Summary
Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.
Abstract
Salmonella typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S.. typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em vesículas, conhecidas como phagosomes, a fim de ser degradado. Isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes têm sido amplamente utilizados para estudar como S. typhimurium infecção altera o processo de maturação do fagossoma para prevenir a degradação bacteriana. Classicamente, o isolamento de bactérias contendo phagosomes foi executada por centrifugação gradiente de sacarose. No entanto, esse processo é demorado e requer equipamento especializado e um certo grau de destreza. Descrito aqui é um método simples e rápido para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com grânulos magnéticos estreptavidina-biotina-conjugados. Phagosomes obtidos por esse método podem ser suspenso em qualquer reserva de escolha, permitindo a utilização de phagosomes isolados para uma ampla gama de ensaios, tais como análise de proteínas, metabólito e lipídios. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é rápida, eficiente e específico, requer equipamento mínimo e é mais versátil do que o método clássico de isolamento por gradiente de sacarose-ultracentrifugação.
Introduction
Os macrófagos estão circulando em células fagocíticas especializadas que detectam, englobam e degradam qualquer partícula estranha presente em tecidos periféricos, variando de pilhas apoptotic a invadir microorganismos tais como bactérias. Em cima da superfície mediada reconhecimento de marcadores específicos do patógeno comumente presentes na superfície dos microorganismos (conhecido como patógeno associado a padrões moleculares ou PAMPs), macrófagos iniciar uma complexa reorganização da membrana celular em fim de cercar e phagocytize o patógeno1.
O patógeno tragado então contido pelo macrófago em uma vesícula intracelular denominada fagossomo. Através de uma série de fusão e fissão eventos com outras vesículas como endossomos e lisossomos, o patógeno contendo fagossoma adquire um conjunto de proteínas necessárias para a eliminação do conteúdo phagosomal. Portanto, a composição enzimática do fagossomo é altamente variável no decurso deste processo, conhecido como fagossoma maturação2.
Logo após a fagocitose, a complexo ATPase vacuolar (v-ATPase) da membrana do fagossomo é incorporada por fusão com endossomos3multiméricas. Este complexo utiliza ATP para bombear protões do citosol para o lúmen do fagossoma4. Acidificação do fagossomo é essencial para os eventos de fusão com outras vesículas5 e para a ativação de um grande número de enzimas degradativos dependente do pH6. Outra multiméricas complexo enzimático que é rapidamente montado na membrana do fagossomo é o complexo NADPH-oxidase (NOX). NOX complexo oxida NADPH para produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) que são segregadas para o lúmen do fagossoma e que contribuem significativamente para a matança do tragado microorganismos7.
Durante os passos iniciais da maturação, phagosomes apresentar marcadores normalmente como Rab5 e Rab7 de endossomos cedo e tarde, respectivamente, juntamente com a subunidade de0 V do v-ATPase8. Fusão de phagosomes com lisossomos e tarde endossomos resulta na exposição do patógeno fagocitada para uma grande variedade de enzimas hidrolíticas, como proteases catepsina, lipases e β-galactosidase9. Acidificação do lúmen é também necessária para a ativação destas enzimas. Por exemplo, a clivagem de catepsina D para produzir o formulário curto ativo é dependente do pH10. Essas enzimas degradam o patógeno e mediam a produção de derivados de patógeno peptides curtos que são apresentados pelas macrófago histocompatibilidade (MHC) classe II moléculas complexas de células T para desencadear uma resposta imune adaptativa11.
Daí, maturação do fagossoma é crucial para a resposta imune inata e links braços do sistema imune inatos e adaptativos. Não é nenhuma surpresa que os patógenos desenvolveram estratégias para superar a eliminação por macrófagos pelo processo de maturação do fagossoma acima descritas. Por exemplo, a bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis e Legionella pneumophila impede a maturação do fagossoma inibindo v-ATPase assembly e o lúmen consequente acidificação12,13 . Outras bactérias, como a Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induzem a formação de poros na membrana do fagossomo de escapar para o citosol14,15. Por outro lado, Salmonella enterica sorovar typhimurium (S. typhimurium) é capaz de modificar as propriedades do fagossomo dentro do vacúolo para transformá-lo em um local adequado para a sua replicação16. Esta habilidade faz S. typhimurium um modelo muito interessante para estudar a interferência mediada por patógeno de maturação do fagossoma.
S. typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S. Typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em phagosomes17. Alguns relatos têm descrito anteriormente que S. typhimurium-contendo phagosomes fabricantes para ambos os endossomos e lisossomos18do presente, e outros estudos encontraram fusão fagossoma-lisossoma prevenida sobre S. Typhimurium infecção19.
Inicialmente, maturação de fagossoma com S. typhimurium infecção foi investigada por microscopia de imunofluorescência. O desenvolvimento de técnicas para o isolamento de bactérias contendo phagosomes habilitado para um estudo mais preciso do conteúdo do fagossoma em termos de marcadores endossomo e lisossomo. Até à data, o principal método usado para o isolamento de bactérias contendo phagosomes é o fraccionamento subcelular em sacarose passo gradientes18,20. No entanto, este método requer várias etapas de centrifugação que podem causar danos mecânicos ao phagosomes, podem afetar a estabilidade dos componentes phagosomal (proteínas e lipídios) e é demorado. Além disso, exige o uso de um se: um pedaço de equipamento especializado que não é acessível para todos os laboratórios.
Recentemente, uma nova abordagem foi aplicada para o isolamento de bactérias contendo phagosomes, em que os patógenos bacterianos são rotulados com lipopetide biotinilado (Lipobiotin) e mais tarde extraído usando grânulos magnéticos estreptavidina conjugada21 . Propomos um método alternativo complementar através da marcação de macromoléculas contendo amina superfície bacterianas com NHS-biotina seguido por grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. Phagosomes obtidos por esse método são altamente enriquecidos em marcadores endossomo e lisossoma e podem ser usados para uma ampla gama de ensaios, de análise de proteínas para análise omics. Além disso, não requer equipamento especializado como ultracentrifuges. Além disso, eliminando as etapas de centrifugação, tanto os danos mecânicos à phagosomes e a quantidade de tempo empregado são consideravelmente reduzidos. Esse método pode ser facilmente adaptado para o isolamento de phagosomes contendo outras bactérias, tais como o Gram-positivas Staphylococcus aureus, também incluído neste manuscrito. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é um simples, econômico, e menos demorada do que a clássico isolamento por sacarose gradiente-ultracentrifugação, tornando-se altamente enriquecido contendo bactérias phagosomes.
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Protocol
todas as etapas que envolvam a utilização de patogenicidade S. typhimurium deve ser efectuada em BSL-2 ou superior unidade de nível de segurança biológica. A cultura e o revestimento do S. Typhimurium, bem como a infecção de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) deve ser realizada sob uma capa de fluxo laminar para evitar a contaminação. O isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes pode ser executada em qualquer bancada de laboratório BSL-2.
extração de medula óssea de ratos para sua diferenciação em macrófagos foi efectuada de acordo com as normas institucionais sobre o bem-estar animal e aprovada pela Agência para a natureza, estado da Renânia do Norte-Vestefália Ambiente e defesa do consumidor [turismo für Natur, Umwelt e Nordrhein-Westfalen de Verbraucherschutz (LANUV); Arquivo n: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e a Universidade de colônia.
1. Culturing, S. typhimurium
- inóculo S. typhimurium (Estirpe SL1344) de uma única colônia bacteriana em 5 mL de caldo de infusão (BHI) coração cérebro usando um loop bacteriano.
- Incube a suspensão bacteriana em uma incubadora a 37 ° C durante a noite com tremendo.
- No dia seguinte, transfira 1 mL da suspensão bacteriana em 19 mL de caldo BHI em um Erlenmeyer e incubar a 37 ° C numa incubadora com agitação.
- Monitorar o S. typhimurium crescimento através da medição da densidade óptica (OD) em 600 nm (OD 600) com um espectrofotômetro. As medidas devem ser tomadas aproximadamente cada 30 min.
