Summary
Мы опишем здесь простой и быстрый метод для изоляции Salmonella typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина и стрептавидина.
Abstract
Сальмонеллы typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащиеся в везикулы, известный как phagosomes для того чтобы быть понижена. Изоляция S. typhimurium-содержащих phagosomes широко использовался для изучения как S. typhimurium инфекции изменяет процесс созревания фагосомы для предотвращения бактериального деградации. Классически, изоляции бактерий содержащих phagosomes была выполнена, сахароза градиентного центрифугирования. Однако этот процесс занимает много времени и требует специализированного оборудования и определенная степень ловкости. Описанные здесь — это простой и быстрый метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина стрептавидина конъюгированных магнитные бусы. Phagosomes, полученные этим методом может быть приостановлено в любом буфере выбор, позволяя использование изолированных phagosomes для широкого спектра анализов, таких, как анализ белков, метаболит и липидов. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes конкретных, эффективных, быстрых, требует минимального оборудования и более универсальным, чем классический метод изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation.
Introduction
Макрофаги являются циркулирующие специализированных фагоцитирующих клеток, которые обнаружить, поглотит и ухудшить любые иностранные частиц, присутствующих в периферических тканях, начиная от apoptotic клеток до вторжения микроорганизмов, таких как бактерии. После поверхности рецептор опосредованный признания возбудителя определенных маркеров обычно присутствует на поверхности микроорганизмов (известный как патоген связанные молекулярные структуры или PAMPs) макрофаги инициировать сложный реорганизации клеточной мембраны в для того, чтобы окружить и фагоцитируют возбудителя1.
Охватившего патогена, затем содержится макрофагов в внутриклеточного везикул, известный как фагосомы. Через серию слияние и деление события с другими везикулы, таких как endosomes и лизосом возбудитель содержащих фагосомы приобретает набор белков, необходимых для ликвидации phagosomal содержание. Таким образом в ходе этого процесса, известный как фагосомы созревания2состав ферментативных фагосомы крайне непостоянны.
Вскоре после фагоцитоза, multimeric, которую комплекс вакуолярной АТФаза (v АТФаза) включена в мембране фагосомы сплавливанием с endosomes3. Этот комплекс использует АТФ для перекачки протонов от цитозоль для люмен фагосомы4. Подкисление фагосомы имеет важное значение для события слияния с другими везикулы5 и для активации большое количество рН зависимых ферментов и деструктивные6. Другой multimeric энзимный комплекс, который быстро собрал на мембране фагосомы представляет собой комплекс NADPH-оксидазы (NOX). NOX комплекс окисляет NADPH произвести реактивнооксигенных видов (ров), выделяется в просвете фагосомы и что существенный вклад в убийстве охватившего микроорганизмов7.
На первоначальных этапах созревания phagosomes настоящее время маркеры обычно как Rab5 и Rab7 раннего и позднего endosomes соответственно наряду с Субблок0 V v АТФазы8. Слияние phagosomes с лизосом и позднего endosomes приводит к подверженности самые разнообразные гидролитические ферменты, такие как катепсин протеаз, липазы и β-галактозидазы9фагоцитированных возбудителя. Подкисление просвета также необходим для активации этих ферментов. Например расщепление катепсина Д производить активный короткая форма-рН зависимых10. Эти ферменты ухудшить возбудителя и посредником производства возбудителя производные короткие пептиды, которые представлены макрофагов гистосовместимости комплекс (MHC) класса II молекул клеток T, чтобы инициировать адаптивного иммунного ответа11.
Следовательно фагосомы созревания имеет решающее значение для врожденный иммунный ответ и связывает врожденного и адаптивного герб иммунной системы. Это не удивительно, что патогенные организмы развивались стратегии преодоления ликвидации макрофагами через описанные выше процесс созревания фагосомы. Например внутриклеточных бактерий микобактерии туберкулеза и Legionella pneumophila предотвратить созревание фагосомы ингибирующих v АТФазы Ассамблеей и последующего люмен подкисления12,13 . Другие бактерии, такие как Listeria monocytogenes или шигеллам Флекснера побудить порообразования в мембране фагосомы бежать в цитозоль14,15. С другой стороны, Salmonella enterica серовар typhimurium (S. typhimurium) имеет возможность изменить свойства фагосомы в вакуоль превратить его в подходящее место для его репликации16. Эта способность делает S. typhimurium очень интересная модель для изучения возбудителя опосредованной вмешательства фагосомы созревания.
S. typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. Typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащихся в phagosomes17. В некоторых докладах ранее описал что S. typhimurium-содержащих phagosomes настоящее время производители для endosomes и лизосом18, и другие исследования обнаружили фагосомы Лизосома фьюжн, предотвратить после S. Typhimurium инфекции19.
Первоначально фагосомы созревания на S. typhimurium инфекции были расследованы иммунофлуоресценции. Разработка методов для изоляции бактерий содержащих phagosomes включено более точное исследование содержания фагосомы с точки зрения endosome и лизосомальных маркеров. На сегодняшний день, основной метод, используемый для изоляции бактерий содержащих phagosomes является субцеллюлярные фракционирование сахарозы шаг градиенты18,20. Однако этот метод требует несколько шагов центрифугирования, которые могут вызвать механические повреждения phagosomes, может повлиять на стабильность phagosomal компонентов (белков и липидов) и отнимает много времени. Кроме того, он требует использования ультрацентрифуга: кусок специализированного оборудования, который не доступен для каждой лаборатории.
Недавно, новый подход был применен к изоляции бактериальных содержащих phagosomes, в которых бактериальных патогенов помечены с биотинилированным lipopetide (Lipobiotin) и впоследствии извлечены с помощью конъюгированных стрептавидина магнитные бусы21 . Мы предлагаем альтернативный дополнительный метод, снабдив бактериального поверхности Амин содержащих макромолекул с ГСЗ-биотин следуют конъюгированных стрептавидина магнитные шарики. Phagosomes, полученные этим методом сильно обогащенный в endosome и лизосомальных маркеры и может быть использован для широкий спектр анализов, от анализа белка омику анализа. Кроме того она не требует специализированного оборудования, такого как Ультрацентрифуги. Кроме того устраняя шаги центрифугирования, механические повреждения phagosomes и количество времени, занятых значительно сокращаются. Этот метод может быть легко адаптирована для изоляции phagosomes, содержащие другие бактерии, такие как грамположительных Staphylococcus aureus, также включены в этой рукописи. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes является простым, экономически эффективным, и меньше времени чем классической изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation, оказание высоко обогащенного бактерий содержащих phagosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все шаги, связанные с применением патогенных S. typhimurium должны осуществляться в BSL-2 или выше учреждения уровня биологической безопасности. Культура и покрытие S. Typhimurium, а также инфекции костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) должны быть выполнены под Ламинарный шкаф для предотвращения загрязнения. Изоляция S. typhimurium-содержащих phagosomes может быть выполнена на любой стенде лаборатории BSL-2.
Извлечение костного мозга от мышей для дифференциации в макрофаги была выполнена в соответствии с институциональных руководящих принципов на благосостояние животных и утверждена Северный Рейн-Вестфалия государственного агентства охраны природы, Окружающей среды и защиты прав потребителей [шведским für натур, Umwelt и Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Файла без: 84-02.05.40.14.082 и 84-02.04.2015.A443] и Кёльнского университета.
1. S. typhimurium Culturing
- Inoculate S. typhimurium (Штамм SL1344) из одного бактериальные колонии в 5 мл мозга сердце инфузии (BHI) бульон с помощью бактериальных цикла.
- Инкубировать бактериальных подвеска в инкубаторе при 37 ° C ночь встряхивании.
- На следующий день, передача 1 мл суспензии бактерий в 19 мл бульона BHI в коническую колбу и инкубировать при 37 ° C в инкубаторе встряхивании.
- Мониторинг S. typhimurium роста путем измерения оптической плотности (OD) на 600 Нм (600 OD) с спектрофотометром. Измерения должны быть проведены примерно каждые 30 мин
- Когда ОД 600 достигает 1,0, удалить бактериальный подвеска из инкубатора и передачи в Тюбик 50 мл. Центрифуга бактерий на 5400 x g 15 мин на 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте в 10 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS).
