Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Brug af Synaptic zink histokemi at afsløre forskellige regioner og bladplader i udviklingslandene og voksen hjerne

Published: October 29, 2017 doi: 10.3791/56547
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, Chemistry and Environmental Sciences, American University of Sharjah, 2Department of Biology, The City College of New York

Summary

Vi beskriver en histokemiske procedure, der afslører karakteristiske laminar og areal zink farvning mønstre i forskellige hjerneregioner. Den zink-farvning mønster kan bruges sammen med andre anatomiske markører til pålideligt skelne lag og regioner i udviklingslandene og voksen hjerne.

Abstract

Karakterisering af anatomiske og funktionelle hjernen organisation og udvikling kræver nøjagtig identifikation af særskilte neurale kredsløb og regioner i hjernen, umodne og voksen. Her beskriver vi en zink histokemiske farvnings-procedure, der afslører forskelle i farvning mønstre mellem forskellige lag og hjerneregioner. Andre har udnyttet denne procedure ikke blot til at afsløre fordelingen af zink-holdige neuroner og kredsløb i hjernen, men også med held afgrænse areal og laminar grænser i den udvikling og voksen hjerne i flere arter. Her vi illustrere dette farvning procedure med billeder fra udviklingslande og voksne ilder hjerner. Vi afslører en zink-farvning mønster, der fungerer som en anatomisk markør for områder og lag, og pålideligt kan bruges til at skelne mellem visual kortikale områder i udviklingslandene og voksne visuelle cortex. Hovedformålet med denne protokol er at præsentere en histokemiske metode, der giver mulighed for nøjagtig identifikation af lag og regioner i udviklingslandene og voksen hjernen hvor andre metoder mislykkes hertil. Sekundært, sammenholdt med densitometric billedanalyse, denne metode gør det muligt at vurdere fordelingen af synaptic zink til at afsløre potentielle ændringer i hele udvikling. Denne protokol beskriver i detaljer de reagenser, værktøjer og nødvendige skridt til at successivt pletten frosne hjernen sektioner. Selv om denne protokol er beskrevet ved hjælp af ilder hjernevæv, kan det nemt tilpasses til brug i rotter, katte eller aber såvel som i andre områder af hjernen.

Introduction

Histologiske pletter har traditionelt været brugt til at støtte i identifikationen af kortikale områder i forskellige arter ved at afsløre forskelle i arkitektonisk funktioner. Histokemiske metoder såsom kombineret brug for Nissl stof, cytokrom oxidase (CO) reaktivitet eller myelin kan vise sig frugtbar, som de afslører lignende areal grænser i den voksne hjerne. Men disse histokemiske pletter ikke altid tilstrækkeligt afsløre klare grænser mellem kortikale områder og lag i den umodne hjerne.

I det centrale nervesystem har zink flere kritiske funktioner, der omfatter stabilisering DNA struktur, som et enzym cofaktor, deltager i talrige regulerende funktioner, og fungerer som en neuromodulator gennem sin tilstedeværelse i synaptiske vesikler 1. synaptisk zink er enestående, da det kan visualiseres, histologiske metoder, protein-bundet zink kan ikke være visualiseret2. Denne funktion er blevet udnyttet til at afsløre synaptic zink mønster i forskellige kortikale regioner og synaptic zink histokemi har været anvendt i en række undersøgelser. Et undersæt af glutamatergic neuroner i hjernebarken indeholder zink i de præsynaptiske vesikler i deres axon terminaler3,4. Histokemiske undersøgelser har afsløret en heterogen fordeling af synaptic zink i hjernebarken5,6,7. Der synes at være en anderledes areal og laminar fordeling af histochemically reaktive zink i forskellige kortikale regioner (f.eks.visuel versus somatosensoriske cortex), eller lag (f.eks.zink niveauer i supragranular og infragranular lag af primære visuelle cortex er væsentligt højere end i thalamocortical input lag IV med relativt lav synaptic zink niveauer)5,8,9. Heterogenitet i synaptic zink farvning observeret i cortex er specielt fordelagtig, da det letter areal og laminar identifikation.

Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af en synaptic zink histokemiske procedure, som er en modificeret version af Danscher's 1982 metode10. Denne metode udnytter selenite injiceres intraperitoneal (IP) til dyr som en chelatdanner. Selenite rejser til hjernen til at reagere med puljer af gratis zink fundet i blærer af et undersæt af glutamatergic synapser i hjernen. Denne reaktion giver et bundfald, der kan forbedres efterfølgende af sølv udvikling2,10,11.

