Summary
Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.
Abstract
Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l'utilizzazione dell'isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l'analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.
Introduction
I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d'invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l' agente patogeno1.
L'agente patogeno tratta quindi è contenuto dal macrofago in una vescicola intracellulare conosciuto come fagosoma. Attraverso una serie di fusione e fissione eventi con altre vescicole come gli endosomi ed i lisosomi, contenenti patogeno phagosome acquisisce una serie di proteine necessarie per l'eliminazione del contenuto phagosomal. Pertanto, la composizione enzimatica di phagosome è altamente variabile nel corso di questo processo, noto come phagosome maturazione2.
Poco dopo la fagocitosi, il multimerici complessi vacuolar ATPasi (v-ATPasi) sono incorporato nella membrana del fagosoma da fusione con gli endosomi3. Questo complesso utilizza ATP ai protoni pompa dal cytosol al lumen del fagosoma4. L'acidificazione di phagosome è essenziale per gli eventi di fusione con altre vescicole5 e per l'attivazione di un gran numero di enzimi degradativi dipendente dal pH6. Un altro complesso enzimatico multimerici che è rapidamente assemblato sulla membrana phagosome è il complesso di NADPH-ossidasi (NOX). Complesso di NOX si ossida NADPH per la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono secreti nel lume del fagosoma e che contribuiscono significativamente all'uccisione dei microrganismi tratta7.
Durante le fasi iniziali di maturazione, fagosomi presentano gli indicatori in genere quali Rab5 e Rab7 di endosomi precoci e tardivi, rispettivamente con la subunità di0 V dell' v-ATPasi8. Fusione di fagosomi con i lisosomi e late endosomes risultati nell'esposizione dell'agente patogeno phagocytized a una vasta gamma di enzimi idrolitici come β-galattosidasi9, lipasi e proteasi catepsina. L'acidificazione del lume è inoltre necessario per l'attivazione di questi enzimi. Ad esempio, la scissione della catepsina D per produrre la forma breve attiva è dipendente dal pH10. Questi enzimi degradano l'agente patogeno e mediano la produzione dei peptidi corti patogeno-derivati che sono presentati da macrofagi di istocompatibilità (MHC) classe II molecole complesse alle cellule di T di innescare una risposta immunitaria adattativa11.
Quindi, la maturazione del fagosoma è cruciale per la risposta immunitaria innata e collega le braccia innate e adattativa del sistema immunitario. Non è una sorpresa che gli agenti patogeni hanno evoluto strategie per superare l'eliminazione dai macrofagi attraverso il processo di maturazione del fagosoma sopra descritte. Ad esempio, i batteri intracellulari tubercolosi del micobatterio e Legionella pneumophila impediscono la maturazione del fagosoma d'inibizione dell'Assemblea del v-atpasi e lume conseguente acidificazione12,13 . Altri batteri, come Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducono la formazione di pori nella membrana del fagosoma per scappare verso il citosol14,15. D'altra parte, Salmonella enterica sierotipo typhimurium (S. typhimurium) è in grado di modificare le proprietà di phagosome all'interno del vacuolo per trasformarla in un luogo adatto per sua replica16. Questa capacità rende S. typhimurium un modello molto interessante per studiare interferenza patogeno-mediata di maturazione del fagosoma.
S. typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. Typhimurium batteri sono rapidamente rilevati phagocytized da macrofagi e contenuti all'interno di fagosomi17. Alcuni rapporti hanno descritto in precedenza che S. typhimurium-fagosomi contenenti presentano responsabili per sia gli endosomi ed i lisosomi18, e altri studi hanno trovato fusione fagosoma-lisosoma ha impedito al S. Typhimurium infezione19.