- Центрифуга на 5400 x g 15 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте бактерий в 4,9 мл стерильного PBS.
2. Покрытие из S. typhimurium с ГСЗ-биотин/стрептавидина конъюгированных магнитные бусы
- Добавить 100 мкл 10 мг/мл биотина увязки решения (ГСЗ-биотин растворяют в диметилсульфоксида, ДМСО) свежеприготовленные, к бактериальной подвеска подготовлено на предыдущем шаге. Например разбавьте 5 мг биотина ГСЗ в 0,5 мл стерильного ДМСО. Mix правильно, закупорить вверх и вниз несколько раз.
- Разделить смесь в пяти 1.5 мл пробирок.
- Инкубировать втечение 2 ч при комнатной температуре (RT) на thermoblock с постоянной тряски на 350 об/мин.
- Центрифуга трубы на 15000 x g 10 мин на RT и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте в 1 мл стерильного PBS, центрифуги на 15000 x g 10 мин на RT и удалить супернатант.
- Повторите шаг 2,5 еще два раза, чтобы полностью удалить избыток биотина, связывание решение.
- После последнего мыть, Ресуспензируйте гранулы в 1 мл стерильного PBS.
- Перевести 100 мкл решения стрептавидина конъюгированных магнитной бусины 10 мг/мл в 1,5 мл трубку и оставить его на магнитные стойки для 5 минут
- Удаление растворителя с пипеткой, взять магнитные бусы решения стрептавидина-конъюгированных от магнитные стойки и Ресуспензируйте с 1 мл суспензии покрытием бактериальные биотина, подготовленную на этапе 2.7.
- Инкубировать 1 час на RT на thermoblock с постоянной тряски на 350 об/мин.
- Место решение на магнитные стойки; подождите 5 минут и затем удалить с пипеткой бактерии, которые не придерживались на стену (держать его в пробирку, помечены как "-покрытием бактерии "). Фракция, придерживаясь стенке трубки при контакте с магнит это биотина/стрептавидина покрытием бактерии.
- Снять трубку, содержащую помеченные бактерий из магнитные стойки и Ресуспензируйте в 1 мл стерильного PBS.
- Поместить его снова на магнитные стойки, подождите 5 минут и использовать пипетку, чтобы удалить PBS.
- Повторите шаги 2.13 и 2.14 еще два раза, чтобы удалить все бактерии, которые не покрыты конъюгированных стрептавидина магнитные бусы.
- После последнего мыть, Ресуспензируйте покрытием бактерии в 500 мкл стерильных PBS и этикетке трубки как " покрытием бактерий ".
- Количество колонии, образуя единиц (cfu) оба "-покрытием бактерии " и " покрытием бактерии " решения покрытие серийных разведений на плитах агара BHI. Приблизительно 2 x 10 8 кое/мл покрытием бактерий получены из 20 мл первоначальных бактериальных подвеска с ОД 600 1.0. Держите покрытием бактериальные подвеска на 4 ° C для использования на следующий день заразить макрофагов.
3. Инфекция BDMDs
- в тот же день, когда бактерии покрыты биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы, пластина полностью дифференцированной BMDMs 22 блюдах 6 см на плотности тарелок 5 x 10 6 клеток за блюдо.
- На следующий день, центрифуга с покрытием бактериальные подвеска на 15000 x g 5 мин на 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в концентрации 10 х 10 6 кое/мл.
- Заразить макрофагов в разносторонности инфекции (МВД) 10, удалите средство от BMDMs и добавьте 5 мл суспензии с покрытием бактериальные подготовлен. Оптимальное MOI может определяться для каждого типа клеток или экспериментальной целью изолированные phagosomes.
- Инкубировать в РТ за 10 мин для синхронизации фагоцитоза.
- Инкубировать при 37 ° C в 5% CO 2 инкубатора для 30 минут, чтобы инициировать фагоцитоза. Другие типы клеток может потребовать различных инкубации раз обеспечить интернализацию бактерий.