Denne procedure afslører laminar og areal mønstre af synaptic zink farvning; densitometric analyse kan anvendes til at vurdere disse mønstre både kvalitativt og kvantitativt i de voksne og umodne hjerne at studere virkningerne af andre interventioner, såsom sensorisk, miljømæssige, farmakologiske eller genetiske manipulationer. Derudover kan man også ønsker at vurdere potentielle udviklingsmæssige ændringer i fordelingen af synaptic zink i andre kortikale eller subkortikale strukturer i andre modelsystemer. De kvantitative oplysninger, der densitometric analyse giver i denne metode kan være fordelagtigt for følgende hjernens udvikling over tid. Denne protokol giver en følgesvend til andre immuno- og histokemiske markører for at afsløre laminar og areal grænser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

følgende protokol følger dyrs pleje retningslinier af institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) på The City College of New York, som i overensstemmelse med alle relevante statslige og føderale retningslinjer. Anæstesi er relevant for fritter, og bør være tilpasset arter studerede.

Figure 1
figur 1: Flowchart beskriver de vigtigste trin involveret i de 3 faser af denne protokol og den tid, der kræves for at fuldføre hvert trin. Perioder kræver sektioner tørre fuldstændigt, er vist i grøn tekst cirkler, mens alle andre trin er i hvid tekst cirkler. Den grønne diamant-formede tekstboks er en beslutning punkt, mens den røde rektangel er et kritisk skridt og bør udføres med ekstra pleje. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1. forberedende skridt (skub Subbing og løsning gør)

  1. vask unsubbed dias med et vaskemiddel i varmt vand og skyl flere gange i varmt vand efterfulgt med destilleret vand skylles grundigt fjerne enhver snavs eller snavs. Tillad dias til tørt ved stuetemperatur eller i en ovn ved 37 ° C.
  2. Når slides er helt tørt, lag en tynd jævnt lag af æggehvide på de enkelte dias ved hjælp af fingrene eller en pensel. Lad det tørre i ovnen ved 60 ° C i 20-30 min. For optimale resultater og undgå sektioner glider ud, tilføje en anden frakke af æggehvide og giver mulighed for at tørre igen i ovnen ved 60 ° C.
  3. Fremstilles en opløsning af 1% gelatine ved at opløse 1 gram af gelatine i 100 mL varmt vand (60 ° C) og lad det køle til stuetemperatur.
  4. Forberede 200 mL af udvikleren løsning som beskrevet nedenfor til brug i sektion 4.
    1. Forbered gummi arabicum løsning ved at langsomt tilføje 40 g i intervaller på 120 mL varmt vand (det opløser mere nemt på denne måde). Fortsætte med at opløsningen omrøres med en glas omrøring stang. Når løsningen er helt opløst, tag det fra varmen og lad det afkøle i et par min., derefter filtreres gennem 6-8 lag af gaze klud i en tragt.
    2. Forbered citrat buffer ved at tilføje 5,04 g citronsyre plus 4,7 g natriumcitrat i 20 mL dH 2 O og opløse blandingen. Sikre, at pH-værdien af denne løsning er 4.0 på 25 ° C. Juster pH-værdien om nødvendigt ved at tilføje natriumhydroxid eller saltsyre til løsningen.
    3. Forbereder hydroquinonopløsning ved opvarmning 30 mL dH 2 O og opløse 1,7 g hydroquinon.
      Bemærk: Varme hydroquinon-løsningen er vigtigt at tillader det at opløses let i vand som hydroquinon ikke er let opløselige i vand ved stuetemperatur. Vær omhyggelig med at holde temperaturen af vandet under 60 ° C, ellers hydroquinon kan oxideres. Hvis løsningen bliver gul, kassér og forberede en anden frisk løsning.
    4. Forbered sølv laktat løsning ved at opløse 0,22 g i 30 mL af dH 2 O.
    5. Blandes løsningerne (1.4.1 - 1.4.4) i den rækkefølge, som de er beskrevet når du er klar til at udføre Reaktionerne (dvs. efter skæring, tørring og fastsættelse) ( figur 2). Tilføje sølv laktat løsning for enden. Sikre, at dette trin er afsluttet hurtigt og udvikleren løsning er placeret i mørke, indtil det er tid til at reagere i afsnit som sølv laktat er lysfølsomme.

Figure 2
figur 2: skematisk illustrerer rækkefølgen af trin involveret i blande reagenserne i zink histokemi fase af protokollen. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. dyr behandling og Anesthesia

  1. før sederende dyret, der fremstilles en 1% natrium selenite (Na 2 SeO 3) opløsning ved at opløse 10 mg natrium selenite i 1 mL dH 2 O.
  2. Bedøver dyret med en intramuskulær injektion af ketamin (25 mg/kg) og xylazin (2 mg/kg).
    Bemærk: Sikre, at et passende niveau af anæstesi er opnået ved hjælp af en pedal refleks reaktion.
  3. Inject zink chelator natrium selenite løsning (15 mg/kg) intraperitoneal (IP).
    Bemærk: Toksiciteten af natrium selenite på forskellige alderstrin eller i andre arter kunne variere.
  4. Tillad 60 til 90 min for natrium selenite at rejse til hjernen. I denne periode, er det nødvendigt at sikre, at dyret er korrekt bedøvet og ikke reagerer, så tjek dybde af anæstesi hver 5 min.
  5. i perioden selenite mens dyret er bedøvede, sikre at øjnene er lukkede for at forhindre tørhed, eller administrere oftalmologiske salve for at holde dem fugtige.

