Summary
Descrevemos um procedimento histochemical que revela a característico zinco laminar e areal, coloração de padrões em regiões diferentes do cérebro. O padrão de coloração de zinco pode ser usado em conjunto com outros marcadores anatômicos confiantemente distinguir camadas e regiões no cérebro adulto e em desenvolvimento.
Abstract
Caracterização da organização anatômica e funcional do cérebro e desenvolvimento requer a identificação precisa de circuitos neurais distintos e regiões no cérebro imaturo e adulto. Aqui descrevemos um procedimento coloração histoquímicos zinco que revela diferenças nos padrões de coloração entre diferentes camadas e regiões do cérebro. Outros têm utilizado este procedimento não só revelar a distribuição do zinco-contendo neurônios e circuitos no cérebro, mas também com sucesso delinear fronteiras areal e laminares no cérebro em desenvolvimento e adulto em diversas espécies. Aqui ilustramos este procedimento com imagens de desenvolver a coloração e cérebros adultos furão. Podemos revelar um padrão de zinco de coloração que serve como um marcador anatômico das áreas e camadas e pode ser usados confiantemente distinguir áreas corticais visuais no córtex visual adulto e em desenvolvimento. O objetivo principal do presente protocolo é apresentar um método histoquímico que permite a identificação exata das camadas e regiões no cérebro em desenvolvimento e adulto onde outros métodos não conseguem fazê-lo. Secundariamente, em conjunto com a análise de imagem densitométricos, este método permite avaliar a distribuição do zinco sináptica a revelar potenciais alterações ao longo do desenvolvimento. Este protocolo descreve detalhadamente os reagentes, ferramentas e etapas necessárias para manchar sucessivamente as seções do cérebro congelado. Embora este protocolo é descrito usando tecido cerebral de furão, facilmente pode ser adaptado para uso em roedores, gatos ou macacos, bem como em outras regiões do cérebro.
Introduction
Histológicas manchas tem sido tradicionalmente usadas para auxiliar na identificação de áreas corticais em várias espécies, revelando diferenças de características arquitetônicas. O uso combinado de técnicas histoquímicas como substância de Nissl, reatividade de citocromo oxidase (CO) ou mielina pode provar frutuoso, como revelam os limites areal semelhantes no cérebro adulto. No entanto, estas manchas histochemical não revelam sempre adequadamente limites claros entre áreas corticais e camadas no cérebro imaturo.
No sistema nervoso central, o zinco tem várias funções essenciais que incluem a estabilização da estrutura do DNA, agindo como um cofator de enzimas, participando em inúmeras funções reguladoras e agindo como um neuromodelador através da sua presença em vesículas sinápticas 1. zinco sináptico é único, como isso pode ser visualizado usando métodos histológicos, Considerando que o zinco ligados a proteína não pode ser visualizado2. Esta característica foi explorada para revelar o padrão de zinco sináptica em diferentes regiões corticais e histoquímica sináptica de zinco tem sido utilizada em um número de estudos. Um subconjunto de glutamatérgico neurônios no córtex cerebral contêm zinco nas vesículas pré-sináptica dentro seu axônio terminais3,4. Estudos histoquímicos revelaram uma distribuição heterogênea de zinco sináptica no córtex cerebral5,6,7. Parece haver uma distribuição diferente de areal e laminar de zinco histochemically reativa em diferentes regiões corticais (por exemplo, visual versus córtex somatossensorial), ou camadas (por exemplo, os níveis de zinco no supragranular e infragranular camadas do córtex visual primário são substancialmente superiores à camada de entrada de thalamocortical IV com níveis relativamente baixos de zinco sináptica)5,8,9. A heterogeneidade de zinco sináptico coloração observada no córtex é especialmente vantajosa como ele facilita a identificação de areal e laminar.
Aqui apresentamos uma descrição detalhada de um procedimento histochemical zinco sináptica, que é uma versão modificada do 1982 método10 do Danscher. Este método utiliza Selenito injectado intraperitonealmente (IP) em animais como um agente quelante. O selenite viaja para o cérebro para reagir com piscinas de zinco grátis encontradas em vesículas de um subconjunto de glutamatérgico sinapses no cérebro. Esta reação produz um precipitado que pode ser reforçado posteriormente pelo desenvolvimento prata2,10,11.