Inizialmente, maturazione di phagosome su S. l'infezione typhimurium è stato studiato da microscopia di immunofluorescenza. Lo sviluppo di tecniche per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi attivato uno studio più accurato del contenuto phagosome in termini di indicatori endosoma e lisosoma. Ad oggi, il metodo principale utilizzato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è il frazionamento subcellulare il saccarosio passo gradienti18,20. Tuttavia, questo metodo richiede più passaggi di centrifugazione che possono causare danni meccanici alla fagosomi, possono influenzare la stabilità dei componenti phagosomal (proteine e lipidi) e richiede molto tempo. Inoltre, si richiede l'utilizzo di un'ultracentrifuga: un pezzo di attrezzature specializzate che non sono accessibile per ogni laboratorio.
Recentemente, un nuovo approccio è stato applicato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi, in cui gli agenti patogeni batterici sono etichettati con biotinilati lipopetide (Lipobiotin) e successivamente estratte utilizzando streptavidina coniugata biglie magnetiche21 . Proponiamo un metodo alternativo e complementare di etichettatura batteriche superficiali contenenti macromolecole con NHS-biotina seguita da streptavidina coniugata biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con questo metodo sono altamente arricchiti in indicatori endosoma e lisosoma e possono essere utilizzati per un'ampia gamma di dosaggi, di analisi della proteina di omics analisi. Inoltre, non richiede attrezzature specializzate come ultracentrifughe. Inoltre, eliminando le fasi di centrifugazione, sia il danno meccanico al fagosomi e la quantità di tempo impiegata notevolmente sono ridotti. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'isolamento di fagosomi contenenti altri batteri, come i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, anche incluso in questo manoscritto. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è un semplice, conveniente, e meno tempo rispetto all'isolamento classica di saccarosio gradiente-ultracentrifugazione, rendering altamente arricchito fagosomi contenenti batteri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tutti i passaggi che implicano l'uso di patogeni S. typhimurium deve essere eseguito in un BSL-2 o maggiore sicurezza biologica livello struttura. La cultura e la spalmatura di S. Typhimurium, come pure l'infezione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare per prevenire la contaminazione. L'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi può essere eseguita su qualsiasi banco di laboratorio BSL-2.
l'estrazione del midollo osseo da topi per relativa differenziazione in macrofagi è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e approvato dall'Agenzia dello stato della Renania settentrionale-Vestfalia per la natura, Ambiente e tutela dei consumatori [Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; File no: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e l'Università di Colonia.
1. Culturing S. typhimurium
- inoculare S. typhimurium (Ceppo SL1344) da una singola colonia batterica in 5 mL di brodo di infusione (BHI) cuore cervello utilizzando un ciclo batterico.
- Incubare la sospensione batterica in un incubatore a 37 ° C durante la notte con agitazione.
- Il giorno seguente, trasferire 1 mL di sospensione batterica in 19 mL di brodo BHI in una beuta e incubare a 37 ° C in un incubatore con agitazione.
- Monitorare l' S. typhimurium crescita misurando la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600) con uno spettrofotometro. Le misurazioni devono essere effettuate circa ogni 30 min.
- OD quando 600 raggiunge 1,0, rimuovere la sospensione batterica dall'incubatore e trasferimento in tubo da 50 mL. Centrifugare i batteri a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere in 10 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).
- Centrifugare a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere i batteri in 4,9 mL di PBS sterile.
2. Rivestimento di S. typhimurium con biglie magnetiche NHS-biotina/streptavidina-coniugato
biotina- aggiungere 100 µ l di 10 mg/mL soluzione (NHS-biotina disciolto in dimetilsolfossido, DMSO) preparata, la sospensione batterica di collegamento preparato nel passaggio precedente. Ad esempio, diluire 5 mg di NHS-biotina in 0,5 mL di DMSO sterile. Mix correttamente pipettando su e giù più volte.
- Dividere il mix in cinque provette da 1,5 mL.
- Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (TA) su un termoblocco con agitazione costante a 350 giri/min.
- Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.
- Risospendere in 1 mL di PBS sterile, centrifuga a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.
- Ripetere passo 2.5 due volte per rimuovere completamente la biotina in eccesso che collega soluzione.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 1 mL di PBS sterile.
- Trasferire 100 µ l di soluzione di coniugato streptavidina biglie magnetiche di 10 mg/mL in una provetta da 1,5 mL e lasciarlo sul rack magnetico per 5 min.