3. Væv forberedelse og farvning

  1. aflive dyret ved at administrere en overdosis af natrium pentobarbital (100 mg/kg, i.p).
  2. Udføre transcardial perfusion med normal saltopløsning for 1 min, og 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min. Endelig, administrere en løsning med 4% PARAFORMALDEHYD og 10% saccharose (en samlede fiksering periode på 1 time).
  3. Fjerne hovedet ved hjælp af et par store sakse.
  4. Lave en midterlinjen snit ved hjælp af en skalpel fra næsen til halsen for at eksponere kraniet.
  5. Forsigtigt fjerne hjernen og adskille halvkugle med en klinge.
  6. Blokere den bageste del af hjernen og postfix i 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfat-buffer (PB) i flere timer.
  7. Placere blokke i en 30% rørsukkeropløsning 0,1 M PB og tillade hjernen til at synke.
    Bemærk: Erstatter 4% PARAFORMALDEHYD og 30% rørsukkeropløsning med 30% rørsukkeropløsning 0,1 M PB at synke hjernen begrænser hjernen ' s eksponering for PARAFORMALDEHYD som dette kan påvirke væv farvning kvalitet.
  8. Når hjernen dræn, skær semi-tangential 40 µm tykt sektioner gennem det visuelle cortex eller område af interesse på en indefrysning, glidende mikrotomen eller kryostaten. Dette kan opnås ved at placere blok med medialt overflade ned og blidt udfladning med et glas dias.
  9. Indsamle sektioner med en pensel og opbevares i en tackle kasse indeholdende fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  10. Adskille sektionerne i separate nummereret serie. Straks montere en eller to serier af hjernen sektioner på æggehvide subbed dias (afsnit 1), giver mulighed for at tørre natten over ved stuetemperatur, og behandle sektioner histochemically for synaptic zink.
    Bemærk: Andre serier kan behandles for andre markører for sammenligning, som myelin 12 eller cytokrom oxidase ved hjælp af den ændrede protokol 13: inkuberes i 2-8 timer ved 40 ° C med 3% saccharose, 0.015% cytokrom C, 0.015% katalase, og 0,02% diaminobenzidine i 0,1 M PB. Nissl stof kan også bruges som en histologisk markør for at skelne visuelt kortikale områder. Disse andre histologiske pletter kræver ikke, at hjernen sektioner er monteret på æggehvide subbed dias, så de traditionelle gelatine belagt dias kan bruges i stedet.

4. Synaptic zink histokemi

  1. Fix dias monteret sektioner i absolut alkohol i 15 min. og lad den tørre helt ved stuetemperatur for 1 h.
    2. < lJeg > kortvarigt fordybe sektioner for 10 s i en 1% gelatine løsning (afsnit 1) og lad den tørre natten over ved stuetemperatur.
    Bemærk: Optimale resultater tillade sektioner til tørre natten over. Tillader afsnit til tørre natten giver bedre væv farvning.
  2. Opløsninger blandes sammen som beskrevet i trin 1.8 så snart sektioner er klar til at blive reageret.
    1. Reagerer sektionerne ved at arrangere dias side om side i et glas eller plastik bakke, og hælde den tredje løsning på diasene. Kontroller, at dias er helt neddykket i opløsningen og overføre bakken ind i et mørkt rum, eller dække med en lys-stram boks.
      Bemærk: En plastik bakke, der er omkring 12 inches lang med 8 inches bred kan bruges, som passer præcis 18 dias. En samlet maengde paa 200 mL udvikleren løsning er tilstrækkelig til helt nedsænkes dias, så sikre, at den korrekte volumen bruges til antallet af dias til at blive reageret og justere opskriften i overensstemmelse hermed. Brug af en plast eller glas bakke i modsætning til ved hjælp af en metal plade er tilrådeligt, da der er en vis grad af cross reaktivitet mellem den sølv laktat i opløsningen udvikler og jern eller andre metaller findes i metal bakker.
  3. Overvåge udviklingen af reaktionen af visuelt inspicere sektioner hvert 30 min. Sektionerne generelt kræver 120-180 min. for komplet udvikling.
  4. Hvis sektioner bliver overstained (Se figur 3a), differentiere i 2% Farmer ' s løsning (9 dele 2% natrium thiosulfate i dH 2 O og 1 del 2% kalium Ferricyanid i dH 2 O) i 1-2 min.
    Bemærk: Prøven afsnittet, der er dårligt farves er vist i figur 3b.
  5. Når den ønskede intensitet er opnået, opsige reaktion ved at fjerne diasset monteret sektioner fra bakken og placere diasene på et dias rack.
  6. Placer slide rack i et stort glas farvning parabol og vaske dias i varmt (40-50 ° C) rindende vand i 10 min at fjerne gelatine pelsen og den ydre sølv depositum.
    Bemærk: Pas på ikke at agitere dias rack for at forhindre, at sektioner glider ud. Den ønskede intensitet i afsnittet opnås når tilstrækkelige laminar variation er indlysende og sektioner er mørk nok men ikke overreagerede (Se figur 4a).
  7. Tillade dias til tørt ved stuetemperatur, og derefter dehydrere i 100% EtOH (5 min), klare i xylen (5 min) og dække slip med en montering medium. Alternativt, placere dias i en stigende række af alkohol, så dehydrere, klart, og coverslip.
  8. Brug sektioner fra dyr uden tidligere selenite behandling til at tjene som en negativ kontrol. Sølv forstærkning af disse sektioner skal give nogen farvning.