- Удалить бактерии содержащих среды из блюд и вымыть клетки с RPMI три раза, чтобы удалить бактерии, не учитываются.
- Наконец добавляют 10 мл RPMI, содержащие 10% FBS и гентамицина 50 мкг/мл, убить любого не фагоцитированных бактерии.
- Инкубировать зараженных BMDMs при 37 ° C с 5% CO 2, до тех пор, пока указать желаемое время. Желаемое время точка экспериментально должна определяться согласно бактерии и используемый тип ячейки и цель анализа. Для изучения ранних фагосомы endosome фьюжн события в S. Typhimurium инфицированных BMDMs, 30 минут инкубации рекомендуется. Для анализа последующих событий phagosomes могут быть извлечены после 2 ч или 4 ч инкубации. Длительный инкубационный макрофагов с S. Typhimurium за 24 часа приводит к смерти макрофаги. Расширенные внутриклеточную инфекцию до извлечения фагосомы вероятно может привести к деградации молекул биотин. Однако, мы не наблюдали потери биотина на покрытием бактерии до 24 ч.
4. Изоляция S. typhimurium-содержащих Phagosomes
- подготовить объем требуемых фагосомы изоляции буфера (50 мм трубы, pH.7, 5 мм EGTA мм MgCl 2, 50), добавив Дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 1 мм, B Cytochalasin к окончательному концентрация 10 мкм и протеазы и фосфатазы ингибиторов как рекомендованный производителем.
Примечание: DTT и Cytochalasin B должны быть добавлены в буфер изоляции фагосомы A всегда непосредственно перед употреблением. Cytochalasin B разрушает цитоскелета, содействие разрыв мембраны клетки. - В нужный момент точки, удалите средство от инфицированных клеток и промыть стерильной PBS, утепленные RT.
- Добавить 750 мкл phagosome изоляция буфер A за блюдо и инкубировать 20 мин на льду. При использовании числа различных клеток, объем буфера изоляции A следует пропорционально скорректирована.
- Добавить 250 мкл фагосомы изоляции буфера B (трубы 50 мм, pH.7, 50 мм MgCl 2, 5 мм EGTA, 220 мм маннит и 68 мм сахароза). Рок пластину для обеспечения что буфер достигает полной поверхности блюдо. При использовании числа различных клеток, объем буфера изоляции B следует пропорционально скорректирована.
- Удалить ячейки из блюдо, нежно соскоб с помощью резиновыми полицейский и передавать их на предварительно охлажденные 1,5 мл. Суспензию клеток
- пройти 26G иглы с помощью 1 мл шприца по крайней мере 15 раз (один стремление плюс один выброса клеток подвеска как один раз). Это достаточно, чтобы освободить цитозольной содержание BMDMs. Количество проходов через иглы должны быть оптимизированы для каждого типа клеток.
- Место суспензию клеток на магнитные стойки и подождать 5 мин. Частицы, прилагается к магниту, phagosomes, содержащие покрытием - S. Typhimurium. Суспензии содержит остальная часть клетчатых компонентов.
- Передачи подвеска в 1,5 мл трубку, помечены как " цитозоль ".
- Снять трубку с изолированной phagosomes из магнитные стойки и Ресуспензируйте их в 1 мл стерильного PBS.
- Место фагосомы подвеска на магнитные стойки, подождите 5 минут и удалите PBS.
- Повторите шаги 4.9 и 4.10 мыть изолированных S. typhimurium-содержащих phagosomes.
