Summary
このプロトコルは最初外尿道括約筋電極と第二に、膀胱と尿道の外部関数の測定と組み合わせて膀胱カテーテルの永久的な注入の手術を記述します。注入の目がさめている動物で括約筋。
Abstract
下部尿路機能は、齧歯動物の膀胱内圧測定膀胱機能解析による主に評価されます。従来の cystometries は通常、ウレタン麻酔下ターミナル分析として実行されます。麻酔薬が膀胱機能に影響を与えることが知られています。したがって、このテクニックのねらいは軽く拘束された覚醒ラットで膀胱と外尿道括約筋の内圧測定を行うことです。このため、膀胱カテーテルが膀胱ドームの中に注入します。その後、2 つの電極は, 外尿道括約筋に二国間で注入され、接地電極は非応答性骨格筋に縫合します。膀胱カテーテルそして 3 つの電極は最後に、頚部に皮下トンネルし、ハーネスに貼付。この手法では、下部尿路機能を評価するために同じ動物の複数の時点で下部尿路を測定できます。この技術の主要なアプリケーションは、同時の膀胱と外尿道括約筋機能覚醒健康なラットに、病気やけがの誘導後のフォロー アップです。さらに、後続の下部尿路監視は、病気や怪我の治療の有効性を監視するための評価中に実行できます。
Introduction
ほとんどの研究は、尿・排尿機能と機能障害を分析するには、齧歯動物モデルを使用しています。反射神経を順次活性化、排尿が生成されます。これらの反射の調整は、効率的な排尿1に不可欠です。膀胱内圧測定記録技術は、そのニューラル制御1の下で, 膀胱機能解析のための貴重なツールを提供します。
ラットのほとんどの従来の cystometries として主にウレタン2麻酔の 1 つ、最終的な分析と膀胱にのみ焦点を当てます。しかし、神経因性排尿障害 (NLUTD) のようないくつかの疾患、膀胱だけでなく、膀胱の出口、尿道括約筋は機能不全の3、4です。これにより、単一内圧測定、膀胱が調べられ、のみ場合、NLUTD がフォロー アップすることは困難になります。人間に匹敵する信頼性の高い結果を得るためそれは膀胱と外尿道括約筋の機能との相互作用2の両方を正確に測定することが欠かせません。さらに、麻酔は非常に膀胱機能2,5,6を変更する可能性があると覚醒ラットで機能解析を実行することが重要です。目がさめている動物の記録良い膀胱内圧測定は膀胱機能や誤動作7の同定のための基礎です。
(例えば、キャタ マウント膀胱内圧測定駅 (CCS)) 小動物の膀胱内圧測定駅使用は小さな目を覚まし動物8膀胱内圧測定解析を実行するユニットです。恒久的な膀胱カテーテルと注入された外尿道括約筋電極、長い時間の期間2以上繰り返し測定を実行できます。したがって、CCS のための貴重なツールを提供します非神経因性と短期または中期的フォロー アップの中に、病因を変更できます、齧歯動物モデルにおける NLUTD 評価。さらに、このメソッドには覚醒ラットで膀胱の測定に、落を用いたアーチファクト低減膀胱内圧測定分析が含まれます。
完全に膀胱カテーテルと覚醒ラットで膀胱内圧測定の測定と共に、外尿道括約筋電極を移植する外科的アプローチについて述べる。
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Protocol
ここで説明したすべての手順は、動物研究のためオーストリア政府倫理委員会で承認された (同毛皮学問、上海虹橋と付き、WF/V/3b) 研究評価会を遵守していたと動物用動物のガイドラインです。ラットのこのアプローチの使用は女性、12 週齢のルイス ・ ラット.プロトコルを通して滅菌器具を使用します。
1 材料の準備
-
カテーテルの製造
- 動物のサイズに合わせて適当な長さ (20 〜 25 cm) にカテーテル (ポリエチレン チューブ PE 50) をカットします。
注: は、トンネリングおよび容易に処理にいくつかの余分な長さを残してください。 - 丸みを帯びた先端を得るためのライターと 1 つの端に します。最終の適切な開口部とカテーテルの鈍い端を確認します。
- それだけ急に燃え上がった端の下にあるまでカテーテル上 2 mm 長いシリコン チューブを置きます。
- 動物のサイズに合わせて適当な長さ (20 〜 25 cm) にカテーテル (ポリエチレン チューブ PE 50) をカットします。
-
電極の製造
- 20-25 cm (動物のサイズに応じて適切な長さ) の四フッ化エチレン樹脂被覆鋼線を準備します。