Figure 3
figur 3: Synaptic zink farvning i hjernen, juvenil ilder. Mikrofotografier af semi-tangential zink-farvede sektioner, der er en) overstained og b) understained i juvenile ilder hjernen. Areal grænser er vanskeligt at skelne som laminar variation mangler. Hvid substans er også stærkt plettet. Ssy Suprasylvian cortex, WM hvid noget, en anterior, D dorsale. Skalalinjen = 500 µm (a-b). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

5. adskille Areal grænser og Image erhvervelse

  1. Brug arkitektoniske elementer i forskellige hjerneregioner for areal og laminar identifikation.
    Bemærk: For eksempel i den tredje rotte retrosplenial cortex 14, forfatterne viste en forbigående modularitet karakteriseret ved tunge farvning for zink, som ikke er til stede i voksen, men som kunne udnyttes til at beskrive kortikale organisation under udvikling i denne art. I en anden undersøgelse 15 afslørede forfatterne specificitet i synaptic zink fordelingen af forskellige kerner fundet i makak abe amygdala, som lette identifikationen af disse divisioner. Visuelle kortikale områder i udviklingslandene og voksne ilder hjernen har været tidligere beskrevet 16 , 17 , 18, arkitektonisk underopdeling af neocortex i grå egernet blev beskrevet 19. Derudover blev zink histokemi tidligere brugt til at skelne mellem områder i voksen abe visuelle cortex 8, udvikle og voksen kat visuelle cortex 5, udvikle rotte somatosensoriske cortex 9 , 20, og voksen mus somatosensoriske cortex 6 , 21. Hvis det er muligt, sammenligne det farvning mønster i myelin farves, cytokrom oxidase (CO) farves og synaptic zink farves hjernen sektioner, for at bekræfte areal grænser i voksen. I semi-tangential sektioner af ilder visuelle cortex farvet for synaptic zink, er der fremtrædende forskelle blandt visuelle kortikale områder, som letter areal identifikation. For eksempel afsløre områder 17 og 18 i den voksne ilder, synaptic zink farvning er høj i lag I-III og V. lag VI pletter mindre intenst, mens lag IV næsten mangler zink. Den iøjnefaldende mangel på zink farvning i lag IV eller områder 17 og 18 kontraster med mørkt farvede bandet fundet i lag IV i CO farves sektioner. Dog lag IV i området 17 i CO farves sektioner fastholder en skarp kant med lag III og V, men lag IV i området 18 karakteriseret ved en subtil fald i farvning intensitet og dens øvre grænse findes i lag III er mindre skelnes.
  2. Undersøge sektioner ved hjælp af brightfield mikroskopi med et lavt strømforbrug mål (2 X eller 4 X forstørrelse) og fotografere interesseområder.
  3. Forbedre kontrast og lysstyrke af mikrofotografier ved hjælp af billedbehandlingsprogram. Billeder fremstillet for ekstinktionen målinger ikke bør ændres på nogen måde.

Figure 4
figur 4: Synaptic zink farvning i hjernen, voksne ilder adskiller forskellige visuelle kortikale områder. Mikrofotografier af tilstødende semi-tangential sektioner farvet for (en) synaptic zink eller (b) cytokrom oxidase (CO) i voksen. Pilene mærket areal grænser. Cortex Ssy Suprasylvian, en anterior, D dorsale. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

6. densitometri (valgfri)

Bemærk: Densitometric analyse kan anvendes til at vurdere fordelingen af synaptic zink i hjernen ved måling af Ekstinktionen af repræsentative zink farves sektioner i områder af interesse. Denne metode er også nyttige til at spore mulige ændringer i synaptic zink niveauer i hele udvikling.