- OD quando 600 atinge 1.0, retire a suspensão bacteriana da incubadora e transferência para tubo de 50 mL. Centrifugar as bactérias a 5.400 x g, durante 15 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender em 10 mL de salina tampão fosfato (PBS).
- Centrifugar a 5.400 x g, durante 15 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 4,9 mL de PBS estéril.
2. Revestimento de S. typhimurium com grânulos magnético NHS-biotina/estreptavidina-conjugados
- Adicione 100 µ l de 10 mg/mL biotina vinculando a solução (NHS-biotina dissolvido em dimetilsulfóxido, DMSO) preparada na hora, para a suspensão bacteriana preparado na etapa anterior. Por exemplo, dilua 5 mg de NHS-biotina em 0,5 mL de DMSO estéril. Mix corretamente pipetando subindo e descendo várias vezes.
- Dividir a mistura em cinco tubos de 1,5 mL.
- Incubar por 2 h à temperatura ambiente (RT) sobre uma thermoblock com agitação constante a 350 rpm.
- Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos a RT e descartar o sobrenadante.
- Resuspenda em 1 mL de PBS estéril, centrifugar 15.000 x g por 10 min a RT e descartar o sobrenadante.
- Repita etapa 2.5 mais duas vezes para remover completamente a excesso biotina vinculando solução.
- Após a última lavagem, resuspenda o pellet em 1 mL de PBS estéril.
- Transferir 100 µ l de solução de grânulos magnético estreptavidina conjugada com 10 mg/mL em um tubo de 1,5 mL e deixá-lo na prateleira magnética 5 min.
- Remover o solvente com uma pipeta, tomar a solução de grânulos magnético streptavidin-conjugados de rack magnético e ressuspendê-lo com 1 mL de suspensão bacteriana revestida de biotina preparado no passo 2.7.
- Incubar por 1h no RT em uma thermoblock com agitação constante a 350 rpm.
- Coloque a solução na prateleira magnética; esperar 5 min e depois remover com uma pipeta as bactérias que não adere na parede (mantê-lo em um tubo rotulado como " bactérias não revestidos "). A fração aderindo à parede do tubo em contato com o ímã é as bactérias biotina/estreptavidina-revestido.
- Remover o tubo contendo a bactéria rotulada de rack magnético e ressuspender em 1 mL de PBS estéril.
- Colocá-lo novamente na prateleira magnética, esperar por 5 min e usar uma pipeta para remover a PBS.
- Repita etapas 2.13 e 2.14 mais duas vezes para remover todas as bactérias que não são revestidas com os grânulos magnéticos estreptavidina conjugada.
- Após a última lavagem, resuspenda as bactérias revestido em 500 µ l de PBS estéril e rotular o tubo como " revestido de bactérias ".
- Contar a colônia formando unidades (cfu) de ambos " decapada bactérias " e " revestido de bactérias " soluções do chapeamento seriais diluições em placas de ágar BHI. Aproximadamente 2 x 10 8 UFC/mL de bactérias revestidas são obtidos a partir de 20 mL da suspensão bacteriana inicial com OD 600 de 1.0. Manter a suspensão bacteriana revestida a 4 ° C, para ser usado no dia seguinte para infectar os macrófagos.
3. Infecção de BDMDs
- no mesmo dia, quando as bactérias são revestidas com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada placa totalmente diferenciadas BMDMs 22 em pratos de 6 cm em uma densidade de 5 x 10 6 células por prato.
- No dia seguinte, centrifugar a suspensão bacteriana revestida a 15.000 x g por 5 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma concentração de 10 x 10 6 UFC/mL.
- Para infectar os macrófagos em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, remover o meio dos BMDMs e adicionar 5 mL de suspensão bacteriana revestida preparado. MOI ideal poderão ser avaliado para cada tipo de célula ou finalidade experimental das isolados phagosomes.
- Incubar em RT para 10 min para sincronizar fagocitose.
- Incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO 2 por 30 min iniciar a fagocitose. Outros tipos de células podem exigir diferentes incubações para assegurar a internalização das bactérias.