- Rimuovere il solvente con una pipetta, prendere la soluzione di biglie magnetiche streptavidina-coniugato dal rack magnetico e risospendere le con 1 mL di sospensione batterica rivestito di biotina preparata al punto 2.7.
- Incubare per 1h a RT su un thermoblock con agitazione costante a 350 giri/min.
- Posto la soluzione su rack magnetico; aspettare 5 minuti e poi rimuovere con una pipetta i batteri che non aderiscono alla parete (tenerlo in una provetta etichettata come " non rivestita batteri "). La frazione che aderisce alla parete del tubo a contatto con il magnete è il batterio biotina/streptavidina-rivestito.
- Rimuovere il tubo contenente i batteri con etichettati dal rack magnetico e risospendere in 1 mL di PBS sterile.
- Riposizionarlo sul rack magnetico, attendere 5 min e utilizzare una pipetta per rimuovere il PBS.
- Ripetere i passaggi da 2.13 e 2.14 altre due volte per rimuovere tutti i batteri che non sono rivestiti con i branelli magnetici streptavidina coniugata.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i batteri rivestito in 500 µ l di PBS sterile ed etichettare il tubo come " rivestito di batteri ".
- Contare le unità formanti colonia (UFC di entrambi) " batteri non rivestiti " e " rivestito di batteri " soluzioni di placcatura diluizioni seriali su piastre di agar BHI. Circa 2 x 10 8 cfu/mL di batteri rivestiti sono ottenuti da 20 mL di sospensione batterica iniziale con OD 600 di 1.0. Mantenere la sospensione batterica rivestito a 4 ° C per essere usati il giorno seguente per infettare i macrofagi.
3. Infezione di BDMDs
- lo stesso giorno quando i batteri sono rivestiti con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata, piastra completamente differenziato BMDMs 22 in piatti di 6 cm con una densità di 5 x 10 6 cellule per piatto.
- Il giorno successivo, centrifugare la sospensione batterica rivestito a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere in medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione di 10 x 10 6 cfu/mL.
- Per infettare i macrofagi ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10, rimuovere il supporto dal BMDMs e aggiungere 5 mL di sospensione batterica rivestito preparato. MOI ottimale può essere valutata per ogni tipo di cellula o scopo sperimentale dell'isolato fagosomi.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min per sincronizzare fagocitosi.
- Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2 per 30 min ad avviare la fagocitosi. Altri tipi di cellule possono richiedere tempi diversi di incubazione per garantire l'internalizzazione dei batteri.
- Rimuovere il mezzo contenente batteri dai piatti e lavare le cellule con RPMI tre volte a rimuovere i batteri non interiorizzato.
- Infine aggiungere 10 mL di RPMI contenente 10% FBS e gentamicina 50 µ g/mL per uccidere tutti i batteri non-phagocytized.
- Incubare il BMDMs infetti a 37 ° C con 5% CO 2 finché il tempo desiderato. Il punto di tempo desiderato deve essere determinato sperimentalmente secondo i batteri e tipo di cellulare utilizzato e lo scopo di analisi. Per lo studio degli eventi di fusione fagosoma-endosomi precoci in S. BMDMs typhimurium-infettati, è consigliabile un'incubazione di 30 min. Per l'analisi degli eventi successivi, fagosomi possono essere estratte dopo 2 o 4 ore di incubazione. Incubazione prolungata dei macrofagi con S. Typhimurium oltre 24 h provoca la morte dei macrofagi. Estesi, infezione intracellulare prima l'estrazione phagosome probabilmente potrebbe portare alla degradazione delle molecole di biotina. Tuttavia, non abbiamo osservato perdita di biotina sui batteri rivestito fino alle h. 24
4. Isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi
buffer di isolamento- preparare il volume del fagosoma richiesto un (50 mM tubi, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) aggiungendo ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 1 mM, citocalasina B ad un finale concentrazione di 10 µM e proteasi e fosfatasi inibitori come consigliato dal produttore.