  1. Ved hjælp af udvalgte zink-farvede sektioner, vælge tilfældigt kortikale kolonner (søjleformede mikrofotografier) af passende bredde (en 450 µm bred kolonne kan bruges) fra erhvervet mikrofotografier i det pågældende område. En kortikale kolonne er en region, der spænder over alle kortikale lag fra pial overfladen til den hvide substans.
  2. Vælger et passende antal prøve kolonner fra flere forskellige hjernen sektioner i hver region af interesse.
  3. Overføre prøven billeder af repræsentative kolonner i et billedbehandlingsprogram.
  4. Bruger den rektangulære markeringsværktøj til at omfatte hele kortikale kolonnen.
  5. Bruge værktøjet inverter til at skabe en kontrast omvendt billede svarende til et fotografisk negativ af kolonnen.
    Bemærk: Kontrast inversion af billederne er udført for at give høj optisk tæthed for høj synaptic zink niveauer og lav ekstinktionen værdier for lav synaptic zink niveauer. Dette er en mere intuitiv måde at gengive plot profil grafer svarer til dem, der ses i figur 5.
  6. Producerer ekstinktionen profiler fra disse billeder ved hjælp af værktøjet plot profil til at generere en to-dimensionel graf af pixel intensiteter langs en linje.
  7. Brug plot muligheder for at konvertere plot profil grafen til en lodret profil og klikke på plot profil én gang mere.
    Bemærk: X-aksen repræsenterer afstand langs linjen og y-aksen repræsenterer pixel intensitet. Derfor hver plot profil værdi afspejler den gennemsnitlige grå skala værdi på hver dybde over hele bredden af kolonnen.
  8. Åben plot profil værdier som tekstfiler i regneark, normalisere, og plot som grafer (Se figur 5).
    Bemærk: Det er tilrådeligt at bruge den relative massefylde af synaptic zink til sammenligning af kvantitative målinger, som resultaterne kan blive forvirret af variation i samlede farvning intensitet som følge af forskellige reaktionstider, stainability af væv, såvel som andre variabler.
  9. Beregne relative zink tæthed ved først at udføre en boxcar gennemsnittet af plot profil værdier til at udjævne data.
    Bemærk: Dette er opnået ved at tage gennemsnittet for eksempel hver efterfølgende 20 eller 30 pixels (1 pixel = 2,5 µm) i dybden, og derefter normalisere til maksimal intensitet for hver prøve. Derfor afspejler hver gennemsnitlige plot profil værdi den gennemsnitlige grå skala værdi i denne dybde (grå skala værdier varierer fra 0 til 255). En anden normalisering metode kan anvendes af første overtagende hvide substans (WM) ekstinktionen værdier fra prøven regioner, som omfatter den underliggende hvide substans i områderne af interesse. Ideelt, Vælg flere regioner, der er så let plettet som muligt at opnå en gennemsnitlig WM værdi. Gennemsnitlige ekstinktionen værdier er derefter divideret med WM middelværdier at få WM normaliserede værdier.
  10. Bestem betyde ekstinktionen værdier i særlige lag af regioner af interesse for kvantitative sammenligninger.
    Bemærk: For eksempel, betyder minimum ekstinktionen værdien i lag IV af visuelle kortikale områder af opspore bestemmes af omfatter mindst farves regionen ±5 pixel.
  11. Beregn gennemsnitlige ekstinktionen værdier i supragranular og infragranular lag af visuelle kortikale områder i opspore ved omfatter den mørkeste farves region af ±5 pixels til at bestemme den maksimale gennemsnitsværdien.
  12. Sikre at betyde ekstinktionen værdier er fremstillet inden for særlige lag.
    Bemærk: Det er bydende nødvendigt at kontrollere grænserne for disse lag i kontrast inverteret billeder ved at sammenligne dem med de originale mikrofotografier samt de tilstødende CO sektion. Dette sikrer, at man ikke trænge på tilstødende lag.

Figure 5
figur 5: Laminar distribution af synaptic zink i forskellige visual kortikale områder i den voksne ilder. Repræsentative mikrofotografier kolonner gennem alle kortikale lag med tilsvarende normaliseret ekstinktionen profiler i en voksen. Lav synaptic zink tæthed i lag IV af voksen områder 17 og 18 er angivet med trug i profil plot. I hver plot profil angiver fyldt ovaler i trug af lag IV værdierne, der bruges til at bestemme den gennemsnitlige mindste pixel intensitet værdi. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De vigtigste trin involveret i denne protokol at plette hjernen sektioner for synaptic zink er præsenteret i et rutediagram i figur 1. Protokollen kan opdeles i tre faser: 1) Perfusion og væv samling, 2) væv forberedelse og farvning, og 3) zink histokemi. Kort, under den første fase af protokollen, dyret er bedøvede og injiceres IP med den passende dosis af natrium selenite. Efter et tilstrækkeligt tidsrum (ideelt 60-90 min.), er dyret efterfølgende euthanized, perfunderet med 0,9% NaCl opløsning efterfulgt af en 4% PARAFORMALDEHYD løsning. Hovedet er halshugget og hjernen er hurtigt fjernet fra kraniet. Hjernen er så lov til at synke i en 4% PARAFORMALDEHYD plus 30% rørsukkeropløsning som kryoprotektant. I den anden fase af protokollen, er frosne sektioner skåret på en glidende mikrotom på 40 µm i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og opdelt i nummereret serie. Det er vigtigt at montere sektioner på æggehvide subbed dias umiddelbart efter skæring, forlader sektioner til tørre natten over for optimale resultater. Gelatine subbed dias ikke anbefales som chrom kaliumsulfat bruges typisk i opløsningen subbing cross-reacts med sølv laktat, hvilket fører til suboptimale farvning. Sektioner er derefter inkuberes i 15 min i absolut alkohol og overladt til tørre helt ved stuetemperatur. Dette trin er efterfulgt af en kort nedsænkningen af de tilsluttede sektioner i 1% gelatine løsning forberedt i god tid og lov til at tørre natten over for optimale resultater. I den sidste fase af protokollen (zink histokemi), udvikleren løsning er tilberedt efter trinene i afsnittet metoder og dias er placeret i en plastik eller glas bakke neddykket i opløsningen. Udviklingen af pletten tager typisk et sted mellem 2-3 h, men tæt visuel inspektion er nødvendig for at undgå overstaining i afsnit. Når den passende intensitet er opnået, bør dias fjernes, placeres på et dias rack og skylles i varmt vand i 5-10 min. til at fjerne den ydre sølv depositum. Afsnittene kan derefter tørres ved stuetemperatur, ryddet og coverslipped. En skematisk af de specifikke skridt, der kræves for at fuldføre zink histokemi fasen af protokollen er vist i figur 2.