- Retire o meio contendo bactérias os pratos e lavar as células com RPMI três vezes para remover as bactérias não-internalizada.
- Finalmente, adicionar 10 mL de RPMI contendo 10% FBS e 50 µ g/mL gentamicina para matar todas as bactérias não-fagocitadas.
- Incubar os BMDMs infectados a 37 ° C com 5% CO 2 até que ponto o tempo desejado. Ponto de tempo desejado deve ser determinado experimentalmente de acordo com as bactérias e tipo de células utilizado e a finalidade da análise. Para o estudo dos primeiros eventos de fusão endossomo-fagossoma em S. BMDMs infectadas typhimurium, recomenda-se uma incubação 30 min. Para a análise dos acontecimentos posteriores, phagosomes podem ser extraídos após 2h ou 4h de incubação. Incubação prolongada de macrófagos com S. Typhimurium além 24h resulta em morte de macrófagos. Estendido a infecção intracelular antes da extração do fagossoma provavelmente pode levar a degradação de moléculas de biotina. No entanto, nós não observaram perda de biotina na revestido-bactérias até 24 h.
4. Isolamento de S. typhimurium-contendo Phagosomes
- preparar o volume do fagossoma necessário buffer de isolamento um (50 mM tubos, pH.7, 50mm MgCl 2, 5mm EGTA) pela adição de ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 1 mM, citocalasina B para um final concentração de 10 µM e protease e fosfatase inibidores como recomendado pelo fabricante.
Nota: TDT e Cytochalasin B devem ser adicionado para o tampão de isolamento do fagossoma A sempre imediatamente antes da utilização. Cytochalasin B interrompe o citoesqueleto, facilitando a ruptura da membrana celular. - Na altura desejada aponte, remover o meio das células infectadas e lavar com PBS estéril, aquecido a RT.
- Adicionar 750 µ l de phagosomisolamento e tampão A por prato e incubar 20 min no gelo. Quando usando números de telemóvel diferentes, o volume de tampão de isolamento A deve ser ajustado proporcionalmente.
- Adicionar 250 µ l de tampão de isolamento do fagossoma B (tubos de 50 mM, pH.7, 50mm MgCl 2, 5mm EGTA, 220 mM manitol e sacarose 68 milímetros). A placa para assegurar que o buffer alcança a superfície total do prato de pedra. Quando usando números de telemóvel diferentes, o volume de tampão de isolamento B deve ser ajustado proporcionalmente.
- Remover as células do prato raspando suavemente usando um policial de borracha e transfira para um tubo previamente refrigerados 1,5 mL.
- Passar a suspensão de células através de uma agulha 26G utilizando uma seringa de 1 mL pelo menos 15 vezes (uma aspiração mais uma ejeção da contagem de suspensão de células como uma vez). Isto é o suficiente para liberar o conteúdo citosólico do BMDMs. O número de passes através da agulha deve ser otimizado para cada tipo de célula.
- Coloque a suspensão de eritrócitos na prateleira magnética e espere 5 min. As partículas anexadas ao ímã são as phagosomes que contenham revestido - S. Typhimurium. A suspensão contém o resto dos componentes celulares.
- Transferir a suspensão em um tubo de 1,5 mL rotulado como " citosol ".
- Retire o tubo com os phagosomes isolados do rack magnético e Resuspenda-los em 1 mL de PBS estéril.
- Coloque a suspensão do fagossoma na prateleira magnética, aguarde 5 min e remova a PBS.
- , Repita os passos 4.9 e 4.10 para lavar os isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes.
- Finalmente remover a PBS e Resuspenda os phagosomes no buffer necessário; por exemplo, em um buffer de ensaio (RIPA) radioimmunoprecipitation para análise de proteínas. Aproximadamente 50-200 µ g de proteína é obtida por amostra seguindo este protocolo, dependendo a quantidade inicial de células e o MOI de infecção.
