Summary
Vi præsenterer en protokol for dobbelt thymidine synkronisering af HeLa celler efterfulgt af analyse ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi. Denne metode er nøglen til at opnå store antal celler, der Fortsæt synkront fra S fase til mitose, muliggør undersøgelser på mitotiske roller af multifunktionelle proteiner, som også besidder interphase funktioner.
Abstract
Undersøgelse af de forskellige administrative begivenheder i cellecyklus i en fase-afhængige måde giver en klar forståelse for cellevækst og division. Synkronisering af cellepopulationer i bestemte faser af cellecyklus har vist sig for at være meget nyttigt i sådanne eksperimentelle bestræbelser. Synkronisering af celler ved behandling med kemikalier, som er relativt mindre giftige kan være fordelagtigt over anvendelsen af farmakologiske hæmmende stoffer til studiet af deraf følgende cellecyklus begivenheder og at opnå specifikke berigelse af valgte mitotiske faser. Her beskriver vi protokollen for synkronisering menneskelige celler på forskellige stadier af cellen cyklus, herunder både i S og M-fase med en dobbelt thymidine blok og frigive procedure for at undersøge funktionaliteten af mitotiske proteiner i kromosom justering og adskillelse. Denne protokol har været yderst nyttigt for at studere de mitotiske roller af multifunktionelle proteiner, som besidder etablerede interphase funktioner. I vores tilfælde, kan Cdt1, et protein, der er kritiske for replikering oprindelse licensering i G1 fase, mitotiske rolle studeres effektivt kun når G2/M-specifik Cdt1 kan være udtømt. Vi beskriver detaljerede protokollen for udtømning af G2/M-specifikke Cdt1 ved hjælp af dobbelt thymidine synkronisering. Vi forklare protokollen af celle fiksering og live celle imaging ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi efter thymidine udgivelse. Metoden er også nyttige til at analysere funktionen af mitotiske proteiner på både fysiologiske og foruroliget betingelser som for Hec1, en komponent af Ndc80 kompleks, da det giver en til få store stikprøvestørrelser mitotiske celler for faste og levende celle analyse som vi viser her.
Introduction
I cellecyklus undergår celler en række stærkt reguleret og tidsligt kontrolleret begivenheder for den præcise overlapning af deres genom og spredning. I pattedyr består celle cyklus af interphase og M-fase. I interfase, som består af tre faser - G1, S, og G2, cellen dubletter, dets genom og gennemgår vækst, der er nødvendige for normale cellecyklus progression1,2. I M-fase, som består af mitose (prophase, prometaphase, metafase, anaphase og telophase) og cytokinesis, producerer en parental celle to genetisk identiske datterceller. I mitosen, Søster kromatider af duplikerede genom er kondenseret (prophase) og er fanget i deres kinetochores af mikrotubuli af samlet mitotiske spindel (prometaphase), der drev deres justering på metafase plade (metafase) efterfulgt af deres lig adskillelse, da Søster kromatider er delt mod og transporteres til modsatte spindel poler (anaphase). De to datterceller er fysisk adskilt af aktiviteten af en actin-baserede kontraktile ring (telophase og cytokinesis). Kinetochore er en specialiseret proteinholdige struktur, der samler på det centromeric område af kromatider og tjene som vedhæftede fil sites for spindel mikrotubuli. Dets vigtigste funktion er at køre kromosom capture, tilpasning, og støtte i rette forkert spindel mikrotubulus udlæg, mens mægle spindel forsamling checkpoint for at opretholde troskab af kromosom segregation3,4.
Teknikken med celle synkronisering tjener som et ideelt værktøj til at forstå de molekylære og strukturelle begivenheder, der er involveret i celle cyklus progression. Denne tilgang har været brugt til at berige cellepopulationer på specifikke faser for forskellige typer af analyser, herunder profilering af genekspression, analyser af cellulære biokemiske processer og påvisning af subcellulært lokalisering af proteiner. Synkroniseret pattedyrceller kan bruges ikke kun til undersøgelsen af individuelle genprodukter, men også for tilgange, der inddrager analyse af hele genomer herunder microarray analyse af gen expression5, miRNA udtryk mønstre6, Translationel regel7, og proteom analyse af protein ændringer8. Synkronisering kan også bruges til at studere effekterne af genekspression eller protein knock-down eller knock-out, eller kemikalier på cellecyklus progression.