- Наконец удалить PBS и Ресуспензируйте phagosomes в буфере необходимые; например, в radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфер для анализа белка. Приблизительно 50-200 мкг белка получается на сэмпл после этого протокола, в зависимости от начального количества клеток и МВД инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция бактерий содержащих phagosomes этот протокол требует biotinylation бактерий в качестве первого шага. Поэтому мы провели оценку эффективности S. typhimurium biotinylation конфокальная микроскопия анализ BMDMs, инфицированных биотинилированным mCherry -S. typhimurium помечены Cy5-стрептавидина. Вкратце BMDMs были инфицированы, как описано в этом протоколе с mCherry -S. typhimurium ранее биотинилированным но не инкубировали с конъюгированных стрептавидина магнитные бусы. После инкубации в 30 минут при 37 ° C клетки были промывают теплой PBS и фиксированной с 4% формальдегида, за 20 мин на RT. фиксации был остановлен обширные Стиральная с PBS. Клетки были затем permeabilized с 3% Тритон в PBS на 5 мин на RT. инфицированных BMDMs затем инкубировали с Cy5-стрептавидина 20 мин при 4 ° C. После обширных стирки, образцы были подготовлены для анализа confocal микроскопии (рис. 1). Не биотинилированным mCherry -S. Typhimurium использовался в качестве отрицательного контроля. Флуоресцентного сигнала от Cy5-стрептавидина было отмечено исключительно в биотинилированным mCherry -S. typhimurium, подтверждающий что biotinylation бактерий был успешным. Микроскопические анализ был проведен на конфокального микроскопа с помощью «60 X O2 NA: 1.40» цель. Волны возбуждения для флуорохромов были 405 нм (DAPI), 559 Нм (mCherry) и 635 нм (Cy5) и ПМТ напряжения был установлен в 574v, 565v и 443v, соответственно.
Начиная с иммунной реакции вызваны Sв макрофагах. typhimurium в значительной степени зависит от поверхности рецептор активации макрофагов, бактериальных лигандов, далее мы тестировали, если покрытие S. typhimurium с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные шарики могут изменить врожденный иммунный ответ в зараженных BMDMs. Мы сначала оценить ли покрытие S. typhimurium может изменить фагоцитарной способности BMDMs, confocal микроскопии. BMDMs были инфицированы, как описано в этом протоколе с mCherry -S. Typhimurium с покрытием с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы или немелованных mCherry -S. typhimurium. После инкубации в 30 минут при 37 ° C клетки были промывают теплой PBS и фиксируется с 4% формальдегида для 20 мин на RT. После обширных стирки с PBS, образцы были подготовлены для анализа confocal микроскопии. Как показано на рисунке 2, макрофаги фагоцитированных мелованной и немелованной бумаге mCherry -S. typhimurium одинаково.
Далее мы проанализировали воспалительной реакции, вызванные S. typhimurium с покрытием с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы (рис. 3). Supernatants от инфицированных мелованной и немелованной бумаге S. BMDMs typhimurium были собраны после 24 h инфекции для энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) выделяется интерлейкина-6 (IL-6). Покрытие S. typhimurium с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы не повлияют воспалительной реакции макрофагов.
Чтобы оценить чистоту бактерии содержащих phagosomes, полученные путем применения настоящего протокола мы проанализировали изолированных mCherry -S. typhimurium-содержащие phagosomes immunoblotting. Использование специфических антител против тег mCherry, мы обнаружили значительное обогащение mCherry выражая S. typhimurium в изолированных phagosomes по сравнению с цитозольной фракции, полученные из того же образца (рис. 4). Изолированные phagosomes, содержащих mCherry - S. typhimurium , который не был ранее покрытые биотина были использованы в качестве отрицательного контроля. Эти результаты показывают, что этот протокол позволяет для очистки phagosomes, которые являются высоко обогащенный бактерий.
Далее мы провели анализ immunoblot endosome и лизосомальных маркеров в изолированных phagosomes, содержащие S. typhimurium (Рис. 5). Большинство маркеров endosome и лизосомальных были четко прослеживается в phagosomes, изолированные на 4 ч после инфекции по сравнению с 30 мин. Обогащение от англ маркеры Rab5 и Rab7, а также Лизосома маркеры v АТФазы (0 V и V1 подразделения) и катепсина Д, были замечены. Интересно, что было отмечено только рассеченного форма катепсин D в изолированных phagosomes на 4 ч после инфекции. Расщепление про катепсина Д (48 кДа) производить короткие активной формы (33 кДа) происходит только в phagosomes, но не в цитозоле, демонстрируя специфику настоящего протокола для изоляции фагосомы.