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Representative Results
Isolamento de bactérias contendo phagosomes pelo presente protocolo requer o biotinylation das bactérias como um primeiro passo. Avaliamos, portanto, a eficácia da S. typhimurium biotinylation por análise de microscopia confocal de BMDMs infectados com biotinilado mCherry -S. typhimurium rotulado com Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs foram infectados conforme descrito neste protocolo com mCherry -S. typhimurium biotinilado anteriormente mas não incubados com grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. Após 30 min de incubação a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS quente e fixadas com formol 4% por 20 min em RT. fixação foi interrompido por extensiva lavagem com PBS. As células foram então permeabilizadas com 3% Triton em PBS durante 5 min à RT. infectado BMDMs foram então incubadas com Cy5-Streptavidin por 20 min a 4 ° C. Após a lavagem extensa, as amostras foram preparadas para análise por microscopia confocal (Figura 1). Não biotinilado mCherry -S. Typhimurium foi usado como controle negativo. Sinal fluorescente de Cy5-Streptavidin observou-se exclusivamente em biotinilado mCherry -S. typhimurium, confirmar que biotinylation das bactérias foi bem sucedida. Análise microscópica foi realizada em um microscópio confocal, usando "60 X O2 at: 1.40" objectivo. Comprimentos de onda de excitação para os fluorochromes foram 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry) e 635 nm (Cy5) e PGTO tensão foi fixada em 574v, 565v e 443v, respectivamente.
Desde a resposta imune desencadeada em macrófagos por S. typhimurium é largamente dependente a ativação de receptores de superfície de macrófagos por ligantes bacterianas, em seguida testamos se o revestimento de S. typhimurium com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos poderia alterar a resposta imune inata em BMDMs infectados. Primeiro foram avaliados se revestindo de S. typhimurium poderia alterar a capacidade fagocitária de BMDMs por microscopia confocal. BMDMs foram infectados conforme descrito neste protocolo com mCherry -S. Typhimurium revestido com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada com ou sem revestimento mCherry -S. typhimurium. Após 30 min de incubação a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS quente e fixadas com formol 4% por 20 min no RT Após a ampla lavagem com PBS, as amostras foram preparadas para análise por microscopia confocal. Como mostrado na Figura 2, os macrófagos fagocitadasm revestidos e não revestidos mCherry -S. typhimurium igualmente.
Em seguida, analisamos a resposta inflamatória desencadeada por S. typhimurium revestido com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos (Figura 3). Sobrenadantes dos BMDMs infectados com revestidos e não revestidos S. typhimurium foram coletadas após 24 h de infecção por ensaio imunoenzimático (ELISA) de secretada interleucina-6 (IL-6). O revestimento de S. typhimurium com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada não alterou significativamente a resposta inflamatória de macrófagos.
Para avaliar a pureza dos phagosomes contendo bactérias obtidas empregando este protocolo analisamos isolado mCherry -S. typhimurium-contendo phagosomes pelo immunoblotting. Usando anticorpos específicos contra a tag mCherry, encontramos o significativo enriquecimento de mCherry-expressando S. typhimurium em phagosomes isolados, em comparação com a fração citosólica obtidos a partir da mesma amostra (Figura 4). Phagosomes isolados contendo mCherry - S. typhimurium que não foi previamente revestido com biotina foram utilizados como controle negativo. Estes resultados demonstram que este protocolo permite a purificação de phagosomes que são altamente enriquecido em bactérias.
Em seguida realizamos immunoblot análise de marcadores endossomo e lisossomo em phagosomes isolados contendo S. typhimurium (Figura 5). A maioria dos marcadores endossomo e lisossoma claramente foram observada em phagosomes isolados no pós-infecção de 4h em comparação com 30 min. O enriquecimento dos marcadores CDDP Rab5 e Rab7, bem como o lisossoma marcadores v-ATPase (V0 e subunidades de1 V) e catepsina D, foram observados. Curiosamente, observou-se apenas a forma clivada de catepsina D em phagosomes isolados na pós-infecção 4 h. A clivagem da pró-catepsina D (48 kDa) para produzir a forma abreviada de ativa (33 kDa) ocorre somente nos phagosomes, mas não no citosol, demonstrando a especificidade deste protocolo para a isolação do fagossoma.