Celler kan synkroniseres på de forskellige stadier af cellecyklus. Både fysiske og kemiske metoder er almindeligt brugt til celle synkronisering. De vigtigste kriterier for celle synkronisering er, at synkronisering skal være noncytotoxic og reversible. På grund af de potentielle negative cellulære konsekvenser af synkronisering af celler af farmakologiske midler, kan kemisk-dependent metoder være en fordel for at studere centrale cellecyklus begivenheder. For eksempel hydroxyurea, amphidicolin, mimosine og lovastatin, kan bruges til celle synkronisering på G1/S fase, men på grund af deres indvirkning på de biokemiske veje de hæmmer de aktivere cellecyklus checkpoint mekanismer og dræbe et vigtigt brøkdel af celler9,10. På den anden side kan feedback hæmning af DNA-replikation ved at føje thymidine til vækst medier, kendt som "thymidine blok", arrestere cellecyklus på visse punkter11,12,13. Celler kan også synkroniseres på G2/M fase ved at behandle med nocodazole og RO-33069,14. Nocodazole, som forhindrer mikrotubulus forsamling, har en relativt høj cytotoksicitet. Desuden nocodazole-anholdt celler kan vende tilbage til interphase precociously af mitotiske skred. Dobbelt thymidine blok anholdelse på G1/S fase og efter løsladelse fra blokken celler findes celler, fortsætte synkront gennem G2 og i mitosen. Den normale progression af cellecyklus for cellerne frigives fra thymidine blok kan overholdes under høj opløsning Konfokal mikroskopi af enten celle fiksation eller live imaging. Effekten af undertrykkelse af netbårne mitotiske proteiner kan studeres, specielt når celler ind og fortsætte gennem mitosen efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok. Cdt1, en multifunktionel protein, er involveret i DNA replikation oprindelse licenser i G1-fase og er også nødvendig for kinetochore mikrotubulus vedhæftede filer under mitosen15. For at studere funktionen af Cdt1 under mitosen, skal man anvende en metode, der undgår effekten af sin udtynding på replikering licenser i G1 fase, samtidig med at den foretager sine udtynding specifikt under G2/M fase kun. Vi præsenterer her, detaljerede protokoller baseret på dobbelt thymidine blok til at studere proteiner udfører flere funktioner i forskellige faser af cellecyklus mitotiske rolle af både faste og live-celle billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dobbelt Thymidine blok og Release: reagens præparater
- Gøre 500 mL Dulbecco ændrede Eagle medium (DMEM) medium suppleret med 10% FBS, penicillin og streptomycin.
- Gøre 100 mM bestand af thymidine i sterilt vand og opbevares i alikvoter ved-80 ° C.
2. protokol for faste celle billeddannelse af mitotiske Progression (figur 1A)
- På dag 1, frø ~ 2 x 105 HeLa celler ind i huller i en 6-godt pladen med et cover slip (steriliseret med 70% ethanol og UV-bestråling) og 2 mL af DMEM medium. Vokse celler i en fugtig inkubator i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- 1St. thymidine gade: på dag 2, blandes grundigt den krævede mængde af thymidine i friske DMEM medier (100 mM stock, 2 mM endelige koncentration).
- Der tilsættes 2 mL af thymidine-holdige medier til celler i hver brønd 6-Tja plade og der inkuberes i 18 h.
- På dag 3, Aspirér medium og vaske cellerne to gange med 2 mL 1 x PBS og en gang med friske forvarmet DMEM; vokse celler i frisk forvarmet DMEM medium for 9 h at frigive celler fra blok.
- 2nd thymidine blok: igen tilsættes 2 mL af thymidine-holdige medier (2 mM slutkoncentration) til celler i hver brønd af 6-godt plade.
- Inkuber i et andet 18 h.
- Dag 4, Aspirér medium og vaske cellerne to gange med 2 mL 1 x PBS og en gang med friske forvarmet DMEM.
- Fortyndet siRNAs (kontrol og Cdt1) og Transfektion reagens i serum gratis vækstmediet særskilt for 10 min. bland dem sammen og der inkuberes i 20 min. på RT. Den endelige koncentration af siRNA bruges i hver Transfektion var 100 nM. Tilføje reaktionsblandingen til de celler, der er blevet vasket ud af Thymidine.