Esse procedimento revela padrões laminares e areal de zinco sináptico coloração; densitométricos análise pode ser utilizada para avaliar esses padrões, tanto qualitativa como quantitativamente no cérebro adulto e imaturo para estudar os efeitos de outras intervenções, tais como manipulações sensoriais, ambientais, farmacológicas ou genéticas. Além disso, um pode também querer avaliar possíveis alterações do desenvolvimento na distribuição de zinco sináptica em outras estruturas corticais ou subcorticais em outros sistemas de modelo. As informações quantitativas que análise densitométricos fornece neste método podem ser vantajosas para o desenvolvimento do cérebro seguir ao longo do tempo. Este protocolo fornece um companheiro para outros imuno - histoquímicos marcadores e para revelar os limites laminares e areal.
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Protocol
o seguinte protocolo segue as orientações de cuidados com animais estabelecidas pelo cuidados institucionais do Animal e uso Comité (IACUC) no The City College de Nova York, que estão em conformidade com todos os estado apropriado e diretrizes federais. Anestesia é apropriada para furões e deve ser modificada de acordo com a espécie estudada.
Figura 1: fluxograma descrevendo as principais etapas envolvidas nas 3 fases do presente protocolo e o tempo necessário para concluir cada etapa. Períodos exigindo seções secar completamente são mostrados em círculos de texto verde, enquanto todas as outras etapas são em círculos de texto em branco. A caixa de texto verde em forma de diamante é um ponto de decisão, enquanto o retângulo vermelho é uma etapa crítica e deve ser realizado com cuidado extra. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. etapas preparatórias (Slide Subbing e solução fazendo)
- unsubbed slides com um detergente de lavar com água quente e lave várias vezes em água quente, seguida de um enxaguamento de água destilada para remover completamente qualquer sujeira ou detritos. Permitir slides secar à temperatura ambiente ou em estufa a 37 ° C. Camada de
- , uma vez que os slides estão completamente secos, uma camada fina e até mesmo de ovos brancos em cada slide usando os dedos ou um pincel. Deixe-a secar na estufa a 60 ° C durante 20-30 min. Para obter melhores resultados e evitar seções deslizar fora, adicionar uma segunda camada de clara de ovo e deixe para secar mais uma vez na estufa a 60 ° C.
- Preparar uma solução de 1% de gelatina, dissolvendo-se 1 grama de gelatina em 100 mL de água quente (60 ° C) e deixe-a esfriar a temperatura ambiente.
- Preparar 200 mL de solução de desenvolvedor, como descrito abaixo para uso na seção 4.
- Solução de goma arábica Prepare adicionando lentamente 40 g em incrementos de 120 mL de água quente (dissolve-se mais facilmente desta forma). Continue a agitar a solução com um vidro agitando a haste. Uma vez que a solução se dissolva completamente, removê-lo do calor e deixe-a esfriar por alguns minutos e, em seguida, filtrar por 6 a 8 camadas de tecido de gaze em um funil.
- Citrato de preparar amortecedor adicionando 5,04 g ácido cítrico além de 4,7 g de citrato de sódio em 20 mL dH 2 O e dissolver a mistura. Certifique-se de que o pH desta solução é 4.0 em 25 ° C. ajustar o pH se necessário pela adição de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico à solução.
- Preparar a solução de hidroquinona aquecendo 30ml dH 2 O dissolver 1,7 g de hidroquinona.
Nota: A aquecer a solução de hidroquinona é essencial para permitir que se dissolvem facilmente na água, como a hidroquinona não é facilmente solúvel em água à temperatura ambiente. Tenha cuidado para manter a temperatura da água abaixo de 60 ° C, caso contrário a hidroquinona pode ser oxidada. Se a solução fica amarela, descartar e preparar outra solução fresca. - Prepare prata lactato solução dissolvendo-se 0,22 g em 30 mL de dH 2 O.
