Summary
우리는 서로 다른 뇌 영역에 패턴을 얼룩이 지기 특성 박판 모양 및 면적 아연을 조직화 학적인 절차를 설명 합니다. 아연 얼룩 패턴 함께에서 다른 해 부 마커와 레이어 및 지역 개발 및 성인 두뇌에서 안정적으로 구별 하 사용할 수 있습니다.
Abstract
해 부 학적 및 기능적 뇌 조직 및 개발의 고유한 신경 회로 지역 미 숙 하 고 성인 두뇌의 정확한 식별을 필요합니다. 여기는 다른 레이어 및 두뇌 영역 중에서 얼룩 패턴에 차이 밝혀 아연 조직화 학적인 얼룩 절차에 설명 합니다. 다른 사람을 아연 포함 된 신경 및 두뇌에서 회로의 분포 뿐만 아니라 성공적으로 여러 종에서 개발 및 성인 두뇌에 있는 영역 및 박판 모양 경계 윤곽을 그리 다이 절차를 활용 했습니다. 여기 우리가 설명이 절차 개발에서 이미지와 함께 얼룩 및 성인 흰 족제비 두뇌. 우리는 아연 얼룩 패턴 영역과 레이어의 해 부 감 적 역할을 계시 하 고 개발 및 성인 시각 피 질에서 시각 피 질 영역을 구별 하 안정적으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 레이어 및 지역 개발 및 성인 두뇌 그렇게 할 다른 방법이 실패 하는 곳에서 정확한 식별 수 있도록 조직화 학적인 방법을 제시 하는. Secondarily, densitometric 이미지 분석 함께,이 방법을 하나 수 있습니다 개발을 통해 잠재적인 변화를 공개 시 냅 스 아연의 분포를 평가 하. 시 약, 도구, 및 연속적으로 냉동된 뇌 섹션 얼룩 필요한 단계가이 프로토콜은 자세하게에서 설명 합니다. 하지만이 프로토콜 사용 하 여 흰 족제비 뇌 조직의 설명, 그것은 쉽게 설치류, 고양이, 또는 다른 뇌 영역에서 뿐만 아니라 원숭이에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
Introduction
조직학 얼룩 전통적으로 건축 술 기능에 차이 공개 하 여 다양 한 종에서 대뇌 피 질의 영역 식별에서 돕기 위해 사용 되었습니다. 그들은 두뇌의 비슷한 면적 경계 공개 Nissl 물질, 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 반응, 또는 수 초 같은 조직화 학적인 기술 사용 유익한 증명할 수 있다. 그러나, 이러한 조직화 학적인 얼룩 대뇌 피 질의 영역 및 미 성숙한 뇌에 레이어 사이의 명확한 경계를 항상 적절 하 게 공개 하지 않습니다.
중앙 신 경계, 아연에는 효소 공동 인자, 다양 한 규제 기능에 참여 하 고 시 냅 스 소포에 그것의 존재를 통해 neuromodulator 역할 역할 DNA 구조 안정화를 포함 하는 몇 가지 중요 한 기능 1. 시 냅 스 아연은 독특한 그것은 구상 될 수 있다 조직학 방법 반면 단백질 바인딩 아연 시각된2수 없습니다. 이 기능은 다른 대뇌 피 질의 영역에 시 냅 스 아연 패턴을 이용 되 고 시 냅 스 아연 histochemistry 연구의 숫자에 사용 되었습니다. 대뇌 피 질 신경 세포 glutamatergic의 하위 집합 포함 그들의 축 삭 맨끝3,4내 연 접 소포에 아연. 조직화 학적인 연구는 대뇌 피 질5,,67에서 시 냅 스 아연의 다른 유형의 분포를 계시 했다. 다른 대뇌 피 질의 영역 (예를 들어, 시각적 somatosensory 피 대), 또는 레이어 histochemically 반응 아연의 다른 영역 및 층 류 분포 나타납니다 (예를 들어,는 supragranular에 있는 아연 수준 및 기본 시각 피 질 infragranular 레이어는 상대적으로 낮은 시 냅 스 아연 레벨 thalamocortical 입력 계층 4 보다 실질적으로 더 높은)5,,89. 면적 및 층 류 식별을 용이 하 게 하는으로 시 냅 스 아연 피 질에 얼룩에 특히 유리 하다.
여기 우리는 Danscher의 1982 메서드10의 수정된 된 버전은 시 냅 스 아연 조직화 학적인 절차에 대 한 자세한 설명을 제시. 이 메서드는 chelating 에이전트로 동물에 selenite intraperitoneally 주입 (IP)를 사용합니다. selenite 두뇌 glutamatergic 시 냅 스의 부분 집합의 소포에 있는 자유로운 아연의 수영장으로 반응 하는 뇌에 여행. 이 반응은 실버 개발2,,1011이후 강화 될 수 있다 침전을 생성 합니다.
이 절차 시 냅 스 아연 얼룩;의 층 류 영역 패턴을 보여준다 densitometric 분석은 성인과 미 성숙한 뇌의 감각, 환경, 약물, 또는 유전자 조작 같은 다른 개입의 효과 연구에서 이러한 패턴을 질적 및 양적 평가를 사용할 수 있습니다. 또한, 하나 또한 다른 모델 시스템에 다른 피 질 또는 subcortical 구조에서 시 냅 스 아연의 분포에 잠재적인 발달 변화를 평가 하 고 있습니다. Densitometric 분석이 메서드에서 제공 하는 양적 정보는 시간이 지남에 따라 다음 두뇌 개발을 위한 유리한 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 다른 면역-조직화 학적인 마커 동반자를 층 류 및 영역 경계를 표시를 제공 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
는 다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 도시 대학의 뉴욕, 모든 적절 한 주 및 연방 정부의 지침에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 따릅니다. 마 취 흰 족제비에 대 한 적합 하 고 공부 하는 종에 따라 수정 해야 합니다.
