Summary
Vi presenterer en protokoll for dobbel thymidine synkronisering av HeLa celler etterfulgt av analyse med høy oppløsning AC confocal mikroskopi. Denne metoden er nøkkelen til å få store antall celler som videre synkront fra S fasen til mitose, aktivere studier på mitotisk roller multifunksjonelle proteiner som har interphase funksjoner.
Abstract
Studien av forskjellige regulatoriske hendelsene i cellen syklus i en fase-avhengige måte gir en klar forståelse om cellevekst og deling. Synkroniseringen av celle populasjoner på bestemte stadier av celle syklus har funnet for å være svært nyttig i slike eksperimentelle bestrebelser. Synkronisering av celler av behandling med kjemikalier som er relativt mindre giftige kan være en fordel over bruken av farmakologiske hemmende narkotika for studiet av påfølgende celle syklus hendelser og hente bestemte anriking av valgte mitotisk stadier. Her beskriver vi protokollen for synkronisering menneskelige celler på ulike stadier av cellen syklus, inkludert både S fase og M fase med en dobbel thymidine blokk og slipp prosedyre for å studere funksjonaliteten til mitotisk proteiner i kromosom justering og segregering. Denne protokollen er svært nyttig for å studere mitotisk rollene multifunksjonelle proteiner som har etablert interphase funksjoner. I vårt tilfelle, kan mitotisk rollen som Cdt1, et protein som er kritiske for replikering opprinnelse lisensiering i G1 fase, studeres effektivt når G2/M-spesifikk Cdt1 kan bli tømt. Vi beskriver detaljert protokollen for uttømming av G2/M-spesifikke Cdt1 med doble thymidine synkronisering. Vi forklare protokollen for cellen fiksering, og live celle bildevisning høyoppløselig AC confocal mikroskopi etter thymidine. Metoden er også nyttig for å analysere funksjonen mitotisk proteiner under både fysiologiske og plaget forhold som for Hec1, en komponent i Ndc80 komplekset, som det gjør det mulig å få store utvalgene mitotisk celler for faste og levende celle analyse som vi viser her.
Introduction
I celle syklusen gjennomgå celler en rekke sterkt regulerte og timelig kontrollert hendelser for nøyaktig duplisering av sine genom og spredning. I pattedyr består celle syklus av interphase og M-fase. I interphase, som består av tre stadier - G1, S, og G2, cellen dubletter dens Genova og gjennomgår vekst som er nødvendig for normal celle syklus progresjon1,2. I M-fasen, som består av mitose (prophase, prometaphase, metaphase, anaphase og telophase) og cytokinesis, produserer en overordnet celle to genetisk identisk datter celler. Ved mitose, søster chromatids av dupliserte genom er knepet (prophase) og er fanget på deres kinetochores av piskehale som henger av sammensatte mitotisk spindelen (prometaphase), som driver justeringen på metaphase platen (metaphase) etterfulgt av deres lik segregering når søster chromatids er splittet mot og transportert til motsatt spindel polakker (anaphase). De to datter cellene er fysisk atskilt med aktiviteten til en utgangen-baserte kontraktile ring (telophase og cytokinesis). Kinetochore er en spesialisert proteinaceous struktur som samler på centromeric regionen chromatids og tjene som vedlegg nettsteder for spindel piskehale som henger. Dens viktigste funksjon er å kjøre kromosom fange, justering, og hjelpe til rette feil spindel microtubule vedlegg, mens formidling spindelen montering kontrollpunktet for å opprettholde gjengivelsen av kromosom segregering3,4.
Teknikken for celle synkronisering fungerer som et ideelt verktøy for å forstå molekylære og strukturelle hendelsene i cellen syklus progresjon. Denne tilnærmingen er brukt til å berike celle populasjoner i bestemte faser av ulike typer analyser, inkludert profilering av genuttrykk, analyser av mobilnettet biokjemiske prosesser og påvisning av subcellular lokalisering av proteiner. Synkroniserte pattedyrceller kan brukes ikke bare for studiet av personlige genet produkter, men også for tilnærminger som involverer analyse av hele genomer inkludert microarray analyse av gene expression5, miRNA uttrykk mønstre6, translasjonsforskning regulering7og proteomic analyse av protein modifikasjoner8. Synkroniseringen kan også brukes til å studere virkningene av genuttrykk eller protein sammenleggbare eller knock-out eller kjemikalier på cellen syklus progresjon.