Denne protokol bruger synaptic zink histokemi for at afsløre areal og laminar variation i farvning niveauer blandt visuelle kortikale områder i hjernen, ilder. Denne protokol kan tilpasses til brug i andre arter såvel som i andre områder af hjernen. For eksempel, forskere studerer andre sensoriske cortex, som somatosensoriske, auditive eller frontal cortex af opspore eller enhver anden modelsystem ville få stor gavn af ved hjælp af denne histokemiske pletten. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver klart overgange mellem områder til at fremme areal identifikation hos voksne og pålideligt differentiere kortikale områder i unge dyr såsom gnavere, fritter, katte og aber.

Figur 3a viser et eksempel på en zink farves afsnit, at vi uforvarende udviklet til alt for længe og dermed var overstained i processen. Overstained væv er karakteriseret ved en meget mørk brun farve, en mangel på laminar variation, og stærkt farvet hvide substans. Zink-farvede hjernen sektioner kan dog undertiden være understained, som vist på figur 3b. Understained sektioner kan undertiden forekomme hvis dyret ikke overlevede i et tilstrækkeligt tidsrum (mindst 60 min), som udelukker alle de injicerede selenite fra rejser til hjernen. Understaining af væv kan også opstå, hvis selenite ikke var administreres ordentligt og derfor ikke rejse til hjernen.

Heterogen fordeling af synaptic zink farvning i flere visuelle kortikale områder i en voksen ilder er vist i en repræsentativ semi-tangential sektion i figur 4a. Pilene peger areal grænser. I områder 17 og 18, farvning intensiteten af synaptic zink er generelt høj i lag I, II, III og V, og lav i lag IV (thalamorecipient lag), og moderat i lag VI. Tilstedeværelsen af en klart identificerbar overgang mellem områder 17 og 18 er tydeligt i figur 4a. Lag IV farvning intensiteten i området 18 stiger lidt og lag V falder og er af varierende intensitet. Figur 4b er et tilstødende afsnit farvet for cytokrom oxidase (CO), der illustrerer lignende steder af arealundersøgelses grænser til dem vi observeret med zink pletten. Regioner i områder 17 og 18, der har høje niveauer af zink generelt synes at have lave niveauer af CO farvning.

Fordelingen af synaptic zink i områder 19 og 21 er kvalitativt lignende, idet begge områder har mindre laminar variation end i områder 17 og 18. Lag IV områder, 19 og 21 er klart adskiller sig fra lag IV i områder 17 og 18, idet det er moderat farves. Supragranular og infragranular lag af området 19 er af lignende intensitet, men lag V pletter lidt mørkere. Område 21 har en sammenlignelig synaptic zink distribution til der inden 19. Dog er lag VI område 21 karakteriseret ved større synaptic zink niveauer end lag IV af området 19. Lag VI og IV af Suprasylvian (Ssy) synes at være moderat farves og har sammenlignelige intensitet, mens lag V er karakteriseret ved større synaptic zink niveauer og supragranular lag er præget af en svingende mønster af synaptic zink niveauer.