Так как маркеры от органеллы митохондрии или эндоплазменный ретикулум (ER) часто обнаруживаются в препараты бактерий содержащих изолированные phagosomes, S. typhimurium-содержащих изолированные phagosomes были зондируемой с специфическими антителами против митохондриальной транспортер Tomm20 и ER белок calnexin (рис. 6). Мы также протестировали их с антитело против гликолиз фермента GAPDH оценить цитозольной загрязнения в изолированном phagosomes. Мы нашли митохондрии и ER маркеров в S. typhimurium-изолированные phagosomes но не цитозольной загрязнения.
Для изучения универсальность протокола для изоляции бактерий содержащих phagosomes, биотин и конъюгированных стрептавидина магнитной бусины покрытие процедуры был применен к грамположительные бактерии S. aureus. Используя же фиксации и окраски протокол, как описано для mCherry -S. typhimurium (Рис. 1), мы подтвердили успешные biotinylation зеленого флуоресцентного белка (ГФП) выражая -S. aureus (рис. 7). Кроме того, мы обнаружили обогащение endosome маркер Rab7 и лизосомальных маркеры v АТФазы (V0 субъединицы) и катепсина D анализ immunoblot изолированных GFP -S. aureus-содержащих phagosomes (рис. 8). Обнаружен после 4 h инфекции в образцах изолированных фагосомы, но не в цитозольной фракции был только расщепление катепсин D в зрелые формы. Изолированные S. aureus-содержащих phagosomes были свободны от цитозольной загрязнения, как показано на immunodetection GAPDH.
В целом мы продемонстрировали, что наш Протокол изоляции фагосомы позволяет изоляции высокообогащенного бактерий содержащих phagosomes, бесплатно цитозольной загрязнения. Изолированные фагосомы препаратов может использоваться для анализа endosome и лизосомальных маркеров для изучения phagosome созревания. Кроме того было показано, что этот протокол может использоваться для грамотрицательных и грамположительных бактерий и что маркировки процедура не изменяет иммунная реакция макрофагов.
Рисунок 1: Флуоресцентной микроскопии анализ биотинилированным S. typhimurium с помощью Cy5-стрептавидина. BMDMs были инфицированы за 30 минут с mCherry -S. typhimurium что биотинилированным («биотинилированным S. Т.»), как описано в настоящем Протоколе. Не биотинилированным mCherry -S. typhimurium («Не биотинилированным S. Т.») использовался в качестве отрицательного контроля. После фиксации и permeabilization клеток образцы инкубировали с Cy5-стрептавидина 20 мин при 4 ° C. Флуоресценции сигнал от ядра (DAPI), mCherry -S. typhimuriumи Cy5-стрептавидина были проанализированы с помощью конфокальной микроскопии. Сигнал от Cy5-стрептавидина могут быть обнаружены только в бактерии, ранее помечены биотин, подтвердив тем самым эффективным biotinylation. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Микроскопические анализ BMDMs, инфицированных mCherry -S. typhimurium покрытием с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы. BMDMs были заражены mCherry -S.typhimurium помечены биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы, как описано в настоящем Протоколе. После позволяя макрофаги фагоцитируют бактерий на 30 мин, клетки были исправлены с 4% формальдегида для 20 мин на RT. Покрытые бактерии фагоцитированных макрофагами, затем были проанализированы confocal микроскопии. Анализ показал, что потребление покрытием бактерий («покрытием Ф. Т.») сопоставим с потребление немеченого mCherry бактерий («не покрытием S. Т.»), демонстрируя, что маркировка с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы не изменяют фагоцитоз S. typhimurium макрофагами. Ядра были окрашенных DAPI для микроскопии визуализации. Данные отображаются как средний ± S.E.M., и статистической значимости рассчитывается студент t-теста представлена как * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Шкалы бар = 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Секрецию ИЛ-6, BMDMs, инфицированных конъюгированных биотина и стрептавидина магнитные бусы, помечены S. typhimurium по сравнению с неподписанных Ф. typhimurium . BMDMs были заражены S. typhimurium с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы покрытием, как описано в настоящем