- Inkuber celler ved 37 ° C i 9-10 h til at frigive fra blokering og lave cellerne på dæksel glider med 4% PFA i 20 min. på RT.
Forsigtig: PFA er giftigt, bære passende beskyttelse. -
Immunostain celler, efter permeabilizing med 0,5% (v/v) vaskemiddel i 10 min på RT og vaske cellerne to gange med 1 x PBS i 5 min.
- Blokere celler med 1% BSA (w/v) i 1 x PBS for 1 h i RT efterfulgt af behandling af celler med 50 µL af primære antistoffer (musen anti-α-tubulin antistof fortyndet til 1:1, 000, kanin anti-Zwint1 antistof fortyndet til 1: 400, og musen anti-phospho-ɣ H2AX fortyndet til 1: 300) i 1% (w/v) BSA i 1 x PBS i 1 timer ved 37 oC.
- Efter vask ud celler med 1 x PBS tre gange, behandling af celler med 50 µL af sekundære antistoffer for hver dække glas (Alexa 488 og rodamin Red på 1:250 fortyndinger på 1% (w/v) BSA i 1 x PBS) i 1 time på RT.
- Efter vask celler med 1 x PBS to gange i 5 min, behandling af celler med DAPI (0.1µg / mL i 1 x PBS) i 5 min på RT.
- Efter vask celler med 1 x PBS to gange i 5 min, placere dække slip vender celler til passende montering medier på et klart mikroskopiske dias.
- Billede celler til immunostained proteiner med 60 X eller 100 X 1,4 NA Plan-apokromatiske DIC oliebestandighedsobjektet monteret på en inverteret høj opløsning Konfokal mikroskop udstyret med en passende kamera som nødvendigt for kvaliteten af billeder påkrævet.
- Erhverve billeder ved stuetemperatur, z-stakke af 0,2 µm tykkelse ved hjælp af software relevant for mikroskopet.
3. protokol for levende celle billeddannelse af mitotiske Progression (figur 3A)
- På dag 1, frø ca 0.5-1 x 105 HeLa celler stabilt at udtrykke mCherry-H2B og normal god landbrugspraksis-α-tubulin (lidt variabel baseret på celletype og de proteiner, de udtrykker) i 35 mm glas bund retter med 1,5 mL af DMEM medium og dyrke dem i et befugtet inkubator i 24 timer ved 37 oC og 5% CO2.
- 1St. thymidine gade: på dag 2, der tilsættes 1,5 mL af thymidine-holdige medier til cellerne i skålen (100 mM thymidine, 2 mM endelige koncentration,).
- Inkuber i 18 timer.
- På dag 3, Aspirér det medium, der indeholder thymidine og cellerne vaskes tre gange, to gange med 2 mL 1 x PBS og en gang med friske forvarmet DMEM.
- Fortyndet siRNAs (kontrol og Hec1) og Transfektion reagens med serum gratis vækstmediet særskilt for 10 min. bland dem sammen og der inkuberes i 20 min. på RT. Den endelige koncentration af siRNA bruges i hver Transfektion var 100 nM. Tilføje reaktionsblandingen til de celler, der er blevet vasket ud af Thymidine.
- Vokse celler i 1,5 mL frisk forvarmet DMEM medium 8 h at frigive celler fra blok.
- 2nd thymidine blok: der tilsættes 1,5 mL af thymidine-holdige medier (2 mM slutkoncentration) celler i fadet.
- Inkuber i et andet 18 h.
- Dag 4, Aspirér medium og cellerne vaskes tre gange, to gange med 2 mL 1 x PBS og en gang med friske forvarmet DMEM. Derefter dyrke celler i frisk forvarmet Leibovitz er (L-15) medium suppleret med 10% FBS og 20 mM HEPES ved pH 7,0 til 8 h at frigive celler fra blokken.
- Placer fadet i temperatur kontrol kammer i høj opløsning Konfokal mikroskop, som allerede har tændt mindst 30 min før du begynder imaging for at stabilisere de scenen og eksperimenterende temperaturer.
- Fokus i lysfelt med 60 x mål indtil celler er synlige og derefter manuelt støvtætte på scenen i regionen af valg.