그림 1:이 프로토콜의 3 단계에서 관련 된 주요 단계를 설명 하는 순서도 그리고 각 단계를 완료 하는 데 필요한 시간. 흰색 텍스트 원형에서 다른 모든 단계는 완전히 건조 섹션을 요구 하는 기간 녹색 텍스트 원에 표시 됩니다. 녹색 다이아몬드 모양의 텍스트 상자가 결정, 동안 빨간 사각형 중요 한 단계 이며 여분의 주의 수행 되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
1. 준비 단계 (쓴 슬라이드 솔루션 만들기)
- 뜨거운 물에 세제와 함께 unsubbed 슬라이드를 세척 및 증류수 린스를 철저 하 게 어떤 먼지를 또는 파편 든 지 제거와 함께 다음 따뜻한 물에 여러 번 씻어. 슬라이드 37에 오븐에서 또는 실내 온도에 건조를 허용 ° c.
- 슬라이드 완전히 건조 되 면 달걀 흰색의 얇은 코트 레이어 손가락 또는 그림 붓을 사용 하 여 각 슬라이드에. 20-30 분 동안 60 ° C에 오븐에 건조를 허용 합니다. 최적의 결과 위해, 섹션에서 미 끄 러 방지 하기 계란 흰색의 두 번째 코트를 추가 하 고 60에서 오븐에 한번 더 건조 수 ° c.
- 뜨거운 물 (60 ℃) 100ml에 젤라틴의 1 그램을 용 해 하 여 1% 젤라틴 솔루션을 준비 하 고 실내 온도에 냉각.
- 섹션 4에서에서 사용 하기 위해 아래 설명 된 대로 개발자 솔루션 200ml를 준비.
- 준비 껌 아랍어 솔루션 천천히 뜨거운 물 (그것은이 방법으로 더 쉽게 해소) 120 mL 단위로 40 g을 추가 하 여
- . 계속 교 반 막대 유리 솔루션을 저 어. 솔루션 완전히 해산 했다, 일단 열에서 그것을 제거 하 고 몇 분 동안 냉각 후 거 즈 천으로 퍼 널에서의 6-8 층 통해 필터링.
- 준비 시트르산 20 mL dH 2 O 5.04 g 연산 플러스 4.7 g 나트륨 구 연산 염을 추가 하 고 혼합물을 용 해 하 여 버퍼입니다. 이 솔루션의 pH 4.0 25 인지 확인 ° C. 조정 솔루션에 수산화 나트륨 또는 염 산을 추가 하 여 필요한 경우 pH.
- 30 mL dH 2 O 난방 Hydroquinone의 1.7 g를 용 해에 의해 Hydroquinone 솔루션 준비.
참고: 하이드로 퀴 논은 실내 온도에 물에서 쉽게 분해할 수 있는 물에 쉽게 용 해 수 있도록 필수적 이다 hydroquinone 솔루션을가 열. 60 ° c의 온도 유지 조심, 그렇지 않으면 hydroquinone 산화 될 수 있습니다. 솔루션 노란색, 삭제 하 고 다른 신선한 솔루션 준비. - 준비 실버 0.22 g dH 2 오 30 mL에 용 해 하 여 솔루션을 젖이 나올
- 혼합 솔루션 (1.4.1-1.4.4) 순서는 그들이 때 반응 (즉, 단면, 건조, 그리고 수정 후)를 수행할 준비가 설명 ( 그림 2). 끝은 젖 산 솔루션을 추가 합니다. 이 단계는 신속 하 게 완료 되 고 개발자 솔루션 섹션은 젖 산 염은 감광 성 반응 시간이 될 때까지 어둠 속에 배치 됩니다 확인 하십시오.
그림 2: 단계에 관련 된 순서를 보여주는 회로도 프로토콜의 아연 histochemistry 단계에는 시 약을 혼합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 동물 치료와 마 취
- Anesthetize 케 타 민 (25 mg/kg) 및 xylazine (2 mg/kg)의 근육 내 주입으로 동물.
주: 마 취의 적절 한 수준의 페달 반사 응답을 사용 하 여 이루어집니다 확인 하십시오. - 넣기 아연 chelator 나트륨 selenite 솔루션 (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
참고: 다른 나가에 또는 다른 종에서 나트륨 selenite의 독성 수 다. - 는 나트륨 selenite 뇌에 여행에 대 한 60 ~ 90 분을 허용 합니다. 이 기간 동안, 그것은 동물 제대로 진정 하 고 응답 하지 않는, 그래서 5 분 마다 마 취의 깊이 확인 하는 것이 필수적
- Selenite 기간 동안 동물 마 취 동안 닫히도록 눈은, 건조를 방지 하거나 안과 연 고 그들을 축축한 유지 관리.
3. 조직 준비 및 얼룩
- 나트륨 pentobarbital (100 mg/kg, i.p)의 과다 투여 하 여 동물을 안락사.
- 수행 transcardial 관류 정상적인 생리 식 염 수 1 분 및 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 마지막으로, 4 %paraformaldehyde 및 10% 자당 (1 h의 총 고정 기간)와 솔루션 관리.
- 큰가 위의 쌍을 사용 하 여 머리 제거.