Kvantitativ vurdering af fordelingen af synaptic zink i forskellige hjerneregioner, med forskellige behandlinger, eller på forskellige alderstrin, kan blive realiseret, hvis det ønskes. For eksempel kan man ønsker at vurdere ændringer i fordelingen af synaptic zink i voksne eller hele udviklingen i primære visuelle, auditive, og somatosensoriske cortex i enhver modelsystem. Anvendelse af densitometric analyse, vi har tidligere vist, at fordelingen af synaptic zink i flere visuelle områder (17, 18, 19, 21 og Suprasylvian) af udviklingslandene ilder hjernen, falde betydeligt fra fem til seks uger af alder17. Her beskriver vi de trin, der kræves for at vurdere forskelle i fordelingen af synaptic zink i repræsentative prøver taget fra en voksen ilder til at illustrere processen. Disse trin kan følges for at spore ændringer i fordelingen af synaptic zink i juvenile ilder visuelle cortex såvel som i alle andre arter eller hjernen regioner. Figur 5 viser repræsentative søjleformede mikrofotografier fra voksne hjerne afsnit behandles for zink histokemi sammen med deres komplementære normaliseret ekstinktionen plot profiler. Normaliserede parceller af ekstinktionen værdier blev genereret for at afspejle ændringer ifølge kortikale dybde. Derfor afspejler hver plot profil værdi den gennemsnitlige grå skala værdi på fortløbende kortikale dybder. Eksempelvis er områder 17 og 18 karakteriseret ved en mærkbar nedgang i zink farvning i lag IV (repræsenteret ved truget), som fremgår af deres plot profiler. Betyde minimum ekstinktionen værdier i områder 17 og 18 er angivet med udfyldt sort ovaler. Lav zink farvning observerede i lag IV af områder 17 og 18 kontraster med kun en subtil dukkert i zink niveauer i områder, 19, 21 og Ssy. Kollektivt, områder 19, 21 og Ssy er kvalitativt anderledes end områder 17 og 18, idet zink niveauer gennem alle lag er mere homogen end i områder 17 og 18. Desuden, de supragranular lag og lag V områder, 17 og 18 typisk pletten mere intenst end lag VI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende undersøgelse beskæftiger en histokemiske teknik baseret på en modificeret version af Danscher (1982) metode10, hvorved synaptic zink lokalisering kan opdages og visualiseret i hjernen. Denne metode virker primært ved at indsprøjte dyr med zink chelator natrium selenite (Na2SeO3) (15 mg/kg). Efter injektion, selenite rejser til hjernen og binder sig til gratis zink, der er lokaliseret til præsynaptiske vesikler zink indeholdende neuroner. Zink-ioner bundet til molekyler i synaptiske vesikler bundfaldet, og efterfølgende kan visualiseres gennem fysiske udvikling2,11. Den oprindelige Timm svovlholdigt sølvfarvning metode var beregnet til at registrere og visualisere en række tungmetaller som Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni og Zn i biologisk væv22. Chelatdanner anvendes til denne metode er natrium svovlholdigt. Derfor er et stort problem med hjælp af Timms svovlholdigt metode manglende specificitet som enhver metal, der kan omdannes til en metal svovlholdigt kunne faktisk være sølv forstærkes af fysiske udvikling. Men den ændrede version af metoden Danscher, der bruges i den aktuelle undersøgelse er specifikke for zink og ingen andre tungmetaller. Der er flere forskelle mellem Danscher's 1982 metode og den nuværende metode vi beskriver i denne undersøgelse. Danschers metode bruger friske ikke optagne hjernevæv, mens vi bruger frossen væv. Danscher bruger også glutaraldehyd for perfusion, mens vi bruger PARAFORMALDEHYD, da dette er mere kompatibel med immunhistokemiske og andre histologiske markører vi rutinemæssigt pletten i vores laboratorium. Danscher bruger også poststaining procedurer såsom toluidin blå (1%), som ikke udfører vi i vores metode.

En begrænsning af den nuværende teknik er uforudsigelighed forbundet med natrium selenite tolerance ved dyr. Vi finder, at efter administration af natrium selenite, undertiden dyr ikke overlever længere end 30 minutter. Denne situation udgør et problem, da det tillader ikke tid nok til selenite at rejse til hjernen, og efterfølgende udvikling af hjernen sektioner typisk fører til ulige væv farvning. En anden potentiel begrænsning er relateret til en korrekt forvaltning af intraperitoneal injektion af natrium selenite. Man bør trække på huden over de lavere bughulen og indsætte nålen facet side op i en vinkel på 15-20 grader, gennemtrængende kun den abdominale væg. Nålen skal trækkes tilbage lidt for at sikre, at den abdominale organer ikke har været trængt og materiale har ikke været indsugning. Nålen skal bortskaffes og erstattet, hvis dette sker.

