बँटवारा के दौरान कार्यात्मक कोशिका चक्र प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए Mitotic सेल तुल्यकालन और उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप के संयोजन
Summary
हम उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण के बाद हेला कोशिकाओं के दोहरे thymidine तुल्यकालन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । इस विधि से बड़ी संख्या में कोशिकाओं है कि एस चरण से बाहर का बँटवारा करने के लिए आगे बढ़ना है, बहुआयामी प्रोटीन जो भी चरण कार्यों के अधिकारी mitotic भूमिकाओं पर अध्ययन को सक्षम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
Abstract
चरण-निर्भर तरीके से कोशिका चक्र की विभिन्न नियामकीय घटनाओं का अध्ययन कोशिका वृद्धि और विभाजन के बारे में स्पष्ट समझ प्रदान करता है । कोशिका चक्र के विशिष्ट चरणों में कोशिका की आबादी का तुल्यकालन ऐसे प्रायोगिक प्रयासों में बहुत उपयोगी पाया गया है. रसायनों के साथ उपचार के द्वारा कोशिकाओं के तुल्यकालन कि अपेक्षाकृत कम विषाक्त फलस्वरूप कोशिका चक्र की घटनाओं के अध्ययन के लिए औषधीय निरोधात्मक दवाओं के उपयोग पर लाभप्रद हो सकता है और चयनित mitotic चरणों के विशिष्ट संवर्धन प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं । यहाँ, हम सेल चक्र के विभिन्न चरणों में मानव कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, एक डबल thymidine ब्लॉक के साथ एस चरण और एम चरण में दोनों सहित और गुणसूत्र संरेखण में mitotic प्रोटीन की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए प्रक्रिया जारी और अलगाव । यह प्रोटोकॉल बहुआयामी प्रोटीन की mitotic भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी रहा है जो की स्थापना की है । हमारे मामले में, Cdt1 की mitotic भूमिका, एक प्रोटीन के G1 चरण में लाइसेंस प्रतिकृति मूल के लिए महत्वपूर्ण है, प्रभावी ढंग से अध्ययन किया जा सकता है केवल जब G2/ हम डबल thymidine तुल्यकालन का उपयोग G2/एम-विशिष्ट Cdt1 की कमी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । हम भी सेल निर्धारण के प्रोटोकॉल की व्याख्या, और लाइव सेल इमेजिंग thymidine रिहाई के बाद उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । विधि भी दोनों शारीरिक और परेशान स्थितियों जैसे Hec1, Ndc80 परिसर के एक घटक के तहत mitotic प्रोटीन के समारोह का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है, के रूप में यह एक निश्चित और जीवित सेल के लिए mitotic कोशिकाओं के बड़े नमूना आकार प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है विश्लेषण के रूप में हम यहां दिखाओ ।
Introduction
सेल चक्र में, कोशिकाओं को अपने जीनोम और प्रसार के सटीक दोहराव के लिए अत्यधिक विनियमित और अस्थाई नियंत्रित घटनाओं की एक श्रृंखला से गुजरना । स्तनधारियों में, कोशिका चक्र में चरणबद्ध और एम-फेज होते हैं । एक चरण में, जो तीन चरणों के होते है-G1, एस, और G2, सेल इसके जीनोम और बहोत वृद्धि है कि सामांय कोशिका चक्र प्रगति1,2के लिए आवश्यक है डुप्लिकेट । एम चरण में, जो बँटवारा (दौर, prometaphase, metaphase, anaphase, और telophase) और cytokinesis के होते हैं, एक माता पिता के सेल दो आनुवंशिक रूप से समान बेटी कोशिकाओं का उत्पादन. बँटवारा में, की बहन chromatids के डुप्लिकेट जीनोम गाढ़ा (चरण) कर रहे है और इकट्ठे mitotic धुरी (prometaphase) के microtubules द्वारा अपने kinetochores पर कब्जा कर रहे हैं, कि metaphase प्लेट (metaphase) पर उनके संरेखण ड्राइव उनके द्वारा पीछा बराबर अलगाव जब बहन chromatids की ओर विभाजित कर रहे है और विपरीत धुरी डंडे (anaphase) के लिए ले जाया । दो बेटी कोशिकाओं को शारीरिक रूप से एक actin आधारित सिकुड़ा अंगूठी की गतिविधि से अलग कर रहे है (telophase और cytokinesis) । kinetochore एक विशेष proteinaceous संरचना जो chromatids के centromeric क्षेत्र में इकट्ठे और धुरी microtubules के लिए लगाव साइटों के रूप में सेवा है । इसका मुख्य कार्य गुणसूत्र कब्जा, संरेखण, और अनुचित धुरी microtubule लगाव को सही करने में सहायता ड्राइव करने के लिए है, जबकि धुरी विधानसभा चौकी मध्यस्थता गुणसूत्र अलगाव3,4की निष्ठा को बनाए रखने के लिए ।
सेल तुल्यकालन की तकनीक आणविक और संरचनात्मक कोशिका चक्र प्रगति में शामिल घटनाओं को समझने के लिए एक आदर्श उपकरण के रूप में कार्य करता है । इस दृष्टिकोण के विश्लेषण के विभिंन प्रकार के लिए विशिष्ट चरणों में सेल की आबादी को समृद्ध किया गया है, जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा, सेलुलर जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का विश्लेषण, और प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने सहित । सिंक्रनाइज़ स्तनधारी कोशिकाओं न केवल व्यक्तिगत जीन उत्पादों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी जीन अभिव्यक्ति के microarray विश्लेषण सहित पूरे जीनोम के विश्लेषण को शामिल दृष्टिकोण के लिए5, miRNA अभिव्यक्ति पैटर्न6, शोधों विनियमन7, और प्रोटीन संशोधनों के proteomic विश्लेषण8. तुल्यकालन भी जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन दस्तक नीचे या नॉक आउट, या रसायनों के सेल चक्र प्रगति पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कक्ष चक्र के विभिंन चरणों में कक्षों को सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है । दोनों भौतिक और रासायनिक विधियों व्यापक रूप से सेल सिंक्रनाइज़ेशन के लिए उपयोग किया जाता है । कक्ष सिंक्रनाइज़ेशन के लिए सबसे महत्वपूर्ण मापदंड है कि सिंक्रनाइज़ेशन noncytotoxic और प्रतिवर्ती होना चाहिए । औषधीय एजेंटों द्वारा कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के संभावित प्रतिकूल सेलुलर परिणामों के कारण, रासायनिक निर्भर तरीकों महत्वपूर्ण कोशिका चक्र की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए लाभप्रद हो सकता है । उदाहरण के लिए, hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, और lovastatin, G1/एस चरण में सेल तुल्यकालन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन, क्योंकि वे बाधित जैव रासायनिक रास्ते पर उनके प्रभाव के, वे सेल चक्र चौकी तंत्र को सक्रिय करने और एक महत्वपूर्ण मार कोशिकाओं9,10के अंश । दूसरी ओर, thymidine वृद्धि मीडिया, “thymidine ब्लॉक” के रूप में जाना जाता है के लिए जोड़कर डीएनए प्रतिकृति की प्रतिक्रिया निषेध, कुछ अंक11,12,13पर सेल चक्र को गिरफ्तार कर सकते हैं । nocodazole और RO-३३०६9,14के साथ इलाज के द्वारा कक्ष G2/ Nocodazole, जो microtubule विधानसभा रोकता है, एक अपेक्षाकृत उच्च cytotoxicity है । इसके अलावा, nocodazole-गिरफ्तार कोशिकाओं mitotic फिसल द्वारा precociously चरण के लिए लौट सकते हैं । G1/S चरण पर डबल thymidine ब्लॉक गिरफ्तारी सेल और ब्लॉक से रिलीज के बाद, कोशिकाओं को G2 के माध्यम से तुल्यकालिक और बँटवारा में आगे बढ़ना पाया जाता है । thymidine ब्लॉक से जारी कोशिकाओं के लिए सेल चक्र के सामान्य प्रगति या तो सेल निर्धारण या लाइव इमेजिंग द्वारा उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया जा सकता है । mitotic प्रोटीन के गड़बड़ी का प्रभाव विशेष रूप से अध्ययन किया जा सकता है जब कक्ष दर्ज करें और डबल thymidine ब्लॉक से जारी करने के बाद बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ना. Cdt1, एक बहुआयामी प्रोटीन, G1 चरण में डीएनए प्रतिकृति मूल लाइसेंस में शामिल है और यह भी बँटवारा15के दौरान kinetochore microtubule संलग्नक के लिए आवश्यक है । बँटवारा के दौरान Cdt1 के समारोह का अध्ययन करने के लिए, एक एक तरीका है कि G1 चरण के दौरान प्रतिकृति लाइसेंस पर अपनी कमी के प्रभाव से बचा जाता है को अपनाने की जरूरत है, जबकि एक ही समय के दौरान विशेष रूप से अपनी कमी को प्रभावी G2/ यहाँ, हम दोनों फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा सेल चक्र के विभिन्न चरणों के दौरान कई कार्यों प्रदर्शन प्रोटीन की mitotic भूमिका का अध्ययन करने के लिए डबल thymidine ब्लॉक पर आधारित विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
डबल thymidine तुल्यकालन का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह एक सामंजस्य में बँटवारा में प्रवेश कोशिकाओं के कई के साथ एक कम समय विंडो में mitotic कोशिकाओं का एक बढ़ा नमूना आकार प्रदान करता है, इस प्रकार भी गुणसूत्र स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Tohoku विश्वविद्यालय के डॉ॰ Kozo तनाका के आभारी हैं, हेला कोशिकाओं को छुरा बांटने के लिए जापान mCherry-citrullinated H2B और GFP-α-tubulin का इजहार कर रहे हैं । यह कार्य DV (R00CA178188) को NCI अनुदान द्वारा और पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंडों द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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