Протоколе. После 24 h инфекции supernatants были собраны для дальнейшего анализа секреции ИЛ-6 ELISA. Supernatants формируют BMDMs, инфицированных немелованной S. typhimurium были использованы в качестве элемента управления. Индукция секреции ИЛ-6, покрытые S. typhimurium не был существенно отличается по сравнению с немелованной S. typhimurium. Данные отображаются как средний ± S.E.M., и статистической значимости, рассчитанных с использованием студент t тест представлен как * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: бактериальные обогащения в изолированных phagosomes. Обогащение mCherry тегами S. typhimurium в изолированных phagosomes, собранные после 30 мин и 4 h инфекции был по сравнению с цитозольной фракции. Β-актина был использован как элемент управления загрузки. Отрицательный контроль относится к phagosomes, изолированы с помощью немелованной S. typhimurium на 30 мин после инфекции. Как ожидается, окончательный вывод фагосомы изоляции с помощью немеченого S. typhimurium не представляют значительное количество mCherry или β-актина, демонстрируя специфику протокола. 20 мкг белка был загружен на сэмпл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Анализ endosome и лизосомальных маркеров в изолированных S. typhimurium-содержащих phagosomes. Обогащение endosome маркеры Rab5 и Rab7 и лизосомальных маркеры v АТФазы (0 V и V1 подразделения) и катепсина D был проанализирован в изолированных S. typhimurium-содержащих phagosomes, извлеченных после 30 мин и 4 h инфекции. Β-актина был использован как элемент управления загрузки. 20 мкг белка был загружен на сэмпл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Анализ и митохондрии, ER, цитозольной маркеров в изолированных S. typhimurium-содержащих phagosomes. Цитозольный маркер GAPDH, calnexin маркер ER и митохондриального маркера Tomm20 в S. typhimurium phagosomes, изолированные на 30 мин и 4 h после инфекции были проанализированы immunoblotting и по сравнению с соответствующим цитозольной фракции. 20 мкг белка были загружены на сэмпл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: Микроскопические анализ GFP -S. aureus зараженные макрофаги. BMDMs были инфицированы S. золотистого стафилококка , выражая Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) помечены wiй биотина, как описано в методологии для маркировки S. typhimurium. После позволяя макрофаги фагоцитируют бактерий на 30 мин, клетки были исправлены. Неглазированные S. aureus («не биотинилированным S. А.») были использованы в качестве отрицательного контроля. После фиксации и permeabilization клеток образцы инкубировали с Cy5-стрептавидина 20 мин при 4 ° C. Флуоресцентный сигнал от ядра (DAPI), GFP -S. золотистого стафилококкаи Cy5-стрептавидина были проанализированы confocal микроскопии. Сигнал от Cy5-стрептавидина можно увидеть только в ранее помечены биотин, подтверждающие эффективное biotinylation бактерий. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: Анализ endosome и лизосомальных маркеров в изолированных S. стафилококк-содержащих phagosomes. Ф. стафилококк-содержащих phagosomes, изолированные на 30 мин, 2 h и 4 h после инфекции, были проанализированы immunoblotting для phagosomal маркеров Rab5, Rab7 и v АТФазы, по сравнению с соответствующим цитозольной фракции. 20 мкг белка были загружены на сэмпл. Образцы были также протестированы с специфическим антителом против GAPDH, демонстрируя, что изолированные S. стафилококк-содержащих phagosomes свободны от цитозольной загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Новый метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes, покрывая бактерий с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы описано здесь. После нежный нарушения клеточной мембраны бактерии содержащих phagosomes могут быть легко извлечены с помощью магнитной стойке. Мы показывают, что маркировка бактерий сохраняет возбудителя способность вызвать воспаление и не изменяет свойство фагоцитарной принимающей ячейки. Важно отметить, что phagosomes, полученные этим методом обогащаются в бактериях и endosome/Лизосома маркеры и лишенный цитозольной загрязнения.