Nota: DTT e Cytochalasin B devono essere aggiunti per il tampone di isolamento phagosome A sempre immediatamente prima dell'uso. Cytochalasin B sconvolge il citoscheletro, facilitando la rottura della membrana cellulare. - Al momento desiderato punto, rimuovere il mezzo da cellule infette e lavare con PBS sterile riscaldato a RT.
- Aggiungere 750 µ l di phagosomisolamento e tampone A ogni piatto e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento A dovrebbe essere regolato proporzionalmente.
- Aggiungere 250 µ l di tampone di phagosome isolamento B (tubi di 50 mM, pH.7, MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM mannitolo e saccarosio 68 mM). Roccia la piastra per assicurare che il buffer raggiunge la superficie del piatto. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento B deve essere regolato proporzionalmente.
- Rimuovere le cellule dal piatto raschiando delicatamente utilizzando un poliziotto di gomma e trasferirli in una provetta da 1,5 mL pre-refrigerati.
- Passare la sospensione cellulare attraverso un ago 26G utilizzando una siringa da 1 mL almeno 15 volte (uno aspirazione più una espulsione della sospensione la conta delle cellule come una volta). Questo è sufficiente per rilasciare il contenuto citosolico di BMDMs. Il numero di passaggi attraverso l'ago deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula.
- Posizionare la sospensione cellulare sul rack magnetico e attendere 5 min. Le particelle attaccate al magnete sono fagosomi contenenti rivestito - S. Typhimurium. La sospensione contiene il resto dei componenti cellulari.
- Trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 mL etichettata come " citosol ".
- Rimuovere il tubo con i fagosomi isolati dal rack magnetico e li risospendere in 1 mL di PBS sterile.
- Posizionare la sospensione phagosome al ripiano magnetico, attendere 5 minuti e rimuovere il PBS.
- Ripetere i passaggi da 4.9 e 4.10 per lavare l' isolato S. typhimurium-contenente fagosomi.
- , Infine, rimuovere il PBS e risospendere i fagosomi nel buffer richiesto; ad esempio, in un tampone del saggio (RIPA) radioimmunoprecipitation per l'analisi della proteina. Circa il 50-200 µ g di proteina è ottenuta per campione seguendo questo protocollo, a seconda della quantità iniziale di cellule e il MOI di infezione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolamento di batteri contenenti fagosomi dal presente protocollo richiede il biotinylation dei batteri come un primo passo. Quindi abbiamo valutato l'efficacia di S. typhimurium biotinylation dall'analisi di microscopia confocal di BMDMs infettato biotinilati mCherry -S. typhimurium etichettato con Cy5-streptavidina. Brevemente, BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. typhimurium precedentemente biotinilati ma non incubate con streptavidina coniugata biglie magnetiche. Dopo 30 min di incubazione a 37 ° C, le cellule sono state lavate con PBS caldo e fissate con formaldeide al 4% per 20 min a RT. fissazione è stato fermato dalla vasta lavaggio con PBS. Le cellule sono state poi permeabilizzate con 3% Triton in PBS per 5 min a RT. infettati BMDMs quindi sono state incubate con Cy5-streptavidina per 20 min a 4 ° C. Dopo il lavaggio estesa, i campioni sono stati preparati per l'analisi mediante microscopia confocale (Figura 1). Non biotinilati mCherry -S. Typhimurium è stato usato come controllo negativo. Segnale fluorescente da Cy5-streptavidina è stato osservato esclusivamente in biotinilati mCherry -S. typhimurium, confermando che biotinylation dei batteri riusciva. Analisi microscopica è stata effettuata su un microscopio confocale utilizzando "60 X O2 NA: 1,40" obiettivo. Lunghezze d'onda di eccitazione per i fluorocromi era 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry) e 635 nm (Cy5) e PMT tensione è stato fissato a 574v, 565v e 443v, rispettivamente.
Poiché la risposta immunitaria innescata in macrofagi da S. typhimurium dipende in gran parte l'attivazione del recettore di superficie del macrofago di ligandi batterici, abbiamo testato successiva se il rivestimento di S. typhimurium con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata potrebbe alterare la risposta immunitaria innata in BMDMs infetti. Abbiamo innanzitutto valutato se il rivestimento di S. typhimurium potrebbe alterare la capacità fagocitica di BMDMs mediante microscopia confocale. BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. Typhimurium rivestito con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata o non patinata mCherry -S. typhimurium. Dopo 30 min di incubazione a 37 ° C, le cellule sono state lavate con PBS caldo e fissate con formaldeide al 4% per 20 minuti a TA. Dopo il vasto lavaggio con PBS, i campioni sono stati preparati per l'analisi mediante microscopia confocale. Come illustrato nella Figura 2, macrofagi phagocytized patinati e non patinati mCherry -S. typhimurium ugualmente.
Successivamente, abbiamo analizzato la risposta infiammatoria innescata da S. typhimurium rivestito con biotina e streptavidina coniugata sfere magnetiche (Figura 3). Surnatanti da BMDMs infettato patinati e non patinati S. typhimurium sono stati raccolti dopo 24 h di infezione per analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) di secrezione interleukin-6 (IL-6). Il rivestimento di S. typhimurium con biotina e sfere magnetiche Coniugato streptavidina non ha alterato significativamente la risposta infiammatoria dei macrofagi.
Per valutare la purezza dei fagosomi contenenti batteri ottenuti impiegando questo protocollo abbiamo analizzato isolato mCherry -S. typhimurium-contenente fagosomi immunoblotting. Usando gli anticorpi specifici contro il tag mCherry, abbiamo trovato significativo arricchimento di mCherry-esprimendo S. typhimurium nei fagosomi isolati rispetto alla frazione citosolica ottenuti dallo stesso campione (Figura 4). Isolato fagosomi contenenti mCherry - S. typhimurium che non era precedentemente rivestito con biotina sono stati usati come controllo negativo. Questi risultati dimostrano che questo protocollo permette per la purificazione di fagosomi che sono altamente arricchito nei batteri.
Abbiamo effettuato la successiva analisi di immunoblot di marcatori endosoma e lisosoma in fagosomi isolati contenente S. typhimurium (Figura 5). La maggior parte degli indicatori endosoma e lisosoma chiaramente sono stata osservata in fagosomi isolati a di post-infezione 4h rispetto ai 30 min. L'arricchimento dei marcatori endosomal Rab5 e Rab7, come pure il lisosoma marcatori v-ATPasi (subunità1 V e V0 ) e catepsina D, sono stati osservati. Interessante, è stato osservato solo il modulo spaccato della catepsina D in fagosomi isolati post-all'infezione 4h. La fenditura del Pro-catepsina D (48 kDa) per produrre la forma attiva breve (33 kDa) si verifica solo nella fagosomi, ma non nel citosol, dimostrando la specificità di questo protocollo per l'isolamento del fagosoma.
Poiché i marcatori da organelli come mitocondri o reticolo endoplasmico (ER) spesso sono presenti in preparazioni di fagosomi contenenti batteri isolati, l' S. typhimurium-contenenti fagosomi isolati sono stati sondati con anticorpi specifici contro il trasportatore mitocondriale Tomm20 e il calnexin di proteina di ER (Figura 6). Li abbiamo testati anche con un anticorpo contro l'enzima della glicolisi GAPDH per valutare la contaminazione citosolico nei fagosomi isolati. Abbiamo trovato entrambi i mitocondri e marcatori ER in S. typhimurium-isolato fagosomi ma nessuna contaminazione citosolica.
Per studiare la versatilità del protocollo per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi, la biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata procedura di rivestimento è stato applicato il batterio gram-positivo Staphylococcus aureus. Impiegando la stessa fissazione e protocollo di colorazione come descritto per mCherry -S. typhimurium (Figura 1) abbiamo confermato successo biotinilazione della proteina fluorescente verde (GFP) esprimenti -Staphylococcus aureus (Figura 7). Inoltre, abbiamo rilevato arricchimento il marcatore endosoma Rab7 e il lisosoma marcatori v-ATPasi (subunità di0 V) e catepsina D dall'analisi del immunoblot di isolato GFP -Staphylococcus aureus-contenente fagosomi (Figura 8). La scissione della catepsina D nella sua forma matura era rilevabile solo dopo 4 h di infezione nei campioni phagosome isolato ma non nelle frazioni citosoliche. Isolato Staphylococcus aureus-fagosomi contenenti erano esenti da contaminazione citosolico come testimoniano il immunodetection di GAPDH.
In sintesi, abbiamo dimostrato che il nostro protocollo di isolamento del fagosoma consente l'isolamento dei fagosomi contenenti batteri altamente arricchiti, esenti da contaminazione citosolico. Le preparazioni di phagosome isolato possono essere utilizzate per l'analisi di marcatori endosoma e lisosoma a studiare phamaturazione di gosome. Inoltre, è stato dimostrato che questo protocollo può essere usato per i batteri sia Gram-negativi e Gram-positivi e che la procedura di etichettatura non altera la risposta immunitaria dei macrofagi.
Figura 1: Analisi di microscopia di fluorescenza di biotinylated S. typhimurium utilizzando Cy5-Streptavidin. BMDMs sono stati infettati per 30 min con mCherry -S. typhimurium che era biotinilato ("biotinilati S. T."), come descritto in questo protocollo. Non biotinilati mCherry -S. typhimurium ("Non biotinilati S. T.") è stato usato come controllo negativo. Dopo la fissazione e permeabilizzazione delle cellule, i campioni sono stati incubati con Cy5-streptavidina per 20 min a 4 ° C. Segnale di fluorescenza dal nucleo (DAPI), mCherry -S. typhimuriume Cy5-streptavidina sono stati analizzati usando la microscopia confocal. Segnale da Cy5-streptavidina potrebbe essere rilevato solo nei batteri precedentemente etichettati con biotina, confermando così la biotinilazione efficiente. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi microscopica di BMDMs infettata da mCherry -S. typhimurium rivestito con biotina e sfere magnetiche Coniugato streptavidina. BMDMs sono stati infettati con mCherry -S.typhimurium etichettati con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata come descritto in questo protocollo. Dopo che i macrofagi a phagocytize i batteri per 30 min, le cellule sono state fissate con formaldeide al 4% per 20 minuti a TA. I batteri rivestiti phagocytized da macrofagi sono stati quindi analizzati mediante microscopia confocale. L'analisi ha mostrato che l'assunzione di batteri rivestiti ("Coated S. T.") è paragonabile all'assunzione di batteri mCherry senza etichetta ("non rivestito, S. T."), dimostrando che etichettatura con biotina e sfere magnetiche Coniugato streptavidina non altera fagocitosi di S. typhimurium dai macrofagi. I nuclei sono stati macchiati con DAPI per microscopia visualizzazione. Dati sono mostrati come media ± s.e.m., e la significatività statistica calcolata utilizzando di student t-test è rappresentato come * = p < 0,05; * * = p < 0,01; = p < 0.001. Barra della scala = 40 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Secrezione di IL-6 da BMDMs infettati con biotina e streptavidina coniugata con perline magnetiche, con etichettate S. typhimurium rispetto a senza etichetta S. typhimurium . BMDMs sono stati infettati con S. typhimurium rivestito con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata come descritto in questo protocollo. Dopo 24 h di infezione, i surnatanti sono stati raccolti per un'ulteriore analisi della secrezione di IL-6 da ELISA. I surnatanti formano BMDMs infettato non patinata S. typhimurium sono stati usati come controllo. L'induzione della secrezione di IL-6 di rivestito S. typhimurium non era significativamente differente rispetto a quella non patinata S. typhimurium. I dati sono mostrati come media ± s.e.m., e la significatività statistica calcolata utilizzando il test t di student è rappresentata come * = p < 0,05; * * = p < 0,01; = p < 0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: arricchimento batterico in isolato fagosomi. Arricchimento di mCherry-etichetta S. typhimurium nei fagosomi isolati raccolti dopo 30 min e 4 h di infezione è stato confrontato con la frazione citosolica. Β-actina è stato usato come un controllo di carico. Il controllo negativo si riferisce fagosomi isolati utilizzando non patinata S. typhimurium a 30 min dopo l'infezione. Come previsto, l'output finale di isolamento phagosome utilizzando senza etichetta S. typhimurium non presenti quantità significative di mCherry o β-actina, dimostrando la specificità del protocollo. 20 µ g di proteina è stato caricato per campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi di marcatori endosoma e lisosoma in isolato S. typhimurium-contenente fagosomi. L'arricchimento dei marcatori endosoma Rab5 e Rab7, lisosoma marcatori v-ATPasi (V0 e V1 subunità) e catepsina D è stato analizzato in isolato S. typhimurium-contenente fagosomi estratte dopo 30 min e 4 h di infezione. Β-actina è stato usato come un controllo di carico. 20 µ g di proteina è stato caricato per campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi dei mitocondri, ER e marcatori citosolici in isolato S. typhimurium-contenente fagosomi. Il marcatore citosolico GAPDH, il calnexin di marcatore di ER e il marcatore mitocondriale Tomm20 in S. typhimurium fagosomi isolati a 30 min e 4 ore post-infezione sono stati analizzati mediante immunoblotting e rispetto alle corrispondenti frazioni citosoliche. 20 µ g di proteina sono stati caricati per campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi microscopica di GFP -Staphylococcus aureus infettati macrofagi. BMDMs sono stati infettati con S. aureus espressione della proteina fluorescente verde (GFP) con etichetta wibiotina th come descritto nella metodologia per l'etichettatura di S. typhimurium. Dopo che i macrofagi a phagocytize i batteri per 30 min, le cellule sono stati corretti. Non patinata S. aureus ("non biotinilati S. R.") sono stati usati come controllo negativo. Dopo la fissazione e permeabilizzazione delle cellule, i campioni sono stati incubati con Cy5-streptavidina per 20 min a 4 ° C. Il segnale fluorescente dal nucleo (DAPI), GFP -S. aureuse Cy5-streptavidina sono stati analizzati mediante microscopia confocale. Il segnale da Cy5-streptavidina potrebbe essere visto solo nei batteri precedentemente etichettati con biotina, confermando biotinylation efficiente. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Analisi di marcatori endosoma e lisosoma in isolato S. aureus-contenente fagosomi. S. aureus-contenente fagosomi isolati a 30 min, 2 h e 4 h post-infezione, sono stati analizzati dall'immunoblotting per marcatori phagosomal Rab5, Rab7 e v-ATPasi rispetto alle corrispondenti frazioni citosoliche. 20 µ g di proteina sono stati caricati per campione. I campioni sono stati testati anche con un anticorpo specifico contro GAPDH, dimostrando che isolato S. aureus-fagosomi contenenti sono esenti da contaminazione citosolico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un nuovo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l'etichettatura dei batteri conserva la capacità dell'agente patogeno per indurre l'infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D'importanza, fagosomi ottenuti con questo metodo sono arricchiti in batteri ed endosoma/lisosoma marcatori e privo di contaminazione citosolico.
Questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto al metodo tradizionale phagosome isolamento che si avvale di separazione gradiente di saccarosio. Elimina la laboriosa più passaggi di centrifugazione, che permette al ricercatore di gestire più campioni in meno tempo e ottenere più puri esempi di phagosome facilmente aumentando il numero di fasi di lavaggio. L'utilizzo di questo protocollo Elimina la necessità di attrezzature specializzate e sensibili, quali ultracentrifugazione. Centrifugazione ad alta velocità potrebbe alterare le caratteristiche delle vescicole e ridurre la resa finale22, che è evitato in questo protocollo. Abbiamo anche dimostrato che il rivestimento di S. typhimurium con biotina e sfere magnetiche Coniugato streptavidina non altera la capacità fagocitica dei macrofagi. Inoltre, l'induzione di IL-6 dai macrofagi infettati con etichettato S. typhimurium era invariata rispetto ai macrofagi infettati con batteri senza etichetta. Di conseguenza, il rivestimento delle S. Typhimurium non induce cambiamenti significativi nella loro patogenicità. A nostra conoscenza, rivestimento di S. typhimurium non rappresenta un impedimento per l'uso dei fagosomi isolati per una qualsiasi delle comuni tecniche di analisi di laboratorio.
S. typhimurium-fagosomi contenenti isolati da questo metodo sono arricchiti in batteri ed endosomal tipici presenti e marcatori lisosomiali, come il v-ATPasi subunità V0 , V1 e la proteasi matura spaccata catepsina D, che possa essere rilevata solo nelle frazioni phagosome isolato. Inoltre, abbiamo trovato i mitocondri ed ER marcatori in isolato S. typhimurium-contenente fagosomi. Interazione di fagosomi con ER è stata ampiamente studiata, anche se la quantità di proteine da ER presente in fagosomi contenenti agenti patogeni possono variare con l'agente patogeno ha studiato e il tipo di cella. Ad esempio, fagosomi contenenti Brucella abortus isolato dai fagociti professionali sono ricchi di ER marcatori23 ma non quelli isolati dai macrofagi24. Calnexin è stato rilevato in precedenza in S. Fagosomi contenenti typhimurium isolati mediante gradiente di saccarosio18. Stretta interazione dei fagosomi contenenti perlina inerte e dei mitocondri è stato anche precedentemente segnalati25, che spiega la presenza di Tomm20 nei fagosomi isolati. Proteine mitocondriali sono stati trovati in fagosomi isolati contenente L. pneumophila26 o Mycobacterium27. Tuttavia, il rilevamento di componenti di mitocondri nelle preparazioni di fagosomi contenenti agente patogeno isolati utilizzando il metodo di centrifugazione su gradiente di saccarosio è spesso stato creduto per essere dovuto la densità simile di questo organello e il fagosoma contenente agente patogeno e, di conseguenza, aspecifici28. Il nostro metodo evita un'emissione di contaminazione e fornisce informazioni più affidabili, suggerendo che le membrane mitocondriali potrebbero mescolarsi con le membrane phagosomal. In sintesi, sarà difficile evitare ER e marcatori mitocondriali nel liquido contenente agente patogeno isolato preparazioni fagosomi, secondo il tipo di cellula ospite e patogeno. Il metodo consigliato per la verifica della purezza dell'isolato fagosomi consiste nell'utilizzare tag specifico anticorpi e batteri contrassegnati per la rilevazione di batteri mediante Western Blot. Mostriamo anche che questo metodo di isolamento può essere adattato per altri microrganismi con gruppi di ammine superficie disponibile che possono essere biotinilato. Ad esempio, abbiamo applicato con successo il nostro protocollo per isolare lo Staphylococcus aureus-contenente fagosomi. Fagosomi contenenti S. aureus isolati utilizzando questo protocollo sono arricchiti lisosoma ed endosoma marcatori come v-ATPasi (subunità di0 V) e Rab7, rispettivamente, ma non presentano marcatori citosolici come GAPDH.
Endosomal/phagosomal vescicole forniscono ambienti unici per la degradazione di agenti patogeni, ma preservare gli antigeni per la segnalazione il sistema immunitario adattativo. Anche se, fagosomi e il processo di maturazione sono stati studiati, il microambiente nel phagosome su hosting vari agenti patogeni rimane evasivo. Inoltre non è chiaro come i cambiamenti metabolici in cellule alterano la maturazione del fagosoma e il suo contenuto. Pertanto, il protocollo dettagliato qui dà maggiori opportunità di studiare la biogenesi fagosoma e la sua funzione nel contesto di varie patologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell'ambito dell'iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell'Università di Colonia, Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