- 중간 절 개 목에 코에서 메스를 사용 하 여 두개골을 노출 하 게.
- 신중 하 게 두뇌를 제거 하 고 칼 날 반구를 분리.
- 두뇌의 후부 부분을 차단 하 고 몇 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 4 %paraformaldehyde 후 위.
- 0.1 M 샌드위치에 30% 자당 해결책에 블록을 배치 하 고 싱크대 뇌 수.
참고: 두뇌 제한 두뇌 싱크 0.1 M 샌드위치에 30% 자당 해결책을 바꿉니다 4 %paraformaldehyde 및 30% 자당 해결책 '이 paraformaldehyde s 노출 얼룩 질 조직 영향을 미칠 수. - 한번 뇌 싱크, 시각 피 질 또는 동결, 슬라이딩 톰 또는 cryostat에 관심 영역을 통해 반 접선 40 µ m 두꺼운 부분을 잘라. 이 중간으로 블록 아래로 표면 부드럽게 한 유리 슬라이드와 병합을 배치 하 여 수행할 수 있습니다.
- 페인트 브러시와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 포함 하는 태 클 상자에 저장소 섹션을 수집.
- 별도 번호 시리즈에는 섹션을 구분합니다. 바로 하나 탑재 또는 달걀 흰 척 슬라이드 (제 1), 뇌 섹션의 두 시리즈 하룻밤 실 온에서 건조를 허용 하 고 histochemically 시 냅 스 아연에 대 한 섹션을 처리.
참고: 다른 시리즈는 비교를 위해, myelin 12 또는 13 수정된 프로토콜 사용 하 여 시 토 크롬 산화 효소 등 다른 표식에 대 한 처리 될 수 있습니다: 3% 자당, 0.015%, 시 토 크롬 C와 40 ° C에서 2-8 h에 대 한 품 어 0.015% 카 탈 라 제, 그리고 0.1 M 샌드위치에 0.02 %diaminobenzidine. Nissl 물질 시각 피 질 영역을 구별을 위한 조직학 표식으로 사용할 수 있습니다. 이러한 다른 조직학 얼룩 전통적인 젤라틴 코팅 슬라이드 대신 사용할 수 있습니다 그래서 뇌 섹션 달걀 흰 척된 슬라이드에 탑재 되어 필요 하지 않습니다.
4. 시 냅 스 아연 Histochemistry
- 15 분에 대 한 절대 알코올에 슬라이드 마운트 섹션을 수정 하 고 1 헤에 대 한 실 온에서 완전히 건조 허용 < l나 > 짧게 10에 대 한 섹션을 담가 1% 젤라틴 솔루션 (제 1) s 하룻밤 실 온에서 건조 하 고.
- 믹스 솔루션 단계에서 설명한 1.8 섹션 반작용 될 준비가 되 자 마자 함께.
- 슬라이드 유리 또는 플라스틱 쟁반에 나란히 정렬 하 고 슬라이드에 개발 솔루션을 붓는 하 여 섹션을 반응. 슬라이드 솔루션에 완전히 빠져들 되 고 어두운 공간으로 트레이 전송 하거나 확인 빛 상자 커버.
참고: 플라스틱 쟁반 약 12 인치는 정확 하 게 18 슬라이드 맞는 8 인치 넓은 오래 사용할 수 있습니다. 200 mL 개발자 솔루션의 전체 볼륨은 완전히 슬라이드 잠수함, 그래서 올바른 볼륨은 사용 되도록 슬라이드 수 반응 수와 제조 법에 따라 조정할 충분 합니다. 플라스틱 또는 유리 트레이 금속 트레이 사용 하 여 반대로 사용은 권장 반응성 개발자 솔루션에서은 젖 고 철 사이 십자가 어느 정도 또는 다른 금속에 있는 금속 쟁반.
- 슬라이드 유리 또는 플라스틱 쟁반에 나란히 정렬 하 고 슬라이드에 개발 솔루션을 붓는 하 여 섹션을 반응. 슬라이드 솔루션에 완전히 빠져들 되 고 어두운 공간으로 트레이 전송 하거나 확인 빛 상자 커버.
- 섹션 마다 30 분을 시각적으로 검사 하 여 반응의 개발을 모니터링. 섹션은 일반적으로 완전 한 개발을 위한 120-180 분 필요.
- 섹션 ( 그림 3a 참조) overstained 될 경우 2% 차별화 농부 ' s 솔루션 (9 부품 dH 2 O 및 1 파트 2%에서 2% 나트륨 thiosulfate 칼륨 Ferricyanide dH 2 O) 1-2 분에 대 한
참고: 샘플 섹션을 제대로 묻은 그림 3b에 표시 됩니다. - 원하는 강도 달성 되 면 슬라이드를 제거 하 여 반응을 종료는 트레이 슬라이드 슬라이드 선반에 배치에서 섹션을 탑재.
- 슬라이드 랙에 큰 유리 접시를 얼룩이 지 고 따뜻한 (40-50 ° C)에서 슬라이드 실행 제거 젤라틴 코트와 외부 실버 보증금 10 분 물 세척.
참고: 수 섹션에서 미 끄 러에서 방지 하기 위해 슬라이드 랙 선동 하지 않도록 주의 하십시오. 섹션의 원하는 강도 충분 한 층 류 변화는 분명 하 고 섹션은 충분히 어두운 하지만 하지 기관사 ( 그림 4a 참조) 이루어집니다. - 허용, 실내 온도에 건조 하 고 다음 100%에서 탈수 슬라이드 EtOH (5 분), 크 실 렌 (5 분), 그리고 장착 매체와 커버 슬립에 분명. 또는 알코올의 상승 시리즈에서 슬라이드에 놓은 다음 탈수, 취소, 및 coverslip.
- 이전 selenite 치료 부정적인 컨트롤 역할을 하지 않고 동물에서 사용 섹션. 이 섹션은 증폭 얼룩이 지 산출 해야 한다.
참고: 최적의 결과 대 한 건조 하룻밤 섹션 수 있습니다. 더 나은 조직 얼룩이 생성 허용 건조 하룻밤 섹션.
그림 3: 시 냅 스 아연 젊은 흰 족제비 뇌에 얼룩. 세미 접선 아연 스테인드 섹션을) overstained b) 젊은 흰 족제비 뇌에 understained의 photomicrographs. 영역 경계는 층 류 변이 부족으로 분별 하기 어렵다. 백색 질은 또한 무 겁 게 스테인드. Ssy Suprasylvian 피 질, WM 화이트 중요, 앞쪽, D 등. 눈금 막대 = 500 µ m (-b). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
5. 영역 경계 구분 및 이미지 수집
면적 및 층 류 식별에 대 한 서로 다른 뇌 영역의- 사용 건축 술 기능.
참고: 예를 들어 개발 쥐 retrosplenial 피 14, 저자 밝혀 과도 모듈화 아연은 성인에 존재 하는 대뇌 피 질의 설명 하기 위해 활용 될 수에 대 한 무거운 얼룩 특징 이 종에서 개발 하는 동안 조직입니다. 다른 연구 15, 저자 이러한 사단의 식별을 용이 하 게 짧은 꼬리 원숭이 편도 있는 다른 핵의 시 냅 스 아연 배포에 특이성을 공개 했다. 개발 및 성인 흰 족제비 뇌의 시각 피 질 영역 앞에서 설명한 16 , 17 , 18, 피 질에서의 건축 술 하위 되었습니다. 회색 다람쥐 설명된 19 했다입니다. 또한, 아연 histochemistry 이전 성인 원숭이 시각 피 질 8, 개발 및 성인 고양이 시각 피 질 5, 쥐 somatosensory 피 개발 지역 중 하기 위해 사용 되었습니다. 9 , 20, 그리고 성인 마우스 somatosensory 피 6 , 21. 가능한 경우, 스테인드, 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 스테인드, 그리고 시 냅 스 아연 스테인드 뇌 섹션, 성인에서 영역 경계를 확인 하는 수 초에 얼룩 패턴을 비교 합니다. 세미 접선 섹션에서의 시 냅 스 아연에 대 한 스테인드 흰 족제비 시각 피 질, 시각 피 질 영역 영역 식별을 용이 하 게 하는 가운데 눈에 띄는 차이가 있습니다. 예를 들어 지역 17와 18 성인 흰 족제비의 공개는 시 냅 스 아연 얼룩 층 III에 높은 이며 V. 레이어 VI 얼룩 하지 덜 달아, 레이어 4 거의 아연 부족 하는 동안. 아연 레이어 IV 또는 어둡게 스테인드 밴드와 함께 지역 17와 18 대조에 얼룩의 눈 부족 콜로라도 4 스테인드 섹션 계층에서 발견. 그러나, 레이어 4 지역 공동에 17의 스테인드 섹션 III 및 V, 레이어와 날카로운 테두리 유지 하지만 레이어 영역 18에에서 4 강도 얼룩이 지는 미묘한 감소가 특징 이다 고 그것의 상한에서에서 발견 레이어 III 덜 구별할 수. - 낮은 전력 목표 명시 야 현미경을 사용 하 여 섹션을 검사 (2 배 또는 4 배 확대)과 관심 분야를 사진.
- 향상 대비 고 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 photomicrographs의 밝기. 이미지 획득 대 광학 밀도 측정 어떤 식으로든에서 변경 되지 않을 합니다.
그림 4: 시 냅 스 아연 성인 흰 족제비 뇌에 얼룩이 지 구별 다른 시각 대뇌 피 질의 영역. 인접 한 세미 접선 섹션의 photomicrographs (한) 시 냅 스 아연 또는 (b) 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 성인에 대 한 스테인드. 화살표 표시 영역 경계. Ssy Suprasylvian 피 질, 앞쪽, D 등. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
6. (선택 사항) Densitometry
참고: Densitometric 분석 관심의 영역에 섹션 스테인드 대표 아연의 광학 밀도 측정 하 여 뇌의 시 냅 스 아연의 분포를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 개발을 통해 시 냅 스 아연 수준에 잠재적인 변화를 추적 하는 데 유용.
- 선택 사용 하 여 아연-얼룩진 섹션, 임의로 인수 photomicrographs의 관심 영역에서 (450 µ m 폭 열을 사용할 수 있습니다.) 적절 한 폭의 외피 열 (컬럼 photomicrographs)을 선택 합니다. 대뇌 피 질의 열이 백색 질을 pial 표면에서 모든 외피 층에 걸친 지역.
- 관심의 각 지역에 여러 개의 다른 뇌 섹션에서 샘플 열에 대 한 적절 한 수를 선택 하십시오.
- 대표 열의 샘플 이미지는 이미지 프로세싱 소프트웨어에 전송.
- 사각형 선택 도구를 사용 하 여 전체 외피 열 하.
- 반전 도구를 사용 하 여 명암 반전 이미지와 비슷한를 만드는 열의 사진 네거티브.
참고: 이미지의 명암 반전 시 냅 스 아연 높은 수준에 대 한 높은 광학 밀도 값 및 낮은 시 냅 스 아연 수준에 대 한 낮은 광학 밀도 값에 수행 됩니다. 이것은 그림 5에서 본 것과 비슷한 플롯 프로 파일 그래프를 렌더링 하는 더 직관적인 방법으로. - 선 따라 픽셀 농도의 2 차원 그래프를 생성 하는 플롯 프로필 도구를 사용 하 여 이러한 이미지에서 광학 밀도 프로 파일을 생산.
- 수직 프로 파일은 프로 파일 그래프 변환 하 고 플롯을 클릭을 사용 하 여 플롯 옵션 프로필 한 번 더.
참고: 라인과 y 축을 따라 x 축 대표 거리 픽셀 강도를 나타냅니다. 따라서, 각 작 프로 파일 값 열의 너비에 걸쳐 각 깊이에 평균 그레이 스케일 값 반영.
스프레드시트에 텍스트 파일로 - 오픈 플롯 프로필 값 정상화, 및 그래프 ( 그림 5 참조)으로 플롯.
참고: 그것은 결과 서로 다른 반응 시간은 뿐만 아니라 다른 조직의 결과로 전체적인 착 강도에 변화에 의해 혼동 수 양적 측정의 비교에 대 한 시 냅 스 아연의 상대 밀도 사용 하는 것이 좋습니다. 변수. - Boxcar 평균 데이터를 원활 하 게 플롯 프로필 값을 수행 하 여 상대적인 아연 밀도 계산.
참고: 이것은, 예를 들어 모든 연속 20 또는 30 픽셀을 평균 하 여 수행 (1 픽셀 = 2.5 µ m) 깊이, 그리고 다음 각 샘플에 대 한 최대 강도를 정상화. 따라서, 각 평균 플롯 프로필 값 그 깊이 (그레이 스케일 값 범위는 0부터 255)에서 평균 그레이 스케일 값을 반영합니다. 다른 정규화 방법 관심 분야에서 기본 백색 질을 포함 하는 샘플 영역에서 첫 번째 인수 백색 질 (WM) 광학 밀도 값으로 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 평균 WM 값을 얻기 위해 가능한 스테인드으로 가볍게 여러 영역을 선택 합니다. 평균 광 밀도 값 다음 WM 정규화 값을 가져올 WM 평균값으로 나누어집니다. - 결정 양적 비교에 대 한 관심 영역의 특정 층에서 광학 밀도 값을 의미.
참고: 예를 들어 레이어 IV 흰 족제비의 시각 피 질 영역에서에서 최소 광학 밀도 값 ± 5 픽셀 이상 스테인드 영역을 포괄 하 여 결정 됩니다. - ± 5 픽셀 평균 최대 값을 결정 하 여 어두운 스테인드 영역을 포괄 하 여 흰 족제비의 시각 피 질 영역의 supragranular 및 infragranular 레이어 광학 밀도 계산 값.
- 확인 광학 밀도 값을 의미 하는 특정 레이어 내에서 얻을 수 있습니다.
참고: 원래 photomicrographs 인접 한 공동 섹션을 비교 하 여 명암 반전 이미지에 이러한 계층의 한계를 확인 하는 것이 필수적 이다. 이 하나 인접 한 층에 침범 하지 않는 보장.
그림 5: 다른 시각 피 질에서 시 냅 스 아연의 층 류 분포 지역 성인 흰 족제비에. 성인에 해당 정규화 된 광학 밀도 프로필 모든 피 질 레이어를 통해 열 대표 photomicrographs. 성인 분야 17와 18의 4 층에서 시 냅 스 아연 낮은 밀도 프로 파일 플롯에 여 물통으로 표시 됩니다. 각 플롯 프로필에서 레이어 IV의 여 물통에 채워진된 타원 평균 최소 픽셀 휘도 값을 결정 하는 데 사용 하는 값을 나타냅니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
뇌 시 냅 스 아연에 대 한 섹션을 얼룩이 프로토콜에 관련 된 주요 단계는 그림 1의 순서도에 표시 됩니다. 프로토콜은 3 단계로 분할 될 수 있다: 1) 관류 및 조직 수집, 2) 조직 준비와 얼룩, 및 3) 아연 histochemistry. 간단히, 프로토콜의 첫 번째 단계 동물 마 취는 고 나트륨 selenite의 적절 한 복용량과 함께 IP를 주입. 기간 후에 충분 한 시간 (이상적으로 60-90 분), 동물은 이후 안락사, 0.9 %NaCl 솔루션 4 %paraformaldehyde 솔루션 다음 끼얹는다. 머리 참 하 고 두뇌는 두개골에서 신속 하 게 제거 된다. 두뇌 다음 4 %paraformaldehyde 플러스 cryoprotectant로 30% 자당 해결책에 싱크대 수 있습니다. 프로토콜의 두 번째 단계에서 냉동된 섹션은 40 µ m에서 슬라이딩 톰에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 잘라내어 번호 시리즈도 분리. 그것은 건조 하룻밤 최적의 결과 대 한 섹션을 떠나 단면, 직후 달걀 흰 척 슬라이드 섹션을 탑재 하는 것이 중요. 젤라틴 척 슬라이드 subbing 솔루션에서 일반적으로 사용 되는 크롬 칼륨 황산은 젖 산으로 차선 얼룩 하 cross-reacts으로 권장 하지 않습니다. 섹션 다음 절대 알코올 및 실 온에서 완전히 건조 왼쪽에서 15 분 동안 알을 품는. 이 단계 뒤에 미리 준비 하는 1% 젤라틴 솔루션에 탑재 된 섹션의 간략 한 침수 이며 최적의 결과 대 한 하룻밤 건조 수 있었습니다. 프로토콜 (아연 histochemistry)의 마지막 단계에서 개발자 솔루션 방법 섹션에서 설명 하는 단계에 따라 준비 하 고 슬라이드 솔루션에 빠져들 플라스틱 또는 유리 트레이에 배치 됩니다. 얼룩의 개발이 일반적으로 어디서 나 걸립니다 2-3 h, 하지만 가까이 검사 섹션 overstaining을 피하기 위해 필요 합니다. 적절 한 강도 달성 하는 때 슬라이드 해야 될 제거, 슬라이드 선반에 놓이고 외부 실버 보증금을 제거 하 5-10 분 동안 따뜻한 물에 씻어 서. 섹션 삭제, 실내 온도 및 coverslipped에 다음 건조 수 있습니다. 프로토콜의 아연 histochemistry 단계를 완료 하는 데 필요한 특정 단계의 회로도 그림 2에 표시 됩니다.
이 프로토콜 흰 족제비 뇌의 시각 피 질 영역 가운데 얼룩 수준에서 면적 및 층 류 변화 공개 시 냅 스 아연 histochemistry를 사용 합니다. 이 프로토콜은 다른 뇌 영역에서 뿐만 아니라 다른 종에서 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어 흰 족제비 또는 다른 모델 시스템의 somatosensory, 청각, 또는 정면 대뇌 피 질 등 다른 감각 외피가 공부 하는 연구원은 크게이 조직화 학적인 얼룩을 사용 하 여 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 성인 영역 식별을 용이 하 게 안정적으로 설치류, 흰 족제비, 고양이, 원숭이 등 젊은 동물에서 대뇌 피 질의 영역을 차별화 하는 영역 사이 명확한 전환 제공.
그림 3a 과정에서 우리가 실수로 개발 너무 길고 따라서 스테인드 섹션 overstained는 아연의 예를 보여 줍니다. Overstained 조직 그리고 매우 어두운 갈색 색상, 층 류 변화의 부족에 의해 특징은 백색 질을 무 겁 게 스테인드. 그러나, 그림 3b와 같이 아연 스테인드 뇌 섹션 understained 때때로 수 있습니다. 동물 두뇌에 여행에서 모든 삽입 된 selenite 걸로 시간 (60 분 이상), 충분 한 양의 살아나지 않았다 understained 섹션 가끔 발생할 수 있습니다. 조직의 understaining는 selenite 제대로 관리 하지 따라서 뇌에 여행 하지 않은 경우 발생할 수 있습니다.
시 냅 스 아연은 성인 흰 족제비에 여러 시각 피 질 영역에서 얼룩의 다른 유형의 분포 그림 4a에서 대표적인 반 접선 섹션에 표시 됩니다. 화살표는 영역 경계를 가리킵니다. 지역에서 17, 18, 시 냅 스 아연의 착 강도 일반적으로 I, II, III, 및 V, 레이어 및 레이어 IV (thalamorecipient 레이어), 낮은 및 레이어 6에. 분야 17와 18 사이 명확 하 게 증명할 수 있는 전환의 존재는 분명 그림 4a. 레이어 4 착 강도 영역 18에에서 약간 증가 하 고 레이어 V 감소 이며 가변 강도. 그림 4b 스테인드 영역 경계 그 아연 얼룩과 관찰의 비슷한 위치를 보여 주는 시 토 크롬 산화 효소 (CO)에 대 한 인접 한 섹션입니다. 분야 17와 일반적으로 아연의 높은 수치가 18의 지역 공동 얼룩의 낮은 수준을 나타납니다.
에 있는 두 지역 보다 덜 박판 모양 변형 분야 17와 18에에서 19-21 지역에서 시 냅 스 아연의 분포 질적 비슷합니다. 지역 19 및 21의 레이어 4입니다 명확 하 게 다른 레이어 IV 분야 17와 18에에서 알맞게 스테인드. 지역 19의 supragranular 및 infragranular 레이어 비슷한 강도의 하지만 레이어 V 얼룩 약간 어두운. 지역 21 지역 19에서에서 저것에 대 등 한 시 냅 스 아연 배포에 있다. 그러나, 지역 21의 6 레이어 레이어 IV 영역 19의 보다 큰 시 냅 스 아연 레벨 특징 이다. 레이어 VI 및 Suprasylvian IV (Ssy) 적당히 묻은 것 처럼 고 유사한 강도의 레이어 V 큰 시 냅 스 아연 수준에 의해 특징입니다 하는 동안 supragranular 레이어 시 냅 스 아연 레벨의 변동 패턴에 의해 표시 된다.