Cellene kan synkroniseres på de ulike stadiene av celle syklus. Både fysiske og kjemiske er mye brukt for cellen synkronisering. De viktigste kriteriene for cellen synkronisering er at synkroniseringen skal noncytotoxic og reversibel. På grunn av potensielle negative mobilnettet konsekvensene av synkronisering celler av farmakologiske agenter, kan kjemisk-avhengige metoder være fordelaktig for å studere sentrale celle syklus hendelser. For eksempel hydroxyurea, amphidicolin, mimosine og lovastatin, kan brukes for cellen synkronisering på G1/S fase men, på grunn av deres effekt på biokjemiske veier de hemmer, de aktivere cellen syklus checkpoint mekanismer og drepe en viktig brøkdel av celler9,10. På den annen side, kan tilbakemeldinger hemming av utryddelse ved å legge thymidine til vekst medier, kjent som "thymidine blokken", arrestere cellen syklus på enkelte punkt11,12,13. Cellene kan også synkroniseres på G2/M fase ved å behandle med nocodazole og RO-33069,14. Nocodazole, hvilke forhindrer microtubule montering, har en relativt høy cytotoksisitet. Videre nocodazole-arrestert celler kan gå tilbake for å interphase precociously av mitotisk glidning. Dobbel thymidine blokk arrestasjonen celler på G1/S fase og etter utgivelsen fra blokken, celler er funnet for å fortsette synkront gjennom G2 og mitose. Normal progresjon av cellen syklus for cellene utgitt av thymidine kan observeres under høy oppløsning AC confocal mikroskopi celle fiksering eller live bildebehandling. Effekten av forstyrrelsene mitotisk proteiner kan studeres spesielt når cellene inn og Fortsett gjennom mitose etter utgivelsen av dobbel thymidine. Cdt1, en multifunksjonell protein, er involvert i DNA replikering opprinnelse lisensiering i G1 fase og er også nødvendig for kinetochore microtubule vedlegg under mitose15. For å studere funksjonen til Cdt1 under mitose, trenger man å vedta en metode som unngår effekten av sin uttømming på replikering lisensiering i G1 fasen samtidig påvirker sin uttømming spesielt i G2/M fasen bare. Her presenterer vi detaljerte protokoller basert på dobbel thymidine blokken å studere mitotisk rollen av proteiner utføre flere funksjoner i ulike stadier av celle syklus av både faste og live-celle tenkelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dobbel Thymidine blokk og Release: reagens forberedelser
- Gjør 500 mL Dulbecco endret Eagle medium (DMEM) medium med 10% FBS, penicillin og streptomycin.
- Gjøre 100 mM lager av thymidine i sterilt vann og butikken i dele på-80 ° C.
2. protokoll for fast celle Imaging av mitotisk progresjon (figur 1A)
- På dag 1, frø ~ 2 x 105 HeLa celler i brønnene av en 6-vel plate med en cover slip (steriliseres med 70% etanol og UV bestråling) og 2 mL av DMEM medium. Vokse cellene i en fuktet inkubator 24 h 37 ° C og 5% CO2.
- 1st thymidine blokk: på dag 2, grundig blande nødvendig volumet av thymidine i frisk DMEM media (100 mM lager, 2 mM endelige konsentrasjon).
- Legge til 2 mL thymidine inneholder medier til cellene i hver brønn av 6-brønnen plate og ruge 18 h.
- Dag 3, Sug opp mediet og vask cellene to ganger med 2 mL 1 x PBS og gang med fersk prewarmed DMEM; vokse celler i frisk prewarmed DMEM medium for 9 h å løslate celler fra blokk.
- 2nd thymidine blokk: igjen legge 2 mL thymidine inneholder medier (2 mM endelige konsentrasjon) til cellene i hver brønn av 6-vel plate.
- Inkuber en annen 18 h.
- På dag 4, Sug opp mediet og vask cellene to ganger med 2 mL 1 x PBS og gang med fersk prewarmed DMEM.
- Fortynne siRNAs (kontroll og Cdt1) og hva reagens i serum gratis vekst medium separat for 10 min. bland dem sammen og Inkuber etter 20 min på RT. Siste konsentrasjonen av siRNA i hver transfection var 100 nM. Legge til reaksjonsblandingen cellene som har blitt vasket ut av Thymidine.