For at sikre høj kvalitet farvning resultaterne og reproducerbarhed, anbefaler vi følgende advarende foranstaltninger. Korrekt administration af natrium selenite i den animalsk, og maksimere overlevelsestid af dyret (60 til 90 min. er optimal) før euthanizing, er afgørende for at sikre tilstrækkelig tid gives til selenite at rejse til hjernen. Vi har fundet de kortere overlevelse perioder (30 minutter eller mindre) typisk føre til ulige væv farvning. Ligeledes, montering sektioner på æggehvide subbed dias umiddelbart efter skæring blokken er et kritisk skridt. Efterlader frisk skåret frosne sektioner i PBS for et antal dage er stærkt frarådet som zink ioner vil sive ned i løsning. Under udarbejdelsen af udvikleren løsning er det afgørende at sikre citratbuffer er af den korrekte pH (4.0) som denne reaktion er meget følsom over for små ændringer i pH. Ligeledes, når varme hydroquinonopløsning er det bydende nødvendigt at opretholde temperaturen under 60 ° C, som yderligere opvarmning vil oxidere løsningen og hæmme pletten. Tilsvarende er kort nedsænkning afsnittene slide-monteret i gelatine kritisk, da det forhindrer uspecifikke aflejring af sølv på overfladen af afsnittet. Sektioner bør dog ikke efterlades i opløsningen gelatine længere end 10 s som dette vil få dem til at visne op fører til ulige væv farvning. Periodisk besigtigelse af sektionerne i developer løsning anbefales da forlader sektioner for længe kan føre til overstaining. Denne plet er temmelig temperatur følsom, så sektioner har tendens til at udvikle hurtigere, når den omgivende temperatur er varm, og mere langsomt når temperaturen er køligere. Endelig kan man ønsker at Ryst forsigtigt dias i dias rack under trinnet føres i varmt vand for at lette fjernelsen af gelatine og resterende sølv indbetaling fra dias. Dog, overdreven og uforsigtig agitation af sektioner mens skylning dias med varmt vand kan forårsage sektioner til at glide ud dias og bør undgås. Det er også afgørende at sikre en ordentlig kontrol anvendes til densitometric målinger for at foretage kvantitative sammenligninger. Potentielt kunne man bruge en let plettet eller ikke-farvning regionen som en intern kontrol. I vores materiale bruger vi hvide substans som et kontrolelement til at normalisere ekstinktionen værdier i forskellige visuelle kortikale områder i hele udvikling. Vi finder, at hvide substans værdier er sammenlignelige på tværs af aldre og i den voksne17. Derfor, at hvide substans værdier ikke ændrer som funktion af alder, hvide substans fungerer som et gyldigt kontrolelement for densitometric analyse.

Den største fordel ved denne metode er, at det er en enkel og pålidelig histokemiske pletten hvis fordeling kan ligesom andre histokemiske markører, bruges til at skelne hjerneregioner. Men brugen af dette histokemiske metode kan ikke være egnet til at studere visse cellepopulationer, (dem mangler zink), eller i meget unge dyr som synaptic zink er i første omgang lavt ved fødslen, som vist i udvikle mus somatosensoriske og kat visuelle cortex5 ,20. En anden fordel ved denne protokol er at det kan bruges sammen med neuroanatomical tracer injektion eksperimenter. I vores laboratorium indsprøjtes vi typisk en tovejs neuronal tracer i den primære visuelle cortex af juvenile fritter at studere udviklingsmæssige ændringer i connectivity mønster blandt flere områder i den visuelle cortex. Derfor behøver dyr ikke udelukkende anvendes til zink histokemi hvis dyrene kunne udnyttes til en anden eksperimentel undersøgelse. Den største fordel ved den beskrevne metode er, at det kan være tilpasset til brug i andre arter og i andre områder af hjernen. Selv om vi har vist denne metode ved hjælp af ilder hjernevæv, kan der være subtile forskelle i nogle af skridt, når man studerer hjernevæv fra rotter, katte eller aber. Andre har med succes brugt denne zink histokemiske metode til at illustrere forskelle i farvning mønster i voksen abe visuelle cortex8, udvikle og voksen kat visuelle cortex5, udvikle rotte somatosensoriske cortex9 , 20, voksen mus somatosensoriske cortex6,21, og voksen Parma wallaby visuelle cortex7.

Her skitsere vi de grundlæggende trin i de protokol og understregningstegn vigtige parametre, der skal kontrolleres for at konsekvent opnå høj kvalitet zink farvning. Man måske ønsker at vurdere ændringer i synaptic zink niveauer i andre sensoriske eller motoriske cortex eller subkortikale strukturer i andre model dyr. De kvantitative oplysninger at densitometric enNALYSE giver i denne metode kan være fordelagtigt for efter kortikale udvikling over tid og eventuelt afslørende forskellige udviklingsmæssige profiler af synaptic zink niveauer blandt forskellige hjerneregioner (som vi har tidligere vist17). En vigtig overvejelse er den udviklingsmæssige spørgsmål og den tilsvarende alder af dyr til at studere. Synaptic zink histokemi afslører tydeligt identificerbare visuelle kortikale områder i fritter og kan tjene som en nyttig vejledning i yderligere undersøgelser af kortikale organisation og funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Center for Research ressourcer (2G12RR03060-26A1); National Institute on mindretal sundhed og sundhedsmæssige forskelle (8G12MD007603-27) fra de nationale kontorer i sundhed; Professionel personale kongres-City University of New York (PSC-CUNY); og Fakultet Research Grant (FRG II) American University i Sharjah. Vi takker Vidyasagar Sriramoju for at indføre os til disse metoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).

Tags

Neurobiologi spørgsmålet 128 Neuroanatomi hjernebarken striate cortex anatomiske markør farvning metode laminar variation
Brug af Synaptic zink histokemi at afsløre forskellige regioner og bladplader i udviklingslandene og voksen hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khalil, R., Levitt, J. B. Use of… More

Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter