escala = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de DAPI e laranja rotulagem de DNA em viver a. tumefaciens células. Proporções iguais de sua sem rótulo, DAPI-etiquetadas e laranja-etiquetadas a. tumefaciens células foram misturadas e manchadas em almofadas de agarose. No tempo 0, imagens iniciais foram tiradas usando contraste de fase, TRITC e DAPI filtros para determinar se as células foram rotuladas. (A) Time-Lapse de células sem rótulo, DAPI-etiquetadas e laranja-etiquetadas, fotografadas por microscopia de contraste de fase. (B) Time-Lapse de células sem rótulo, DAPI-etiquetadas e laranja-etiquetadas, fotografadas por microscopia de fase e microscopia de epifluorescência usando o filtro TRITC. (C) Time-Lapse de células sem rótulo, DAPI-etiquetadas e laranja-etiquetadas, fotografadas por microscopia de fase e microscopia de epifluorescência usando o filtro DAPI. Barra de escala = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas da estirpe ctrA depleção em condições induzidas e uninduced. (A) microscopia de lapso de tempo da estirpe depleção ctrA sob condições onde ctrA foi induzido (parte superior) ou empobrecido (parte inferior). Os números acima de cada painel indicam o tempo em horas. (B) fase de contraste (à esquerda) e imagens (à direita) de epifluorescência de células rotuladas com NADA. (C) fase de contraste (à esquerda) e imagens (à direita) de fluorescência das células rotuladas com laranja. (D) fase de contraste (à esquerda) e imagens (à direita) de fluorescência das células rotuladas com 4-64. Célula de contornos foram fornecidos em imagens de fluorescência para referência. Barra de escala = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo contém uma série de procedimentos para a investigação de cepas da . tumefaciens sua, mutante e esgotamento. É interessante notar que todos os procedimentos listados na seção de protocolo podem ser facilmente adaptados para outras cepas bacterianas com modificações adicionais para dar conta de mídia de crescimento, temperaturas e taxas de crescimento.
O uso de corantes de destino específico é uma ferramenta valiosa para fornecer uma caracterização detalhada dos eventos do ciclo celular em células bacterianas. Aqui, observaram-se padrões de inserção de peptidoglicano usando fluorescente-d-amino ácidos, domínios de lipídios foram visualizados com 4-64, e nucleoids foram rotulados com DAPI ou laranja. Cada um dos protocolos pode ser adaptado para uso em outras bactérias após otimizar o protocolo de lavagem e garantindo que o tratamento de DMSO não afectar o crescimento ou morfologia. Considerações-chave incluem a seleção de um buffer para etapas de lavagem, os tempos de incubação para a incorporação de rótulo e a seleção de um fluoróforo apropriado para evitar autofluorescência ou para permitir estudos de rotulagem multiplex. Por exemplo, uma alternativa para a mancha lipofílico fluorescente vermelha membrana (4-64) é a mancha verde-fluorescente de membrana (1-43). Da mesma forma, azul, verde e vermelho fluorescente-d-amino ácidos são disponíveis6,38 e d-amino ácidos com biorthogonal alças podem ser conjugados com fluorophores comum através do clique química6,7. Finalmente, para além da laranja-fluorescente cianina DNA tingir, um verde fluorescente cianina DNA tintura está disponível e executa bem com vivo de células bacterianas10. Visualização de estruturas chave célula rotulada com corantes de destino específico pode ser combinada com a observação de proteínas fluorescentes para obter insights mecanicistas em processos essenciais em bactérias.