- 銀線の長さ 2 cm を準備し、小さなループのままになるまで、両端をねじる。一方の端にテフロン絶縁の 2 mm を落とします。裸鋼線に終わるツイストの銀線をはんだ付けします。
- コーティング ゾーンで従来のマニキュアを適用します。コーティングの領域に 4 mm 長いポリエチレン チューブを準備し、圧縮の鉗子に熱を適用することでシールの端。
2. 動物の準備
-
麻酔
- 使用カクテル適切な麻酔は、麻酔一般の機関によって承認。
- メデトミジン (0.15 mg/kg)、ミダゾラム (0.08 mg/kg)、フェンタニル (0.01 mg/kg) と麻酔カクテルを準備し、27 g 針付き 1 mL 注射器で筋肉内注入します。
-
手術の準備
- 腹部を陰部と肩甲骨のレベルに戻る地域などを含む、電気かみそりで剃る。
- 腹部を消毒、首の 70% エタノール最初とし 3 交互ボディス クラブ ポビドン ヨード溶液による地域。
3. 膀胱カテーテル注入
- 3 番目と 4 番目の乳頭 (長さ約 2 〜 2.5 cm) のレベルで低中間線手術を実行するには、皮膚や腹部の筋肉の手術用はさみのメスを使用します。
- 尾の方向に腹壁を導くことによって膀胱を公開し、この位置に再配置を避けるために膀胱、後ろに鉗子の背部を置くことによってそれを修正します。
- 6-0 の非吸収性のモノフィラメント縫合糸を用いたテーパ先端針膀胱ドーム周辺の巾着縫合を配置します。
- 財布文字列のメス チップまたは膀胱カテーテルを挿入するための 18 G 針で中の膀胱ドームを切開 (プロトコルの手順 1 を参照)。
- 滅菌生理 0.9% 塩化ナトリウム溶液が充填されたカテーテルを挿入し、カテーテルのフレアの開口部が膀胱ドームのすぐ下に配置されるまで、膀胱カテーテルを慎重に撤回します。
- カテーテル周囲巾着縫合をセキュリティで保護し、さらに固定のためのカテーテル体の周りストップ縫合。
- ゆっくりとカテーテルを膀胱を滅菌生理 0.9% 塩化ナトリウム溶液に充填によって膀胱ドーム経由で漏れを確認します。
4. 尿道括約筋を電極
- 3 つの電極を注入の準備 (プロトコルの手順 1 を参照)。
- 1 つの電極を将来 null 電極をさらに識別するために永久的なフェルトのカラーペンでマークします。70% エタノールで電極を消毒します。
注: カテーテルは、熱や化学滅菌に適しておりません。代わりに寒さは 24 時間電極を滅菌します。 - 恥骨の骨まで外科はさみで腹部の切開を拡張、恥骨をカットしないでください。
- 尿道を識別して、尿道の両側に微細鉗子を使用して鈍ポケットを作成、血管または神経の外傷を避けるため。
- このウィンドウ内で尿道の近くに適切な脂肪の袋を識別します。
- 6-0 の非吸収性のモノフィラメント縫合糸を使用して適切な脂肪ポーチの両側に電極を修正します。
注: 電極の最終的な位置は、尿道の中間領域で二国間する必要があります。 - 6-0 非吸収性のモノフィラメント縫合糸と共に 2 つの電極を結ぶ。
- 尿道の距離内で腹壁の筋肉にマークされた null 電極を縫合します。単一の縫合と共にすべての 3 電極を結ぶ。
5. トンネル
- トンネルの肩甲骨の間の小さな皮膚切開を行います。
- 首に電極線をトンネルし正しい配置は、最終的なチェックを行うトンネル後電極の位置を確認してください。
- トンネル膀胱カテーテル肩甲骨レベル - 膀胱のねじれを避けるためにカテーテルをトンネリングしながら膀胱に注意を払う。この目的のためには、膀胱のねじれを避けるために膀胱ドームに入る前にカテーテルを保持します。
- 4-0 polyfilament 吸収性縫合糸でステッチを連続または断続して腹筋を閉じます。中断されたマットレス縫合で皮膚切開を閉じる。
- 電極ワイヤとカテーテルの最大膨満を持っているその完全な長さに動物をストレッチします。
- 肩の筋肉に撃沈で縫合糸でカテーテルと電極ワイヤーを修正します。
- 4-0 縫合糸で単一ステッチして皮膚を閉じます。
6. ハーネス フィット
- 動物にハーネスに合わせて動物の頭の上のハーネスを引っ張ると 2 つのシリコン ストリップ間終了位置に前肢を引き出します。ディストリビューターと手術前に動物の重量によってハーネス サイズを確認します。
- トンネル ハーネスやドリルによるカスタムメイド スルーホール電極の中央の穴に膀胱カテーテル電極線のサイズに合わせて調整します。