- Inkuber cellene på 37 ° C for 9-10 h å frigi fra sperring og fikse cellene på dekselet papirlapper med 4% PFA etter 20 min på RT.
Forsiktig: PFA er giftig, ha passende beskyttelse. -
Immunostai celler, etter permeabilizing med 0,5% (v/v) vaskemiddel i 10 min på RT og vaske cellene to ganger med 1 x PBS i 5 min.
- Blokkere celler med 1% BSA (w/v) i 1 x PBS 1t på RT etterfulgt av behandling av celler med 50 µL av primære antistoffer (mus anti-α-tubulin antistoff utvannet på 1:1, 000, kanin anti-Zwint1 antistoff utvannet på 1:400, og mus anti-phospho-glottal H2AX utvannet på 1:300) i 1% (w/v) BSA på 1 x PBS 1t på 37 oC.
- Etter vask ut cellene med 1 x PBS tre ganger, behandle celler med 50 µL av sekundær antistoffer for hvert cover glass (Alexa 488 og Rhodamine rødt i 1:250 fortynninger i 1% (w/v) BSA på 1 x PBS) 1t på RT.
- Etter vask cellene med 1 x PBS to ganger i 5 min, behandle celler med DAPI (0.1µg / mL i 1 x PBS) i 5 min på RT.
- Etter vask cellene med 1 x PBS to ganger i 5 min, plassere cover slip overfor celler til riktig montering media på et klart mikroskopiske lysbilde.
- Bilde celler for immunostained proteiner med 60 X eller 100 X 1.4 NA Plan-Apochromatic DIC oljeobjektiv nedsenking montert på en invertert høyoppløselig AC confocal mikroskop utstyrt med en riktig kamera som er nødvendig for kvaliteten på bilder kreves.
- Hente bilder ved romtemperatur som z-stabler av 0,2 µm tykkelse ved hjelp av programvare passer for mikroskopet.
3. protokoll for levende celle Imaging av mitotisk progresjon (figur 3A)
- På dag 1, frø ca 0,5-1 x 105 HeLa celler uttrykke stabilt mCherry-H2B og GFP-α-tubulin (litt variabel basert på celle type og proteiner de uttrykker) i 35 mm glass bunn retter med 1,5 mL av DMEM medium og dyrke dem i en fuktet inkubator 24 h 37 oC og 5% CO2.
- 1st thymidine blokk: på dag 2, legger du til 1,5 mL thymidine inneholder medier til cellene i parabolen (100 mM thymidine, 2 mM endelige konsentrasjon,).
- Inkuber 18 h.
- Dag 3, Sug opp mediet som inneholder thymidine og vask cellene tre ganger, to ganger med 2 mL 1 x PBS og med frisk prewarmed DMEM.
- Fortynne siRNAs (kontroll og Hec1) og hva reagens med serum gratis vekst medium separat for 10 min. bland dem sammen og Inkuber etter 20 min på RT. Siste konsentrasjonen av siRNA i hver transfection var 100 nM. Legge til reaksjonsblandingen cellene som har blitt vasket ut av Thymidine.
- Vokse celler i 1,5 mL av fersk prewarmed DMEM medium 8 h å løslate celler fra blokk.
- 2nd thymidine blokk: legge til 1,5 mL thymidine inneholder medier (2 mM endelige konsentrasjon) til cellene i fatet.
- Inkuber en annen 18 h.
- På dag 4, Sug opp mediet og vask cellene tre ganger, to ganger med 2 mL 1 x PBS og med frisk prewarmed DMEM. Da vokse celler i frisk prewarmed Leibovitz er (L-15) medium supplert med 10% FBS og 20 mM HEPES ved pH 7.0 8 h å løslate celler fra blokken.
- Plass rett i temperatur kontroll kammeret i høy oppløsning AC confocal mikroskop som har allerede slått på minst 30 min før du begynner imaging for å stabilisere temperaturen på scenen og eksperimentelle.
- Fokusere lys innen 60 x målet til celler er synlige, og manuelt sile de på scenen i regionen valgfrihet.