Estes protocolos incluem as condições necessárias para a observação microscópica das manchas de depleção da . tumefaciens e deve ser possível estender essas abordagens para as cepas de depleção de proteína em outras bactérias. A caracterização de cepas de depleção pode ser particularmente desafiador, pois há um prazo limitado para concluir as investigações antes das células param de crescer ou lyse. É crucial lavar adequadamente as células para remover todos os vestígios do corante em excesso durante a rotulagem; no entanto, algumas células empobrecidas de proteínas essenciais têm defeitos em suas superfícies de célula que podem causar-lhes a ser sensíveis ao lavar as etapas. Aumentar o volume inicial de culturas de pilha pode ajudar a compensar a perda de células durante as etapas de lavagem. Estirpes de esgotamento que tem comprometido as membranas celulares ou paredes celulares podem estar propensas à célula lise quando cultivadas em cultura líquida sem indutor. Inclusão de um osmoprotectant (5% de sacarose funciona bem para a. tumefaciens) pode ajudar a manter a morfologia celular e limitar o lysis da pilha durante a prostração. É necessário determinar empiricamente a quantidade adequada de tempo para esgotar previamente as células antes da coloração com corante fluorescente. Células com permeablized membranas ou paredes celulares podem estar propensas à célula lise ou rotulagem não-seletivo com reagentes fluorescentes, tornando a imagem latente de tarde pontos de tempo de depleção particularmente desafiadoras.
Um passo crítico para microscopia de lapso de tempo, da . tumefaciens (ou outras células bacterianas) é a preparação da almofada do agarose. A almofada de agarose precisa ser nível para garantir bom foco durante experimentos de microscopia de lapso de tempo. Além disso, a lamela deve ser completamente selada para evitar que a almofada de agarose de secagem e alterando o plano focal. Para a. tumefaciens, o oxigênio é necessário para o crescimento de células. Imagem de perto uma bolsa de ar é necessária para obter um crescimento robusto da . tumefaciens durante experimentos de microscopia longo lapso de tempo (Figura 1). Se as células não crescer ou parar de crescer após apenas algumas horas, é aconselhável preparar uma almofada de agarose com uma bolsa de ar maior e imagem perto os bolsões de ar. Mesmo uma almofada de agarose bem construído com uma bolsa de ar adequada suporta apenas o crescimento da . tumefaciens para um máximo de ~ 24 h. Se mais sequências de lapso de tempo são necessárias, alternativa abordagens tais como células microfluídica ou fluxo devem ser consideradas. Se as células deriva fora de foco durante a imagem latente, certifique-se de que a almofada de agarose é nivelada e devidamente selado sob a lamínula. Observe que mesmo com um quase perfeito agarose almofada, é possível que algumas células vão derrapar fora de foco, imagem, portanto, vários campos e reorientação frequente são altamente recomendados. Para outras bactérias, métodos alternativos de preparação de agarose almofadas devem ser considerados41,42,43 para melhor atender as exigências de crescimento para a bactéria. Almofadas de agarose também são úteis para células de imobilização durante a imagem latente de células rotuladas ou fixas quando o lapso de tempo não é necessário. Neste caso, selando a lamela não é abordagens alternativas e necessárias para a construção de agarose almofadas que podem ser armazenadas até posterior pode ser apropriado43.
No geral, o uso de corantes de destino-específicos e microscopia de lapso de tempo pode fornecer insights sobre processos fundamentais em bactérias. Aqui, podemos ilustrar o padrão usual de ferradura de rotulagem com o corante lipofílico 4-64 e a característica polar e septal rotulagem com fluorescente-d-amino ácidos na . tumefaciens. Observações desses padrões na . tumefaciens são consistentes com o crescimento polar desta bactéria44 e é provável que estudos semelhantes podem revelar informações sobre o crescimento de padronização em outras bactérias. A constatação que cianina corantes como laranja são adequadas para estudos de microscopia de lapso de tempo10 (Figura 3) permitirá estudos cuidadosos de morfologia nucleoide durante o crescimento de células em cepas sua e mutante. Imagem de corantes fluorescentes de destino específico durante o esgotamento de uma proteína essencial pode fornecer observações chaves para determinar a função da proteína. Finalmente, uma vez que muitos destes corantes estão disponíveis com diferentes propriedades espectrais, estudos utilizando vários rótulos simultaneamente deverá permitir insights sobre a coordenação dos processos essenciais durante a progressão do ciclo celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o dom dos FDAAs usado na Figura 2 e Figura 4-Michael VanNieuwenhze (Universidade de Indiana). Agradecemos a membros do laboratório marrom para feedback durante a preparação deste manuscrito. Pesquisa no laboratório de marrom na divisão e crescimento de células da . tumefaciens é suportada pela National Science Foundation (IOS1557806).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
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