- シリコン ストリップを引いてハーネスを調整します。それがあまりにも緩んでいないのでハーネスを調整するが、ラットの運動能力を維持するためにいくつかのスペースを確保します。
- ケーブルス トラップを使用して、シリコン ストリップを修正します。
- 膀胱カテーテルの長さをハーネスの上 3 cm にカット、23 G ストッパーに接続し、最後にハーネスにそれを修正します。
7. コネクタの電極の製造
- 3 つの小さい熱収縮チューブ (null の電極の色違い) を準備します。適切なサイズの 2 つのさらに熱収縮チューブを準備します。
- 後女性のプラグで接続される緩すぎる、または短すぎることがなくできるように最適な長さに電極線の長さを短きます。3 本のワイヤー (約 2 mm) のテフロン絶縁材を除去し、文字列に鋼線をねじる。
- すべてのワイヤに大入熱収縮チューブをかぶせます、個別に 3 線の小さなチューブを配置し、null 電極の色チューブを使用します。
- 男性 3 接続プラグ電極をはんだ付けします。途中で null の電極を置き、3 つ小さな個々 のチューブ上はんだ付けの領域を縮小します。
- 男性プラグ国境に最初の個々 のチューブの語尾の終わりに大きいチューブと最終的な大型管を縮小します。
- 男性プラグをさらに安全のためテープの部分にはハーネスと修正固定メスのコネクタに接続します。
8. 手術後ケア
- 外科領域をきれいにし消毒ポビドン ヨード剤。
- 加熱パッドまで目を覚ましに動物を置き、中および手術後ローカル動物のケアのガイドラインに基づいて水置換の 0.9% 塩化ナトリウム溶液を与えます。
- 鎮痛薬を管理 (メロキシカム 1 mg/kg) と抗生物質 (sulfadoxinum 200 mg、trimethoprimum 40 mg、15 mg/kg) 複合注入剤として皮下。1 日 2 回 (朝と夕方)、鎮痛剤を与えるし、1 日 1 回その後の 5 日間の抗生物質を与えます。
- 週 2 〜 3 注射で全くフォロー アップの期間にわたって同じ用量で抗生物質を続行します。
- ハーネスの適切なフィットを毎日チェックし、首の地域の特に、外科分野の検査を実行します。シリコン ストリップで慎重に引いて、きつすぎる場合は、ハーネスを調整します。
- 封鎖を避けるために週に 1 回定期的にカテーテルをフラッシュします。
9. 内圧測定のための準備
- 術後 6 日後最初の内圧測定を実行します。
注: 以前の測定値は、カテーテル留置による鎮痛薬および/または尿路炎症によって影響されます。 - メイン スイッチ、コンピューター、および筋電アンプをオンにします。
- 暖められた室温 0.9% 塩化ナトリウムとシリンジ ポンプを入力します。ポンプから始まって降順な他の後三方コネクタの 1 つを開き、チューブをフラッシュします。
メモ: は、気泡内圧測定が変更されますと残りの空気泡のため慎重に確認します。
10. 校正
- プログラムした尿流計ソフトウェアを起動し、調整に行きます。
- ポンプや動物に三方コネクタを閉じます。
- 接続されている圧力計バルブを開き、プログラムで 0 を押します。
- 100 mmhg の圧力計で圧力を調整し、プログラムで 100 mmHg のボタンを押します。プレスは、キャリブレーションを保存することを確認します。ウィンドウは自動的に閉じます。
- 圧力計バルブを閉じて、測定の準備を動物にポンプから三方コネクタを開きます。
11. 動物データベース (動物 DB)
- 動物を登録するには、動物に簡潔な ID を付けます
- SCI、治療の開始、カテーテル注入、実験グループ、および動物の誕生日の日付の日付など、さらにデータを入力します。
- 最後にデータを記録して、「記録保存」を押して、ファイルに保存します。
12 記録前にの計測設定
- ソフトウェア プログラムを起動するには、スタート ボタンを押します。
- 動物を選択し、押します風袋スケールと圧力ゼロ。
注: これは EMG ケーブルのワイヤーの除去につながる可能性が、ケーブルを立ち往生しないように、落に動物を配置しながら注意を払う。
13 動物の準備
- カテーテル プラグを取り外し、ハーネスから EMG プラグを取り外します。
- ラットは、落します。落を閉じて、クランプでハーネスをロックします。
- カテーテルと、落から EMG プラグを得る。
- キャタ マウント ユニットに、落を配置します。管内尾を入れて、動きを避けるためにテープでチューブを修正します。