Этот метод предоставляет несколько преимуществ по сравнению с традиционной фагосомы изоляции метод, который использует градиент разделения сахарозы. Это устраняет много времени несколько шагов центрифугирования, позволяя исследователь обрабатывать больше образцов в меньше времени и получить образцы чище фагосомы, легко увеличивая количество мытья шаги. Использование этого протокола устраняет потребность в специальных и чувствительных оборудование, например ultracentrifugation. Высокая скорость центрифугирования может изменить характеристики везикулы и уменьшить окончательный выход22, которая избегает в настоящем Протоколе. Мы также показали, что покрытие S. typhimurium с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы не изменяет объем фагоцитирующих макрофагов. Кроме того индукции ИЛ-6 макрофагами, инфицированных с маркировкой S. typhimurium был неизменным по сравнению с макрофагами, инфицированных немеченого бактерий. Таким образом покрытие S. Typhimurium не вызывают существенных изменений в их патогенности. К нашему знанию покрытие S. typhimurium не представляют препятствием для использования изолированных phagosomes для любого из общих методов анализа лаборатории.
S. typhimurium-содержащих phagosomes, изолированные этим методом обогащены бактерий и настоящем от типичных англ и лизосомальных маркеров, как v АТФазы субблоков V0 и V1 и рассеченного Зрелые протеазы Катепсин D, которые могут быть обнаружены только в изолированных фагосомы фракций. Кроме того мы нашли митохондрии и ER маркеров в изолированных S. typhimurium-содержащих phagosomes. Взаимодействие phagosomes с ER широко изучен, хотя количество белков от присутствующих в ER возбудителя содержащих phagosomes может варьироваться с возбудителя изучал и тип ячейки. К примеру phagosomes, содержащие бруцеллы абортуса изолированы от Непрофессиональные фагоциты богаты ER маркеры23 , но не те, которые изолированы от макрофагов24. Calnexin был обнаружен ранее в S. Typhimurium содержащих phagosomes изолированные сахарозы градиента18. Тесное взаимодействие инертного шарик содержащих phagosomes и митохондрий был также сообщалось ранее25, объясняя присутствие Tomm20 в изолированных phagosomes. Митохондриальных протеинов были найдены в изолированных phagosomes, содержащие L. pneumophila26 или27 микобактерии. Однако, обнаружение компонентов митохондрий в подготовке изолированных возбудителя содержащих phagosomes с помощью метода градиентного центрифугирования сахарозы часто были считается благодаря одинаковой плотности этой органелле и возбудитель содержащих фагосомы и, следовательно, неспецифическая28. Наш метод избегает такой проблемой загрязнения и обеспечивает более надежную информацию о том, что митохондриальной мембраны может смешиваться с phagosomal мембраны. В целом, это будет трудно избежать ER и митохондриальной маркеров в возбудитель содержащих изолированные phagosomes препаратов, в зависимости от типа клеток хост и возбудителя. Рекомендуемый метод для проверки чистоты изолированных phagosomes является использование меткой бактерии и конкретного тега антитела для обнаружения бактерий западной помарки. Мы также показывают, что этот метод изоляции могут быть адаптированы для других микроорганизмов с доступные поверхности Амин группами, которые могут быть биотинилированным. В качестве примера, мы успешно применен наш протокол изолировать S. aureus-содержащих phagosomes. Phagosomes, содержащие S. aureus , изолированные, используя этот протокол обогащенный лизосомальных и endosome маркеры, такие как v АТФазы (V0 субъединицы) и Rab7, соответственно, но не представляют цитозольной маркеры, такие как GAPDH.
От англ/phagosomal везикулы обеспечивают уникальные условия для деградации патогенов, но сохранить антигены для адаптивной иммунной системы сигнализации. Несмотря на то, phagosomes и процесс созревания широко исследованы, микроокружения в фагосомы после размещения различных возбудителей остается труднодостижимой. Также неясно как метаболические изменения в клетках изменить фагосомы созревания и его содержание. Таким образом протокол, подробно здесь дает больше возможностей для изучения биогенеза фагосомы и ее функции в контексте различных патологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Робинсон поддерживается финансирование из Кельна Excellence кластера на клеточных реакций стресс в Aging-Associated заболеваниях, Кёльнского университета, Германия (CECAD; финансируемых DFG в рамках инициативы превосходство немецкого федерального и Государственный правительства) и гранты от Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune и Мария-Pesch фонд университета Кельна, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