그래서 원하는 경우에 서로 다른 뇌 영역, 다른 치료, 또는 다른 연령대에서 시 냅 스 아연의 분포의 정량적 평가 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 성인 또는 기본 시각, 청각에서 개발을 통해 시 냅 스 아연의 분포에 변화 및 모델 시스템에 somatosensory 외피가 평가 할 수 있습니다. Densitometric 분석을 사용 하 여, 우리 이전을 시 냅 스 아연의 분포에에서 나타났습니다 여러 시각 영역 (17, 18, 19, 21, 및 Suprasylvian) 개발 흰 족제비 뇌의 상당히 감소 나이17의 6 주 5. 여기는 유통 과정을 설명 하는 성인 흰 족제비에서 가져온 대표 샘플에 시 냅 스 아연의 차이 평가 하는 데 필요한 단계에 설명 합니다. 젊은 흰 족제비 시각 피 질에서 뿐만 아니라 다른 종 또는 두뇌 지역에서 시 냅 스 아연의 배포 변경 내용을 추적 하려면 다음이 단계를 다음 수 있습니다. 그림 5 는 대표적인 열 photomicrographs 그들의 보완 정규화 된 광학 밀도 플롯 프로필 함께 아연 histochemistry에 대 한 처리는 성인 뇌 섹션에서 보여준다. 광학 밀도 값의 정규화 된 플롯은 대뇌 피 질의 깊이 따라 변화를 반영 하기 위해 생성 되었습니다. 따라서, 각 작 프로 파일 값 연속 대뇌 피 질의 깊이에서 평균 그레이 스케일 값을 반영합니다. 예를 들어, 17와 18 아연은 분명 자신의 플롯 프로필 레이어 4 (여 물으로 표현), 얼룩이 눈에 띄는 감소 특징 이다. 최소 광학 농도 값 17와 18에에서 채워진 검은 타원으로 표시 됩니다 의미 합니다. 낮은 아연 관찰 얼룩만와 분야 17와 18 대조의 레이어 IV에에서 아연에 미묘한 딥 레벨 지역에서 19, 21, 및 Ssy. 지역, 19, 21, 및 Ssy는 질적으로 다른 지역 17와 18 그 모든 레이어를 통해 아연 수준을 보다 더 균질 지역 17와 18에에서. 또한, supragranular 레이어 및 레이어 V 17와 18의 일반적으로 얼룩 하지 레이어 VI 보다 더 강렬 하 게.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 연구는 Danscher (1982) 방법10, 시 냅 스 아연 지역화를 감지 하 고 뇌에서 시각 수 있습니다 그것에 의하여의 수정된 된 버전에 따라 조직화 학적인 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 기본적으로 아연 chelator 나트륨 selenite (나2서구3)를 가진 동물 (15 mg/kg)를 주입 하 여 작동 합니다. 주입, 따라는 selenite 두뇌에 여행 하 고 아연을 포함 하는 신경의 연 접 소포를 지역화 된 무료 아연을 바인딩합니다. 아연 이온 분자 내의 시 냅 스 소포 침전에 있으며 실제 개발2,11이후에 구상 될 수 있다. 원래 Timm의 황화는 방법 얼룩 검사 및 다양 한 생물 학적 조직22Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni, 및 Zn 등 금속을 시각화 하기 위한 했다. 이 방법에 대 한 사용 chelating 에이전트는 나트륨 황화. 따라서, Timm의 황화 메서드를 사용 하 여 중요 한 문제 어떤 금속 금속 황화 변형 될 수 있다 실제로 실버 물리적 개발에 의해 증폭 될 수 특이성의 부족 이다. 그러나, 현재 연구에 사용 되는 Danscher 메서드의 수정 된 버전은 아연 및 다른 중 금속. Danscher의 1982 방법 및 우리가이 연구에서 설명 하는 현재 메서드 간의 몇 가지 차이점이 있다. 우리는 냉동된 조직을 사용 하는 동안 Danscher의 방법은 신선한 고정된 뇌 조직을 사용 합니다. Danscher 또한 사용도 관류 paraformaldehyde 이것이 더 immunohistochemical과 다른 조직학 우리가 일상적으로 실험실에 대 한 얼룩에 호환 사용 하는 동안 합니다. Danscher는 또한 톨루이 블루 (1%), 우리가 우리의 방법에 수행 하지 않는 등 poststaining 절차를 사용 합니다.
현재 기술에의 한 제한 동물에 의해 나트륨 selenite 공차와 연관 된 예측 이다. 우리는 나트륨 selenite 관리 후 때로는 동물 할 생존 하지 30 분 이상 찾으십시오. 이 상황 selenite 두뇌에 여행을 위한 충분 한 시간을 허용 하지 않습니다 그리고 뇌 섹션의 후속 개발 일반적으로 이끌어 낸다 고르지 조직 얼룩 문제가 포즈지 않습니다. 또 다른 잠재적인 한계 나트륨 selenite의 복 주입의 적절 한 관리와 관련이 있습니다. 하나 더 낮은 복 부 구멍의 위 피부에 당겨 하 고 복 벽을 관통 하는 15-20도 각도에서 위로 바늘 경사 쪽을 삽입 해야 합니다. 바늘 해야 될 철수 약간 되도록 복 부 장기 침투 하지는 재료 발음 하지는. 바늘의 삭제 하 고이 경우 교체 해야 합니다.