- 男性の EMG プラグを録音 EMG メスコネクタに接続します。
- 圧力ゼロをもう一度押すし、充填/記録管にカテーテルを接続します。ソフトウェア内の圧力をチェックします。
注: 圧力は、5-10 cm H2O ベースラインでまわりで肯定的にはずです。圧力が負の場合は、カニューレからカテーテルを切断、圧力ゼロを押して、カテーテルを再接続します。
14. 記録
- カテーテルと筋電図のケーブルが接続されている場合は、実行ポンプと記録を押します。
- Μ L/分で実験ニーズに充填速度を適応します。
- 時間をメモ録音開始、ログ帳に部屋の温度。
- 膀胱内圧測定の記録を停止するには、実行を押すとポンプによってポンプを停止し、もう一度録画を押します。
注: オフ、ポンプになります、ポンプで緑色のライトがオフになっています。 - カテーテルを外し、カテーテルの端を閉じるに 23 G ストッパー プラグを使用します。EMG のケーブルを外します。
- 落の前面を開き、落からラットをガイドします。
注: はラットを慎重に処理し、ケーブルのロックを避けるためにワイヤーを監視します。 - ハーネスにカテーテルを差し込みます。再プラグ、ハーネスに EMG プラグとプラグの周りのテープの部分を置きます。
注: 動物に下部尿路の病態がある場合は、膀胱の overdistention を避けるために手動で最後に膀胱を表現します。 - その家のケージに動物を入れてください。
- 押すと終了してプログラムを閉じます。
- きれいに落とビーカー。
- ポンプと動物のコンセントに 3 ウェイ コネクタを閉じます。
- コンピューター、筋ユニットとメイン スイッチを使ってシステムをシャット ダウンします。
注: データが測定ラット ID のサブフォルダーのファイルを「ログ データ」の別のフォルダーに保存されます。単一の記録は単一のラットの ID フォルダー日付で並べ替えられます。
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Representative Results
目を覚まし内圧測定のプロセスを示す回路図は、図 1に示したが、膀胱カテーテル留置の内部解剖学は図 2に示します。手術は約 2 h. 術後鎮痛と抗生物質、前述のプロトコルでは、カバー痛みと感染症手術後 5 日間。のどの痛みの兆候は見られなかったその後。腹部、腹部の縫合と首の縫合の 1 日 2 回の綿密な検査は動物の健康を維持するために必要です。ハーネス制御 (位置と堅さ) は最初の 5 日後に定期的に 1 日 1 回実施しなければなりません。腹部の縫合糸は、術後 10 日で削除できます。
我々 は炎症を避けるために手術後最初の 10 日間のソフト、非木質の寝具を使用します。寝具は、炎症のリスクを下げるに週に少なくとも 2 回が変更されます。グループ住宅電極やカテーテル、ハーネス ケーブル ケージ仲間でかむことのリスクが増加、動物が単一の住宅に保持されます。
カテーテルは、少なくとも週に一度、内圧測定の過程で、または低い注入速度 (図 3) で無菌の 0.9% 食塩の 1-3 mL で手動でカテーテルをフラッシュでフラッシュする必要があります。さらに動物についての通常抗生物質感染症や尿路結石のリスクが減ります。監視の流体の摂取は、尿路結石を防ぐためにさらに主要なポイントです。低濃度 (2-3%) のクエン酸は、投与されるいずれかの膀カテーテルを介してまたは結石の形成を防ぐために水を飲む。
膀胱カテーテルと電極を維持したままと同様、手術の成功率は約 80% です。場合の残りの 20% では、主な問題は、プラグから電極線の剥離は。したがって、ハーネスに電極線の慎重な添付ファイルは電極損失を避けるために重要です。
内圧測定は、測定は、不安と処理ラットの状態に応じて、20 に 40 分間あたり 3 つの連続した排尿サイクルが記録されますまでに通常行われています。最初の内圧測定は通常カテーテル留置手術後 1 週間を行います。
膀胱内圧測定記録の主な読み出す」パラメーターがベースライン圧、閾値圧力、最大排尿筋圧、排尿量、流量、排尿時間、平均圧力、膀胱のコンプライアンスとのうち同時読み取り、外尿道括約筋筋電図 (図 4)。
手術後、少なくとも 4 週間のフォロー アップ期間における連続内圧測定を実行できます。カテーテル ラインが定期的にフラッシュされ、カテーテル閉塞には問題はありません。ラットの通常処理と光制御は、全体のフォロー アップ期間中に実施されなければなりません。
場合はカテーテルは折れ目やブロック、膀胱内圧 (100 cm H2O) 以上の超高圧まで直線的に増加されます。この場合、充填を停止する必要があります、屈曲のため表示されているカテーテルの端をチェック必要があります。きんく性を認めず、カテーテルはブロック コンセントを調べる必要があります。この目的のため、カテーテルをすることができます手動でフラッシュを介してカテーテル。膀胱内に流体を簡単に流れていない前後軽く引きが試みたことができます。1 つの最後の試みのカテーテル内閉塞領域をオフにしようとする酸性洗浄溶液 (クエン酸 2-3%) を使用できます。このソリューション、封鎖を解消する高いチャンスがある可能性がありますまだ、膀胱が正常にフラッシュした後イライラするし、連続測定は酸性溶液で洗浄後 2 日間を実行する必要があります。膀胱に液体をフラッシュするない場合、カテーテルが完全にブロックされているし、さらに測定が可能なない動物がフォロー アップに失われました。
図 1: 覚醒ラットで膀胱内圧測定測定模式。この図は2から適応されています。(は) 尿流動態検査セットアップの図。(b) 尿流動態検査のため実習ステーション。(c) 注入外尿道括約筋筋電図の電極は、尿道、術中ビューに水平します。(d), 術中膀胱カテーテル移植の時点で膀胱ドームのビュー ビュー。(e) 注入電極やカテーテル、ラットはプラグとコネクタを安全に格納するハーネスを搭載する後。(f) 人間の排尿。B ~ eの数値は、伝説に関連します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ラット膀胱カテーテル注入用の内部解剖学.この図は、8から変更されています。
図 3: ラットのカテーテル ラインのフラッシングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 尿カテーテル留置後 12 日動物のトレース。素朴なラットからトレースを (、) 代表尿流動態検査します。トップで分泌尿重量トレース中と下にある外尿道括約筋筋電図トレース膀胱圧トレースが表示されます。(b) 60 の素朴な動物からズーム ウィンドウ s、(、) から撮影します。重要な発言は、排尿の前後により排尿時に以下の外部尿道括約筋筋電図活動があることです。トップで分泌尿重量トレース中と下にある外尿道括約筋筋電図トレース膀胱圧トレースが表示されます。下部には、一致する周波数スペクトロ グラム (現在の時点での周波数に対応する) 熱プロットが表示されます。赤は高出力を表し、青は低消費電力を。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルを記述する永続的なカテーテルと尿道括約筋を電極と膀胱内圧測定記録し、目を覚まし、軽く拘束されたラットの膀胱の両方同時分析を含む技術の手術と外尿道括約筋。
外科の中に重要なステップは、漏れや広範な操作を避け、膀胱カテーテルの注意注入です。さらに、尿道括約筋に両側の電極の精密な注入は外尿道括約筋の音響計測に不可欠です。注入後外科分野の密接な検査も動物の健康を維持するために不可欠です。経過観察中に抗生物質のカバレッジは、尿路感染症の発生と同様、カテーテル ラインに沿って感染防止に役立ちます。
内圧測定中に処理されたラットが以前処理できなかったラットよりリラックスして穏やかになります。したがって、膀胱内圧測定記録はその結果で異なる場合があります。また、落はラットより快適に暗いフロント エリアと拘束空間を提供しています、したがって、ストレス レベルを低減します。他公開されて目を覚まし内圧測定のラットは測定ケージで自由に移動できます。ただし、これは測定時に高いアーチファクト リスクを負う、記録、また動物のストレス レベルの時間を増やす可能性があります。健康なネズミに最適な内圧測定は複数の測定時点で経過観察中にレプリケートできます。内圧測定中に一般的に発生する問題は、屈折カテーテルまたはプロトコルの段階的伝導の間違いです。技術またはソフトウェア エラーが発生した場合のトラブルシューティングに内圧測定とプロトコルの段階的な繰り返しの再初期化をおいてください。
この手法の限界は、この組織の組織学的または分子の生物学的検査を妨げる可能性があります、注入カテーテルにより膀胱組織の構造変化、膀胱内圧測定記録の動物間の変動フォロー アップの期間の間に動物の単一の住宅。さらに、この手法は、雌ラットでテストされており、適用性とラットの結果まだ行った。
この手法の主な利点は、目を覚まし測定設定と同様に、膀胱と外尿道括約筋の同時測定です。したがって、目がさめている動物における下部尿路より並進検討は麻酔5,6,9,10のシングル、ターミナルの膀胱内圧測定解析と比較して、利用可能です。また、このアプローチでは、下部尿路機能障害または病理学の進行続くことができる同じ動物の処置の成功と同様、時間に。特に、一般的な膀胱内圧測定法2を最大限することが可能ではなかった時間のコースで NLUTD を調べることができます。
結論としては、提示された手術と膀胱内圧測定測定は覚醒ラットで膀胱と外尿道括約筋との相互作用を含む下部尿路の複数、アーチファクト低減の解析に使用されます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者には、任意の受信確認がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing PE 50 | Becton Dickinson | 427411 | Catheter |
| Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c) | Ethicon | EH7403H | Suture |
| Teflon coated steel wire | Cooner wire | AS631 | Electrode material |
| Silver wire 0.250 mm | World Precision Instruments | AGW1030 | Electrode material |
| Rotilabo - PVC tube | Carl Roth | 97241 | Harness |
| Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c) | Ethicon | V4940H | Suture |
| Quick Connect Single Harness | SAI Infusion Technologies | QCH-23CW | Harness |
| Shrinking tubes | ChiliTec | 17894 | Electrode soldering |
| Soldering wire Pb60 Sn40 | Stannol | LD0029 | Electrode soldering |
| Fluxing agent 157 | Castolin Eutectin | 157 0150 | Electrode soldering |
| Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box | Preci-dip | 801-87-050-10-001101 | Electrode soldering |
| Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box | Preci-dip | 890-18-003-10-001101 | Electrode soldering |
| Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis) | Catamount Research and Development Inc. | CAT-CYT-R | |
| Differential amplifier with active headstage | AD instruments | DP-311 | EMG amplifier |
| Restrainer Medium size for rats 200-300 g | emka Technologies | HLD-RM | |
| Uro Dyn Software | Zürich of University | MTA-based | |
| Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age | Charles River, Sulzfeld, Germany | animals |
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