- Opsætning af lys og laser power/eksponering, image erhvervelse parametre og varigheden af forsøget ved hjælp af mikroskop billede erhvervelse software valg. Bruge filtre for normal god landbrugspraksis (488 excitation; 385 nm emission) og mCherry (561 nm excitations- og 385 nm) at erhverve billeder.
- Udføre time-lapse eksperimentet ved separat erhverve pulserende lys og fluorescens billeder hver 10 min i en periode op til 16 h.
- Erhverve billeder, tolv 1,0 µm-adskilt z-fly på 9 h efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok ved hjælp af software relevant at mikroskopet.
- Analysere billeder sporing individuelle celler for mitotiske progression og endelig samle den tilsvarende film med source software Fiji/ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøgelse af mitotiske progression og mikrotubulus stabilitet i celler fast efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok
Cdt1 er involveret i licensering af DNA replikation oprindelse i G1-fase. Det er forringet i S fase men re ophobes i G2/M fase. For at studere dens rolle i mitosen, skal den endogene Cdt1 være udtømt specifikt på G/M fase ved hjælp af den mest egnede celle synkronisering teknik, dobbelt thymidine blok15. Celler var transfekteret med siRNAs umiddelbart efter udgivelsen af 2nd thymidine blok, når celler i S fase og på hvilket tidspunkt licensering af replikering oprindelse i G1, som også kræver Cdt1 funktion, er længe blevet gennemført. Udtømning af Cdt1 efter 9 h siCdt1 Transfektion og dobbelt thymidine block release blev valideret af Western blotting (figur 1B). Fiksering af celler 9 h efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok viser, at de fleste celler er på stadiet metafase i både kontrol- og Cdt1 siRNA transfekteret celler. Men fiksering af celler 10 h efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok viser, at de fleste Cdt1 siRNA-behandlede celler arresteres stadig i prometaphase sent, mens kontrol celler Angiv anaphase og normalt adskille deres kromosomer som forventede (figur 1 c ). For at forstå virkningen af Cdt1 udtynding på kinetochore-mikrotubulus (kMT) stabilitet, blev celler fastsat til 9 h efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok efterfulgt af kuldebehandling, der kun bevarer stabil kinetochore-mikrotubuli (kMTs). KMTs Cdt1-forarmet celler er relativt mindre robuste efter kuldebehandling sammenlignet med kontrol celler (fig. 1 d). Således, ved hjælp af denne fremgangsmåde, progression af normale mitotiske celler efter den undertrykkelse af netbårne af funktionen af mitotiske de(n) interesse kan studeres effektivt, selv uden brug af levende celle billeddannelse.
Figur 2 viser, at licenser af DNA replikation oprindelse ikke er urolig, når cellerne er opbrugt af Cdt1 under G2/M fase ved hjælp af vores protokol, som blev også observeret i kontrol celler. Celler forarmet af Cdt1 G2/M fasen ikke fremkalde ophobning af fosforyleres ɣH2AX, en markør for DNA-skader, under den efterfølgende G2 fase; siRNA Transfektion af asynkrone kulturer nedbryder Cdt1 fremkaldte ophobning af phospho-ɣH2AX-positive foci, muligvis på grund af DNA-skader induceret forkert DNA replikation licenser.
Undersøgelse af mitotiske progression i celler efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok af levende celle imaging
Efter nukleare kuvert opdeling (NEB), normale celler (i mangel af undertrykkelse af netbårne af en funktionel mitotiske protein) Indtast mitosen og gennemgå anaphase indsættende forlades mitosen i omkring 30-60 min (figur 3B). Men RNAi-medieret knockdown af Hec1, en nøgle kinetochore protein, der er nødvendige for robust kMT vedhæftet fil dannelse, er fundet for at forsinke normale mitotiske progression. I dette scenario, de fleste celler Angiv mitosen efter NEB, men ikke gennemgå anaphase indsættende eller frakørsel fra mitosen selv efter flere timers forsinkelse i mitosen (figur 3 c). Ligeledes, effekten af RNAi-medieret knockdown af andre proteiner, der lokaliserer til kinetochores eller at have en funktion under mitosen kan dermed observeres effektivt ved hjælp af levende celle imaging efter løsladelse fra dobbelt thymidine blokke. Ud over at undersøge karakteren af mitotiske progression, forsinkelse og anholdelse, nogle af de andre vigtige mitotiske fænomener, der kan analyseres ved hjælp af denne metode omfatter kromosom justering, mitotiske spindel dannelse, og positionering aktivering og hæmning af den spindel forsamling checkpoint.