높은 품질 얼룩 결과 재현성을 보장 하기 위해, 다음과 같은 주의 조치를 하는 것이 좋습니다. 동물의 동물, 및 극대화 생존 시간으로 나트륨 selenite의 적절 한 관리 (60 ~ 90 분은 최적의) euthanizing, 전에 충분 한 시간은 selenite 뇌에 여행에 대 한 제공을 보장 하기 위해 중요 한. 우리가 찾은 그 짧은 생존 기간 (30 분 또는 더 적은) 일반적으로 고르지 못한 조직 얼룩으로 이어질. 계란-화이트 척된 슬라이드 블록 구분은 중요 한 단계 후에 즉시에 마찬가지로, 설치 섹션입니다. 갓 일 수에 대 한 PBS에 냉동된 섹션을 잘라 떠나이 좋습니다에 대 한 아연 이온 솔루션으로 밖으로 걸러 것으로. 개발자 솔루션의 준비 하는 동안 그것은 시트르산 버퍼가 올바른 pH (4.0)의이 반응은 pH에 작은 변화에 매우 민감한으로 되도록 중요. 마찬가지로, hydroquinone 솔루션을 열 때 그것은 60 ° c 온도 유지 하는 것이 필수적, 더 난방으로 솔루션 산화 되며 얼룩 억제. 마찬가지로, 잠시 잠수 젤라틴에 슬라이드 마운트 섹션은 섹션의 표면에은의 일반적인 증 착 방지로 중요 합니다. 그러나, 섹션 하지에 남아 있어야 10 이상 젤라틴 솔루션 s이 고르지 조직 얼룩으로 이어지는 주름에 원인이 될 것입니다. 개발자 솔루션에 (서) 동안 섹션의 정기 검사에 대 한 섹션은 너무 오래 overstaining으로 이어질 수 있습니다 떠난 이후 좋습니다. 이 얼룩은 상당히 민감한, 온도 섹션 주위 온도 온난 하 고 더 느리게 때 온도 쿨러를 더 신속 하 게 개발 하는 경향이 있다. 마지막으로, 하나 부드럽게 젤라틴 및 슬라이드에서 잔여 실버 보증금의 제거를 촉진 하기 위하여 따뜻한 물에 헹 구는 단계 슬라이드 랙에서 슬라이드를 동요 할 수 있습니다. 그러나, 슬립 섹션을 발생할 수 있습니다 슬라이드 따뜻한 물으로 rinsing 동안 섹션의 과도 하 고 부주의 한 동요는 슬라이드와 피해 야 한다. 그것은 또한 적절 한 제어 densitometric 측정 양적 비교에 사용 됩니다 보장 하기 위해 중요 한입니다. 하나 수 사용 하 여 가볍게 스테인드 또는 비 얼룩 지역 내부 통제로. 우리의 자료 사용 하 여 백색 질 컨트롤 개발에 걸쳐 다른 시각 피 질 영역에서 광학 밀도 값을 정규화 하. 우리는 백색 질 값은 비교할 다른 연령대에 걸쳐 및 성인17에서 찾을. 따라서, 주어진 그 백색 질 값이 나이의 기능으로 변경 되지 않습니다, 백색 질 역할을 densitometric 분석에 대 한 유효한 제어 합니다.
이 방법의 주요 장점은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 조직화 학적인 얼룩 그 분포 사용할 수 있습니다, 다른 조직화 학적인 마커 같은 뇌 영역을 구별 하는 것입니다. 그러나,이 조직화 학적인 방법의 사용 (그 아연 부족), 특정 세포 인구를 공부 하기 적합 하지 않을 수 있습니다 또는 시 냅 스 아연으로 아주 젊은 동물에서 레벨 개발 somatosensory 마우스와 고양이 시각 피 질5에서와 같이 출생 시 처음 낮은 ,20. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 신경 해부학 추적 프로그램 주입 실험과 함께에서 사용할 수 있습니다. 우리 실험실에서 우리는 일반적으로 연결 패턴 시각 피 질에 여러 지역 중에서 개발 변화 공부 하는 젊은 흰 족제비의 기본 시각 피 질으로 양방향 신경 추적 주사. 따라서, 동물 필요 사용할 수 없습니다 전적으로 아연 histochemistry에 대 한 경우는 동물 다른 실험 연구에 대 한 악용 될 수 있습니다. 설명된 방법의 주요 장점은 다른 종에서 그리고 다른 두뇌 지역에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리는 흰 족제비 뇌 조직을 사용 하 여이 방법을 증명 하고있다, 비록 있을 수 있습니다 일부의 단계에 미묘한 차이가 설치류, 고양이, 또는 원숭이 뇌 조직 공부를 할 때. 다른 사람 성공적으로 성인 원숭이 시각 피 질8, 개발 및 성인 고양이 시각 피 질5쥐 somatosensory 피 층9 을 개발 패턴을 얼룩이 지기에 차이 설명 하기 위해이 아연 조직화 학적인 방법 사용 , 20, 성인 마우스 somatosensory 피6,21, 그리고 성인 파 왈 시각 피 질7.
여기 우리는 프로토콜 및 밑줄 중요 한 매개 변수를 일관 되 게 높은-품질 아연 얼룩을 달성 하기 위해 제어 해야 하는 기본 단계를 설명 합니다. 하나는 다른 감각 또는 모터 외피가에서 시 냅 스 아연 수준 또는 다른 모델 동물에서 subcortical 구조 변화를 평가 하 고 좋습니다. 양적 정보는 densitometric를이 제공 하는 nalysis (같이 우리는 이전17) 대뇌 피 질의 개발 시간 및 다른 뇌 영역 간의 시 냅 스 아연 레벨의 가능 하 게 드러내는 다른 발달 프로필을 다음에 대 한 유리한 될 수 있습니다. 중요 한 고려 사항은 발달 질문 이며 공부 하는 동물의 해당 나이. 시 냅 스 아연 histochemistry 흰 족제비에 명확 하 게 식별할 수 있는 시각 피 질 영역을 계시 하 고 대뇌 피 질의 조직 그리고 기능의 추가 연구에 유용한 가이드 역할을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 연구 자원 (2G12RR03060-26A1);에 대 한 국립 센터에서 교부 금에 의해 지원 되었다 소수 민족 건강과 건강 격차 (8G12MD007603-27) 건강; 국립 보건원에서 국립 연구소 뉴욕 (CUNY PSC);의 전문 직원 의회 도시 대학 그리고 교수 연구 그랜트 (FRG II) 아메리칸 대학의 샤. 우리는 이러한 방법에 우리를 도입에 대 한 Vidyasagar Sriramoju 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