Desde marcadores de organelas como mitocôndrias ou retículo endoplasmático (ER) são detectados frequentemente em preparações de bactérias contendo isolados phagosomes, o S. typhimurium-contendo phagosomes isoladas foram analisados com anticorpos específicos contra o transportador mitocondrial Tomm20 e a proteína de ER calnexin (Figura 6). Nós também testamos com um anticorpo contra a enzima da glicólise GAPDH para avaliar a contaminação citosólica nas phagosomes isoladas. Encontramos tanto mitocôndrias e marcadores de ER em S. typhimurium-isolado phagosomes mas nenhuma contaminação citosólica.
Para estudar a versatilidade do protocolo para isolamento de bactérias contendo phagosomes, a biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada procedimento de revestimento foi aplicado para a bactéria Gram-positiva, S. aureus. Empregando a mesma fixação e coloração de protocolo conforme descrito por mCherry -S. typhimurium (Figura 1) confirmámos sucesso biotinylation da proteína verde fluorescente (GFP) expressando -S. aureus (Figura 7). Além disso, detectamos o enriquecimento do marcador o endossomo Rab7 e a lisossoma marcadores v-ATPase (subunidade de0 V) e isolado de catepsina D por immunoblot análise de GFP -S. aureus-contendo phagosomes (Figura 8). A clivagem de catepsina D em sua forma madura foi apenas detectável após 4 h de infecção nas amostras isoladas fagossoma mas não nas fracções citosólica. Isolados de S. aureus-phagosomes contendo estavam livres de contaminação citosólica conforme mostrado pelo immunodetection de GAPDH.
Em resumo, temos demonstrado que nosso protocolo de isolamento do fagossoma permite o isolamento de altamente enriquecidos phagosomes de bactérias contendo, livres de contaminação citosólica. Os preparativos do fagossoma isolado podem ser usados para a análise de marcadores endossomo e lisossoma para estudar phaEutenho maturação. Além disso, foi demonstrado que este protocolo pode ser usado por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e que o processo de rotulagem não altera a resposta imune de macrófagos.
Figura 1: Análise de microscopia de fluorescência de biotinilado S. typhimurium usando Cy5-Streptavidin. BMDMs foram infectados por 30 min com mCherry -S. typhimurium foi biotinilado ("biotinilado S. T."), conforme descrito no presente protocolo. Não biotinilado mCherry -S. typhimurium ("Não biotinilado S. T.") foi usado como um controle negativo. Após a fixação e permeabilização das células, as amostras foram incubadas com Cy5-Streptavidin por 20 min a 4 ° C. Sinal de fluorescência do núcleo (DAPI), mCherry -S. typhimuriume Cy5-Streptavidin foram analisados utilizando microscopia confocal. Sinal do Streptavidin-Cy5 só pode ser detectado na bactéria previamente marcada com biotina, confirmando assim a eficiente biotinylation. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise microscópica de BMDMs infectados com mCherry -S. typhimurium revestido com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. BMDMs foram infectados com mCherry -S.typhimurium , rotulado com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos conforme descrito neste protocolo. Após permitir os macrófagos para phagocytize as bactérias por 30 min, as células foram fixadas com formol 4% por 20 min no RT As revestido de bactérias fagocitadas por macrófagos foram então analisados por microscopia confocal. A análise mostrou que a ingestão de bactérias revestidas ("revestido de S. T.") é comparável com a ingestão de bactérias sem título mCherry ("não revestido S. T."), demonstrar que etiquetando com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada não altera a fagocitose de S. typhimurium por macrófagos. Núcleos estavam manchados com DAPI para visualização de microscopia. Dados são apresentados como média ± no MEV mostrou, e a significância estatística calculada usando estudante t-teste é representado como * = p < 0,05; * * = p < 0,01; = p < 0.001. Barra de escala = 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Secreção de IL-6 por BMDMs infectado com biotina e-streptavidin-conjugada com grânulos magnéticos, rotulados S. typhimurium comparado com sem rótulo S. typhimurium . BMDMs foram infectados com