Figur 1: analyse af mitotiske progression og stabiliteten af kinetochore mikrotubuler i faste celler efter dobbelt thymidine synkronisering. (A) A skematisk gengivelse af celle synkronisering, fiksering og immunfluorescens. (B) vestlige skamplet for knockdown af Cdt1 efter 9 h for overgang fra 2nd thymidine blok. (C) immunofluorescens micrographs at vise de mitotiske celler faste 9 og 10 h efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok og behandling med kontrol (øverst) eller Cdt1 siRNA (nederst). Α-tubulin farvning er i rød, DNA i grøn som celler udtryk for normal god landbrugspraksis-Histon H2B. Skalalinjen = 10 µm. Prometaphase og metafase celler er angivet ved hjælp af gul og hvid pilespidser henholdsvis. (D) HeLa celler efter behandling med kontrol siRNA (toppanelet) og Cdt1 udtynding (nederste panel) til 9 h efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok efterfulgt af behandling med iskold Leibovitz's (L-15) medium og fiksering. Celler var immun-farvet for spindel MT (grøn) og en kinetochore markør, Zwint1 (rød) og DAPI for DNA i sort og hvid. Skalalinjen = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cdt1-nedbrydningen under G2/M fase ikke forurolige replikering licenser. Asynkron HeLa celler behandles med kontrol luciferase (toppanelet) eller cdt1 siRNAs (midterste panel) eller dobbelt thymidine synkroniseres HeLa celler behandles med cdt1 siRNA under 2nd thymidine wash-out efterfulgt af fiksering på 10 h efter release (nederste panel) blev farvet med DAPI (pseudo farvet grøn) og anti-phospho-ɣH2AX antistof (rød). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af mitotiske progression af levende celle imaging i synkroniseret celler. (A) A skematisk gengivelse af celle synkronisering og levende celle billeddannelse. HeLa celler stabilt udtrykker mCherry-Histon H2B og normal god landbrugspraksis-α-tubulin blev frigivet fra dobbelt thymidine blok i 8 timer at lade dem gå videre til G2/M fase fra S fase anholdelse. Live imaging blev udført ved hjælp af en høj opløsning Konfokal mikroskop begynder 8 timer efter releasing celler fra thymidine blok og fortsætter for op til 16 h fra dette punkt. Vist her er stillbilleder fra videoen fanget hver 10 min til kontrol celler uden undertrykkelse af netbårne enhver mitotiske protein (B) eller celler forarmet af Hec1-underenheden af den komplekse Ndc80 (C). Skala barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske fordel af dobbelt thymidine synkronisering er at det giver en øget stikprøvestørrelse mitotiske celler i en kort tidsvindue med mange af disse celler ind i mitosen i fællesskab, således at også analyser af kromosom justering, bipolar spindel dannelse og kromosom adskillelse med meget højere effektivitet.
Mange regulerende proteinkomplekser og signalering veje er helliget sikre normal progression gennem mitosen og deregulering af denne proces kan førte til tumordannelse. Live celle billeddannelse af HeLa celler stabilt at udtrykke mCherry-H2B og normal god landbrugspraksis-tubulin og frigivet fra den dobbelte thymidine blok viser at de fleste kontrol celler adskille deres kromosomer på anaphase inden for ca. 60 min. efter NEB (figur 3B). På den anden side bor celle billeddannelse af HeLa celler foruroliget med Hec1 funktion viser, at de fleste celler forblive i den mitotiske fase i en lang periode med fejljusteret kromosomer efterfulgt af anaphase debut eller apoptose (figur 3 c).
Overskydende thymidine hæmmer DNA syntese fasen S således blokere celler på G1/S fase11. Selv om dobbelt thymidine blok synkronisering er mest almindeligt anvendt metode i studiet af cellecyklus og mitotiske progression, skal man være kritisk over for nogle af begrænsningerne af denne metode. Vigtigere er, skal det sikres, at kemikaliet er blevet vasket grundigt (for 7-8 h) således at effekten er fuldstændig reversibel og celler kan fortsætte normalt gennem resten af cellecyklus. Celler kan ellers ikke indtaste den anden cyklus, forårsager ukorrekt progression selv mitosen. Andelen af synkroniserede celler kan ikke være tilstrækkelig høj med en enkelt thymidine blok og en dobbelt thymidine blok kan være nødvendigt at øge antallet af synkroniserede celler, især hvis man er interesseret i at studere en bestemt fase i mitosen. Varigheden af thymidine behandlingen skal optimeres på grund af forskellig følsomhed blandt celletyper alt efter generation. For eksempel, hamster celler har 16 h af generationstid og er behandlet med thymidine i 11 timer for optimal synkronisering17. I denne undersøgelse behandlet vi HeLa celler til 16-18 h med thymidine. Desuden, den overskydende thymidine ikke kun forhindrer DNA-syntese, men også kan dræbe vigtige fraktioner af celler11,12,18 og luk opmærksomhed skal betales til at overvåge dette tab. Thymidine stamopløsningen anvendes i denne undersøgelse bør være forberedte i sterilt destilleret vand og skal blandes grundigt i celle kultur medier undgå sin nedbør efter at føje det til medierne af siRNA transfekteret celler og sikre dets homogene fordelingen omkring de dyrkede celler.
For at studere funktionen af en target mitotiske protein under mitotiske progression, cellerne ville ideelt set være behandlet med siRNA til knockdown niveauer af protein af interesse under 1st thymidine blok eller under frigivelse fra det 1st thymidine blok, afhængigt af den tid, der kræves for at opnå effektiv protein knockdown19,20,21. På den anden side for at studere rollen af multifunktionelle proteiner som Cdt1 under mitosen, er det nødvendigt at behandle celler med siCdt1 under frigivelse fra 2nd thymidine blok at opnå G2/M bestemt udtynding. Cdt1 er en afgørende aktør i licensering af DNA replikation oprindelse15. For at forstå dets specialiserede rolle under mitosen uden at forstyrre dens rolle i licenser, skal Cdt1 være udtømt specifikt på G2/M fase, der kan gennemføres effektivt af dobbelt thymidine synkronisering, således at man undgår at skulle ty til andre mitose-specifikke undertrykkelse af netbårne tilgange, der er vanskelige at udføre. Udtømning af Cdt1 i asynkron kulturer inducerer DNA skader svar på grund af afbrydelsen af licensering af DNA replikation oprindelse, som ville til gengæld har forplumret analyse af et muligt funktion for dette protein under mitosen. Således tilbyder dobbelt thymidine synkronisering teknik en unik eksperimenterende tilgang for at generere celler, der undergik en normal G1 og S fase men manglede Cdt1 funktion i G2 og M fase. Den særlige betydning af vores synkronisering protokol ligger i sin hæmning af multifunktionelle proteiner på den specifikke fase (G2/M) til at undersøge deres roman funktioner under mitosen. Således, denne metode vil være nyttigt ikke kun til at studere rollen af proteiner, der har flere funktioner forskellige cellecyklus gennemførelsesstadier, men også af, at enhver mitotiske protein i kromosom justering, kMT vedhæftede filer og kromosom adskillelse.
For levende celle imaging, efter udgivelsen af en dobbelt thymidine blok, celler bør være udruget i pre varmede Leibovitz's (L-15) medium suppleret med 10-20% FBS indtil begyndelsen af billedbehandling. Cellerne Angiv mitosen på varierende tidspunkter efter løsladelse fra thymidine blok afhængigt af hvilken celle. Starttidspunktet for billedcapture eller fiksering skal optimeres afhængigt af hvilken celle. For levende celle imaging, kan udnyttelse af konventionelle Konfokal mikroskopi forårsage photobleaching under langsigtede billeddannelse. På den anden side giver høj opløsning Konfokal microcopy et klart og høj opløsning billede med det mindste omfanget af photobleaching virkninger.
De kritiske trin i denne protokol er varigheden af thymidine behandling, ordentlig udvaskning af thymidine, timingen af siRNA Transfektion og start timing af billedbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansiel interesse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. Kozo Tanaka Tohoku Universitet, Japan for at dele HeLa celler stabilt udtrykker mCherry-Histon H2B og normal god landbrugspraksis-α-tubulin. Dette arbejde blev støttet af en NCI tilskud til DV (R00CA178188) og af start-up midler fra Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A.
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