- Sette opp lys og laser makt/eksponering, oppkjøp bildeparametere og varigheten av forsøket ved hjelp av mikroskop bilde oppkjøpet programvare av valget. Bruke filtre for GFP (488 eksitasjon, 385 nm utslipp) og mCherry (561 nm eksitasjon og 385 nm utslipp) hente bilder.
- Utføre time-lapse eksperimentet ved separat anskaffe pulserende lyset og fluorescens bilder hvert 10 min for en periode opptil 16 h.
- Hente bilder som tolv 1.0 µm atskilt z-fly på 9 h etter utgivelsen av den doble thymidine bruker programvare passer til mikroskopet.
- Analysere bildene spore individuelle celler for mitotisk progresjon og endelig montere tilsvarende filmen med kildekode Fiji/ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studien mitotisk progresjon og microtubule stabilitet i celler fast etter utgivelsen fra dobbelt thymidine blokk
Cdt1 er involvert i lisensiering av DNA replikering opprinnelse i G1 fase. Det er dårligere i S fasen men re er akkumuleres i G2/M fase. For å studere sin rolle ved mitose, må den endogene Cdt1 bli tømt spesielt på G/M fasen ved hjelp av egnede celle synkronisering teknikk, dobbel thymidine blokk15. Cellene ble transfekterte med siRNAs umiddelbart etter utgivelsen fra 2nd thymidine blokken, når cellene er i S fase og da lisensiering av replikering opprinnelse i G1, som også krever Cdt1 funksjonen, har lenge blitt fullført. Uttømming av Cdt1 etter 9 h siCdt1 hva og dobbelt thymidine blokk utgivelsen ble godkjent av vestlige blotting (figur 1B). Fiksering av celler 9 h etter utgivelsen av den doble thymidine viser at de fleste cellene er på metaphase scenen i både kontrollen og Cdt1 siRNA transfekterte celler. Men fiksering av celler 10t etter utgivelsen av den doble thymidine viser at de fleste Cdt1 siRNA-behandlet celler er fortsatt arrestert i sent prometaphase stadium mens kontroll celler angi anaphase og normalt skille sine kromosomene som forventet (figur 1 c ). For å forstå effekten av Cdt1 uttømming på kinetochore-microtubule (kMT) stabilitet, var celler fast på 9 h etter å ha dobbelt thymidine blokk etterfulgt av kalde behandling, som bare beholder stabil kinetochore-piskehale som henger (kMTs). KMTs Cdt1-utarmet celler er relativt mindre robust etter kalde behandling sammenlignet med kontrollen celler (figur 1 d). Dermed kan bruker denne tilnærmingen, progresjon på normale mitotisk celler etter forstyrrelsene av den mitotisk protein(s) rundt studeres effektivt, selv uten bruk av levende celle bildebehandling.
Figur 2 viser at lisensiering DNA replikering opprinnelsesland ikke er opprørt når celler blir utarmet av Cdt1 i G2/M fasen bruker våre protokollen, som ble også observert i kontroll celler. Celler utarmet av Cdt1 i G2/M fasen ikke få opphopning av fosforylert ɣH2AX, en markør for DNA skade, under påfølgende G2 fase; mens siRNA transfection asynkron kulturer å tømmes Cdt1 indusert opphopning av phospho-ɣH2AX-positiv foci, muligens på grunn av DNA skade forårsaket av uriktig DNA replikering lisensiering.
Studie av mitotisk progresjon i cellene etter utgivelsen av dobbel thymidine av levende celle tenkelig
Etter kjernefysiske konvolutten nedbryting (NEB), normale celler (i fravær av forstyrrelsene ved en funksjonell mitotisk protein) Angi mitose og gjennomgå anaphase utbruddet å avslutte mitose i ca 30-60 min (figur 3B). Men RNAi-mediert knockdown av Hec1, en nøkkel kinetochore protein som er nødvendig for robust kMT vedlegg formasjon, er funnet for å utsette vanlige mitotisk progresjon. I dette scenariet de fleste cellene angir mitose etter NEB, men ikke gjennomgå anaphase utbruddet eller avslutte mitose selv etter flere timers forsinkelse ved mitose (Figur 3 c). Tilsvarende kan effekten av RNAi-mediert knockdown andre protein som regionaliserer kinetochores eller har en funksjon under mitose dermed observeres effektivt ved hjelp av levende celle avbildning etter utgivelsen fra dobbel thymidine blokker. I tillegg studerte natur mitotisk progresjon, forsinkelse, og arrestasjon, noen av de andre viktige mitotisk fenomenene som kan være assayed med denne metoden inkluderer kromosom justering, mitotisk spindel formasjon, og posisjonering aktivering og stanse den spindelen montering checkpoint.
Figur 1: analyse av mitotisk progresjon og stabiliteten i kinetochore piskehale som henger i fast celler etter dobbel thymidine synkroniseringen. (A) A skjematisk fremstilling av cellen synkronisering, fiksering og immunofluorescence. (B) Western blot for knockdown av Cdt1 etter 9 h av utgivelsen av 2 thymidine. (C) Immunofluorescence micrographs å vise mitotisk cellene fast 9 og 10 h etter utgivelsen fra dobbel thymidine blokk og behandling med (øverst) eller Cdt1 siRNA (nederst). Α-tubulin flekker er i rødt, DNA er i grønne celler uttrykke GFP-Histone H2B. Skala bar = 10 µm. Prometaphase og metaphase celler angis med gule og hvite pilspisser henholdsvis. (D) HeLa celler etter behandling med kontroll siRNA (topp panel) og etter Cdt1 nedbryting (nedre panelet) 9 h etter å ha dobbelt thymidine blokk etterfulgt av behandling med iskald Leibovitz's (L-15) medium og fiksering. Celler var immun-farget for spindel MT (grønn) og en kinetochore, Zwint1 (rød) og DAPI for DNA i svart-hvitt. Skala bar = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Cdt1-uttømming i G2/M fasen ikke forurolige replikering lisensiering. Asynkron HeLa cellene behandlet med kontroll luciferase (toppanelet) eller cdt1 siRNAs (midten panel) eller doble thymidine synkroniseres HeLa cellene behandlet med cdt1 siRNA under 2nd thymidine vaske-out etterfulgt av fiksering på 10 h etter utgivelsen (nedre panelet) var farget med DAPI (pseudo farget grønn) og anti-phospho-ɣH2AX antistoff (rød). Skala Bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av mitotisk progresjon av levende celle bildebehandling i synkronisert celler. (A) A skjematisk fremstilling av cellen synkronisering og levende celle bildebehandling. HeLa celler uttrykke stabilt mCherry-Histone H2B og GFP-α-tubulin ble løslatt fra dobbel thymidine blokk for 8 h å la dem gå til G2/M fase fra S fase arrestasjon. Live bildebehandling ble gjennomført med høy oppløsning AC confocal mikroskop fra 8 timer etter slippe cellene fra thymidine blokk og fortsetter for opptil 16 timer fra det punktet. Her vises stillbilder fra video fanget hvert 10 min kontroll celler uten forstyrrelsene noen mitotisk protein (B) eller celler utarmet av Hec1 delenhet i Ndc80 kompleks (C). Skala barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigste fordelen med doble thymidine synkronisering er at det gir en økt utvalgsstørrelsen mitotisk celler i et kort tidsvindu med mange av disse cellene inn mitose unisont, dermed muliggjør også analyser av kromosom justering, bipolar vri dannelse og kromosom segregering med mye høyere virkningsgrad.
Mange regulatoriske protein komplekser og signalveier er viet til å sikre normal fremdrift gjennom mitose og dereguleringen av denne prosessen kan førte til tumorigenesis. Live celle imaging HeLa celler stabilt uttrykke mCherry-H2B og GFP-tubulin og løslatt fra de doble thymidine viser at de fleste kontroll cellene skille sine kromosomene på anaphase innen ca 60 min etter NB (figur 3B). På den annen side, live celle imaging HeLa celler plaget med Hec1 funksjonen viser at de fleste cellene bo i mitotisk fase en lang periode med feiljustert kromosomene etterfulgt av anaphase utbruddet eller apoptose (Figur 3 c).
Overflødig thymidine hemmer DNA-syntese i fasen for S dermed blokkerer cellene på G1/S fase11. Selv om dobbelt thymidine blokk synkronisering er mest brukte metoden i studiet av i cellen syklus og mitotisk progresjon, må man være kritisk til noen av begrensningene for denne metoden. Viktigst, må det sikres at kjemiske har blitt vasket grundig (for 7-8 h) slik at effekten er fullstendig reversibel og celler kan gå som normalt gjennom resten av cellen syklus. Cellene kan ellers ikke inn andre syklusen forårsaker feil progresjon selv mitose. Andelen synkronisert celler kan ikke være tilstrekkelig høy med en enkelt thymidine blokk og en dobbel thymidine blokk kan være nødvendig å øke antall synkroniserte celler, spesielt hvis man er interessert i å studere et bestemt stadium av mitose. Varigheten av thymidine behandling må være optimalisert på grunn av ulike følsomhet blant celletyper avhengig generasjon. For eksempel hamster celler har 16 h genereres og behandles med thymidine 11 h for optimal synkronisering17. I denne studien behandlet vi HeLa celler for 16-18 h med thymidine. Videre kan den overskytende thymidine ikke bare hindrer DNA-syntese men også drepe viktige deler av celler11,12,18 og lukke oppmerksomhet må betales til å overvåke dette tapet. Thymidine lager løsningen brukt i denne studien bør være forberedt i sterilt destillert vann og bør blandes grundig i celle kultur media å unngå sin nedbør etter å legge det til media av siRNA transfekterte celler og også for å sikre sin homogen distribusjon rundt kulturperler cellene.
For å studere funksjonen av et mål mitotisk protein under mitotisk progresjon, skulle ideelt cellene behandlet med siRNA til knockdown nivåene av protein av interesse under 1st thymidine blokken eller under utgivelsen i 1-St thymidine blokken, avhengig av tiden det tar å få effektiv protein knockdown19,20,21. På den annen side, for å studere rollen til multifunksjonelle proteiner som Cdt1 under mitose, er det nødvendig å behandle cellene med siCdt1 under utgivelsen fra 2nd thymidine blokken hente G2/M bestemt uttømming. Cdt1 er en viktig aktør i lisensiering av DNA replikering opprinnelse15. For å forstå sin spesielle rolle under mitose uten å forstyrre dens rolle i lisensiering, trenger Cdt1 å bli tømt spesielt på G2/M fase, som kan oppnås effektivt doble thymidine synkronisering, dermed unngår behovet for å ty til andre mitose-spesifikke forstyrrelsene tilnærminger som er vanskelig å utføre. Nedbryting av Cdt1 i asynkron kulturer indusere DNA skade svar på grunn av avbrudd i lisensiering av DNA replikering opprinnelse, som ville i sin tur har forvirret analyse av en mulig funksjon for dette proteinet under mitose. Dermed gir dobbelt thymidine synkronisering teknikken en unik eksperimentelle tilnærming for å generere celler som gjennomgikk en normal G1 og S fase, men manglet Cdt1 funksjon i G2 og M fasen. Spesielle betydningen av våre synkroniseringen protokollen ligger i sin hemming av multifunksjonelle proteiner i en bestemt fase (G2/M) for å studere deres romanen funksjoner under mitose. Dermed vil denne metoden være nyttig ikke bare for å studere rollen av proteiner som har flere funksjoner under forskjellige cellen syklus faser, men også som noen mitotisk protein under kromosom justering, kMT vedlegg og kromosom raseskille.
For levende celle avbildning, etter utgivelsen av den doble thymidine, cellene skal være ruges i forvarmes Leibovitz's (L-15) medium supplert med 10-20% FBS til begynnelsen av tenkelig. Cellene angi mitose på variabel tidspunkt etter utgivelsen av thymidine avhengig celle. Starttidspunktet for avbildningsopptak eller fiksering må optimaliseres avhengig celle. For levende celle bildebehandling, kan utnyttelsen av konvensjonelle AC confocal mikroskopi forårsake photobleaching under langsiktige bildebehandling. På den annen side, gir høy oppløsning AC confocal microcopy en klar og høy oppløsning bildet med den minste grad av photobleaching effekter.
De avgjørende skritt i denne protokollen er varigheten av thymidine behandling, riktig bleke thymidine, tidspunktet for siRNA transfection og start tidspunktet for bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Dr. Kozo Tanaka Tohoku University, Japan for deling HeLa celler uttrykke stabilt mCherry-Histone H2B og GFP-α-tubulin. Dette arbeidet ble støttet av en NCI tilskudd til DV (R00CA178188) og oppstart midler fra Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A.
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