S. typhimurium revestido com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos conforme descrito neste protocolo. Após 24 h de infecção, os sobrenadantes foram coletados para posterior análise da secreção de IL-6 por ELISA. Sobrenadantes formam BMDMs infectados com não revestidos S. typhimurium foram utilizados como controle. A indução da secreção de IL-6 por revestido S. typhimurium não foi significativamente diferente comparada com a de não revestidos S. typhimurium. Dados são apresentados como média ± no MEV mostrou, e a significância estatística calculada usando o teste t de student é representada como * = p < 0,05; * * = p < 0,01; = p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: enriquecimento bacteriano em isolado phagosomes. Enriquecimento de mCherry-tag S. typhimurium em phagosomes isolados coletados após 30 min e 4h de infecção foi comparado com a fração citosólica. Β-actina foi usado como um controle de carregamento. O controlo negativo refere-se a phagosomes isolados usando sem revestimento S. typhimurium a pós-infecção 30 min. Como esperada, a saída final do isolamento do fagossoma usando sem rótulo S. typhimurium não apresenta quantidades significativas de mCherry ou β-actina, demonstrando a especificidade do protocolo. 20 µ g da proteína foi carregado por amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de marcadores endossomo e lisossomo em isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes. O enriquecimento dos marcadores o endossomo Rab5 e Rab7 e lisossoma marcadores v-ATPase (V0 e V1 subunidades) e catepsina D foi analisado em isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes extraídos após 30 min e 4h de infecção. Β-actina foi usado como um controle de carregamento. 20 µ g da proteína foi carregado por amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise das mitocôndrias, ER e marcadores citosólico em isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes. O marcador citosólico GAPDH, o ER calnexin de marcador e o marcador mitocondrial Tomm20 em S. typhimurium phagosomes isolados em 30 min e 4h pós infecção foram analisados pelo immunoblotting e comparados com as frações correspondentes citosólica. 20 µ g da proteína foram carregados por amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise microscópica de GFP -S. aureus infectadas macrófagos. BMDMs foram infectados com S. aureus expressando a proteína verde fluorescente (GFP) rotulado wiBiotina th conforme descrito na metodologia para rotulagem S. typhimurium. Após permitir macrófagos para phagocytize as bactérias por 30 min, as células foram fixadas. Não revestidos de S. aureus ("não biotinilado S. R.") foram utilizados como controle negativo. Após a fixação e permeabilização das células, as amostras foram incubadas com Cy5-Streptavidin por 20 min a 4 ° C. O sinal fluorescente do núcleo (DAPI), GFP -S. aureuse Cy5-Streptavidin foram analisadas por microscopia confocal. O sinal de Cy5-Streptavidin só pode ser visto na bactéria previamente marcada com biotina, confirmando biotinylation eficiente. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de marcadores endossomo e lisossomo em isolados de S. aureus-contendo phagosomes. S. aureus-contendo phagosomes isolados em 30 min, 2h e 4h pós infecção, foram analisadas pelo immunoblotting para marcadores phagosomal Rab5, Rab7 e v-ATPase em comparação com as frações correspondentes citosólica. 20 µ g da proteína foram carregados por amostra. As amostras também foram testadas com um anticorpo específico contra a GAPDH, demonstrando que isolado S. aureus-phagosomes contendo estão livres de contaminação citosólica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um novo método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos é descrito aqui. Após suave rompimento da membrana celular, que contêm bactérias phagosomes podem ser facilmente extraídos usando um rack magnético. Mostramos que a rotulagem das bactérias preserva a capacidade do patógeno para induzir a inflamação e não altera a propriedade fagocítica da célula hospedeira. Importante, phagosomes obtidos por esse método são enriquecidos em bactérias e endossomo/lisossoma marcadores e desprovido de contaminação citosólica.
Esse método apresenta diversas vantagens quando comparado com o método de isolamento do fagossoma tradicional que emprega separação gradiente de sacarose. Elimina o demorado várias etapas de centrifugação, permitindo que o pesquisador lidar com amostras mais em menos tempo e obter mais puras amostras do fagossoma, facilmente, aumentando o número de etapas de lavagem. O uso deste protocolo elimina a necessidade de equipamento especializado e sensível, tais como ultracentrifugação. Centrifugação de alta velocidade poderia alterar as características das vesículas e reduzir o rendimento final22, que é evitada neste protocolo. Também demonstrámos que o revestimento do S. typhimurium com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada não altera a capacidade fagocitária dos macrófagos. Além disso, a indução de IL-6 por macrófagos infectados com rotulado S. typhimurium foi inalterado em comparação com os macrófagos infectados com bactérias sem rótulo. Portanto, revestimento de S. Typhimurium não induz mudanças significativas em sua patogenicidade. A nosso conhecimento, revestimento de S. typhimurium não representa um obstáculo para o uso das phagosomes isoladas para qualquer uma das técnicas de análise de laboratório comuns.
S. typhimurium-phagosomes contendo isolados por esse método são enriquecidos em bactérias e CDDP típico presente e marcadores dos lisossomos, tais como o v-ATPase subunidades V0 e V1 e a protease madura clivada catepsina D, que pode ser detectada apenas em frações isoladas fagossoma. Além disso, encontramos as mitocôndrias e marcadores de ER em isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes. Interação do phagosomes com a ER tem sido amplamente estudada, embora a quantidade de proteínas da emergência presente em phagosomes contendo agente patogénico podem variar com o patógeno estudados e o tipo de célula. Por exemplo, phagosomes contendo Brucella abortus isoladas de fagócitos não profissionais são ricas em ER marcadores23 mas não os isolados de macrófagos24. Calnexin tem sido detectada em S. Phagosomes typhimurium contendo isolados por gradiente de sacarose18. Forte interação entre inerte do grânulo contendo phagosomes e mitocôndrias também tem sido relatado anteriormente25, explicando a presença de Tomm20 em phagosomes isolados. Proteínas mitocondriais foram encontradas em phagosomes isolados contendo L. pneumophila26 ou Mycobacterium27. No entanto, a detecção de componentes de mitocôndrias em preparações de isolado contendo patógeno phagosomes usando o método de centrifugação gradiente de sacarose tem frequentemente sido acredita-se ser devido à densidade semelhante desta organela e a patógeno-contendo fagossoma e, portanto, inespecíficos28. Nosso método evita uma questão tão contaminação e fornece informações mais confiáveis, sugerindo que as membranas mitocondriais podem misturar-se com as membranas phagosomal. Em resumo, será difícil evitar ER e mitocondriais marcadores no patógeno contendo isolada preparações phagosomes, dependendo do tipo de célula do hospedeiro e do patógeno. O método recomendado para a verificação da pureza das phagosomes isoladas é usar a tag-bactérias e anticorpos específicos de marca para a detecção de bactérias por Western Blot. Também mostramos que esse método de isolamento pode ser adaptado para outros microorganismos com grupos amina de superfície disponíveis que podem ser biotinilado. Como exemplo, temos aplicado com sucesso nosso protocolo para isolar o S. aureus-contendo phagosomes. Phagosomes contendo S. aureus isoladas usando este protocolo são enriquecidos em marcadores lisossoma e endossomo como v-ATPase (subunidade de0 V) e Rab7, respectivamente, mas não apresentam marcadores citosólica como GAPDH.
Vesículas CDDP/phagosomal fornecem ambientes únicos para a degradação de agentes patogénicos, mas preservar os antígenos para o sistema imune adaptativo de sinalização. Embora, phagosomes e o processo de maturação tem sido extensivamente investigados, o microambiente no fagossomo com Hospedagem de vários patógenos continua elusiva. Também não está claro como alterações metabólicas nas células alteram maturação do fagossoma e seu conteúdo. Portanto, o protocolo detalhado aqui dá mais oportunidades para estudar a biogênese do fagossoma e sua função no contexto de diversas patologias.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa no laboratório de Robinson é suportada pelo financiamento do Cluster de excelência Colónia na resposta de estresse celular em doenças Aging-Associated, Universidade de Colónia, Alemanha (CECAD; financiado pelo DFG no quadro da iniciativa de excelência da federal alemão e os governos do estado) e bolsas da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria Pesch Fundação da Universidade de Colónia, Alemanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
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