- Misturar as soluções (1.4.1 - 1.4.4) na ordem em que eles são descritos quando estiver pronto para executar as reações (ou seja, após o corte, secagem e fixação) ( Figura 2). Adicione a solução de lactato de prata no final. Certifique-se que essa etapa for concluída rapidamente e a solução do desenvolvedor é colocada no escuro até a hora de reagir as seções como lactato prateado é fotossensível.
Figura 2: diagrama esquemático ilustrando a sequência de etapas envolvidas na misturar os reagentes na fase de histoquímica de zinco do protocolo. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. tratamento do animal e anestesia
- antes de sedar o animal, preparar uma solução de 1% de sódio Selenito (at 2 SeO 3) dissolvendo-se 10 mg de Selenito de sódio em 1 mL dH 2 O.
- Anestesiar o animal com uma injeção intramuscular de cetamina (25 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg).
Nota: Certifique-se que um nível adequado de anestesia é alcançado usando a pedal reflexo resposta.
Solução de Selenito de sódio quelante (15 mg/kg) de zinco - Inject intraperitonealmente (IP).
Nota: A toxicidade de Selenito de sódio em idades diferentes ou em outras espécies pode variar. - Permitir que 60 a 90 min para o Selenito de sódio viajar para o cérebro. Durante este período, é imperativo assegurar que o animal está devidamente sedado e não responde, para verificar a profundidade da anestesia cada 5 min.
- Durante o período de selenito, enquanto o animal é anestesiado, certifique-se de que os olhos estão fechados para evitar o ressecamento, ou administrar pomada oftálmica para mantê-los húmida.
3. Preparação do tecido e coloração
- eutanásia do animal através da administração de uma overdose de pentobarbital de sódio (100 mg/kg, IP).
- Executar transcardial perfusão com solução salina normal por 1 min e com paraformaldeído 4% por 20 min. por último, administrar uma solução com 4% paraformaldeído e 10% de sacarose (um período de fixação total de 1h).
- Remover a cabeça usando um par de tesouras grandes.
- Fazer uma incisão usando um bisturi do nariz no pescoço para expor o crânio.
- Cuidadosamente remova o cérebro e separar os hemisférios com uma lâmina.
- Bloco a parte posterior do cérebro e sufixo em paraformaldeído 4% em tampão de fosfato 0,1 M (PB) por várias horas.
- Colocar os blocos em uma solução de sacarose de 30% em 0.1 M PB e permitir que o cérebro a afundar-se.
Nota: Substituir a solução de sacarose de paraformaldeído e 30% de 4% com solução de 30% de sacarose em 0.1 M PB para afundar o cérebro limita o cérebro ' exposição s de paraformaldeído como este pode afetar o tecido coloração qualidade.
Coletores de - uma vez no cérebro, corte semi tangencial 40 µm espessura seções através do córtex visual ou região de interesse em um micrótomo ou criostato congelação, deslizante. Isso pode ser feito colocando o bloco com a medial aplainando suavemente com uma lâmina de vidro e superfície baixo.
- Recolher seções com um pincel e armazenar em uma caixa de ferramentas, contendo tampão fosfato salino (PBS).
- Separar as seções em série numerada separada. Imediatamente montar uma ou duas séries de seções do cérebro sobre ovo subbed slides (secção 1), deixar secar durante a noite à temperatura ambiente e processar seções histochemically para zinco sináptica.
Nota: Outras séries podem ser tratados por outros marcadores para comparação, tais como a mielina 12 ou citocromo oxidase usando o protocolo modificado 13: incubar por 2-8 h a 40 ° C, com 3% de sacarose, citocromo C, de 0,015% 0,015% catalase e 0,02% diaminobenzidina em PB de 0,1 M. Substância de Nissl também pode ser usada como um marcador histológico para distinguir áreas corticais visuais. Estas outras manchas histológicas não exigem que as seções do cérebro são montadas em slides subbed-clara de ovo, assim os slides de gelatina tradicional revestido podem ser usados em vez disso.
4. Sináptica histoquímica de zinco
- corrigir as seções de slides montados em álcool absoluto por 15 min e deixe-a secar completamente em temperatura ambiente por 1 h. < lEu > brevemente mergulhe seções para 10 s em uma solução de 1% de gelatina (seção 1) e deixe-a secar durante a noite em temperatura ambiente.
- Misture as soluções conforme descrito na etapa 1.8, assim como seções estão prontas para ser reagiu.
- Reagir as seções organizar os slides lado a lado em um vidro ou bandeja plástica, e derramando a solução em desenvolvimento sobre as guias. Verifique se slides estão completamente submersos na solução e transferir a bandeja em um espaço escuro ou cobrem com uma caixa.
Nota: Uma bandeja plástica que é aproximadamente 12 polegadas long por 8 polegadas de largura pode ser usado, que se encaixa exatamente 18 slides. Um volume total de 200 mL de solução de desenvolvedor é suficiente para submergir completamente os slides, para garantir que o volume correto é usado para o número de slides para ser reagiu e ajustar de acordo com a receita. Uso de uma bandeja de plástico ou de vidro em vez de usar uma bandeja de metal é recomendável como há algum grau de cruz reatividade entre o lactato prateado na solução de desenvolvedor e o ferro ou outros metais encontrados em bandejas de metal.
- Reagir as seções organizar os slides lado a lado em um vidro ou bandeja plástica, e derramando a solução em desenvolvimento sobre as guias. Verifique se slides estão completamente submersos na solução e transferir a bandeja em um espaço escuro ou cobrem com uma caixa.
- Acompanhar a evolução da reação inspecionando visualmente as seções a cada 30 min. As seções geralmente exigem 120-180 min para desenvolvimento completo.
- Se seções tornam-se overstained (ver Figura 3a), diferenciar-se em 2% agricultor ' s solução (9 peças de tiossulfato de sódio 2% em dH 2 O e 1 parte 2% ferricianeto de potássio em dH 2 O) 1-2 min.
Nota: A seção da amostra que é mal corada é mostrada na Figura 3b. - Uma vez que a intensidade desejada é alcançada, encerrar a reação removendo o slide montadas seções da bandeja e colocando os slides em uma cremalheira de slide.
- Colocar as lâminas em um copo grande mancha prato e lavar as lâminas em morna (40-50 ° C) água corrente por 10 min remover o revestimento de gelatina e o depósito de prata exterior.
Nota: Tenha cuidado para não agitar o porta-lâminas para evitar seções de deslizar fora. A intensidade desejada da seção é alcançada quando suficiente variação laminar é evidente e seções são bastante escuro, mas não exagerei (ver figura 4a). - Permitem que os slides secar à temperatura ambiente e em seguida, desidrata-se em 100% EtOH (5 min), claro em xileno (5 min) e o deslizamento da tampa com um meio de montagem. Como alternativa, coloque os slides em uma série crescente de álcool, em seguida, desidrata-se, claro e lamela.
- Seções de uso de animais sem tratamento prévio de Selenito para servir como um controle negativo. Amplificação de prata dessas seções não deve produzir nenhuma mancha.
Nota: Para obter melhores resultados permitem seções para secar durante a noite. Permitindo que as seções para secar durante a noite rende melhor coloração do tecido.
Figura 3: zinco sináptico mancha no cérebro juvenil furão. Fotomicrografias de semi tangenciais seções manchadas de zinco que são um) overstained e b) understained no cérebro juvenil furão. Areal limites são difíceis de discernir como variação laminar é carente. Substância branca é também fortemente corada. Córtex de Ssy Suprasylvian, WM branco importa, um anterior, D dorsal. Barra de escala = 500 µm (a-b). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. distinção entre limites de Areal e aquisição de imagens
- uso arquitetônicas características de regiões diferentes do cérebro para identificação de areal e laminar.
Nota: por exemplo, no desenvolvimento rato retrosplenial cortex 14, os autores revelaram uma modularidade transitória caracterizada pela coloração pesado para o zinco, o que não está presente no adulto, mas poderia ser utilizado para descrever cortical organização durante o desenvolvimento nesta espécie. Em outro estudo 15, os autores revelaram especificidade na distribuição do zinco sináptica de núcleos diferentes encontrados na amígdala macaque macaco, que facilitam a identificação destas divisões. Áreas corticais visuais no cérebro em desenvolvimento e adultos furão tem sido descrito anteriormente 16 , 17 , 18, subdivisão arquitetônica do neocórtex em o esquilo-cinzento foram descritos 19. Além disso, zinco histoquímica foi anteriormente usada para distinguir entre áreas no macaco adulto córtex visual 8, desenvolvendo e adulto gato córtex visual 5, desenvolvendo o córtex somatossensorial rato 9 , 20 e rato adulto córtex somatossensorial 6 , 21. Se disponível, compare o padrão de coloração na mielina manchado, citocromo oxidase (CO) manchado e zinco sináptico manchado seções do cérebro, para confirmar os limites de areal no adulto. Nas seções semi tangenciais de furão córtex visual manchado para zinco sináptico, há importantes diferenças entre áreas corticais visuais que facilitam a identificação de areal. Por exemplo, áreas 17 e 18 do furão adulto revelam que zinco sináptico coloração é alta em camadas-III e V. camada VI manchas menos intensamente, enquanto camada IV quase carece de zinco. A evidente falta de coloração na camada IV ou contrastes de áreas 17 e 18, com a banda sombriamente manchada de zinco encontrado na camada que IV em CO manchado seções. No entanto, camada IV da área 17 em CO manchada seções mantém uma borda afiada com camadas III e V, mas camada IV na área 18 é caracterizada por uma sutil diminuição na intensidade de coloração e seu limite superior encontrado na camada III é menos distinguível. - Examinar seções usando microscopia brightfield com um objectivo de baixa potência (2x ou 4x) e fotografar as áreas de interesse.
- Realce de contraste e brilho de fotomicrografias usando software de processamento de imagem. Imagens obtidas por medições de densidade óptica não devem ser alteradas de alguma forma.
Figura 4: zinco sináptico mancha no cérebro adulto furão distingue diferentes áreas corticais visuais. Fotomicrografias de seções adjacentes de semi tangenciais manchado para (um) sináptica zinco ou (b) citocromo oxidase (CO) no adulto. Setas marcam limites areal. Ssy Suprasylvian córtex, um anterior, D dorsal. Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. densitometria (opcional)
Nota: Densitometric análise pode ser utilizada para avaliar a distribuição do zinco sináptica no cérebro através da medição da densidade óptica de zinco representante manchado seções nas regiões de interesse. Esse método também é útil para controlar possíveis alterações nos níveis de zinco sináptica durante todo o desenvolvimento.
- Usando selecionado seções manchadas de zinco, aleatoriamente escolher colunas corticais (colunares fotomicrografias) de largura adequada (uma coluna de largura 450 µm pode ser usada) adquiridas fotomicrografias da região de interesse. Uma coluna cortical é uma região que abrange todas as camadas corticais da superfície pial para a substância branca.
- Escolher um número adequado de colunas de amostra de várias seções do cérebro diferente em cada região de interesse.
- Transferência de imagens de amostra das colunas representativas em uma software de processamento de imagem.
- Usar a ferramenta de seleção retangular para abranger toda a coluna cortical.
- Usar a ferramenta invert para criar uma imagem de contraste invertido semelhante a um negativo fotográfico da coluna.
Nota: Inversão de contraste das imagens é feita para produzir valores de alta densidade óptica para os níveis de zinco sináptica alta e baixa densidade óptica para níveis baixos de zinco sináptica. Esta é uma maneira mais intuitiva para processar gráficos de perfil de enredo similares aos vistos na Figura 5. - Produzir perfis de densidade óptica por essas imagens usando a ferramenta de perfil de trama para gerar um gráfico bidimensional das intensidades pixel ao longo de uma linha.
- Use opções de plotagem para converter o gráfico de perfil de trama para um perfil vertical e clique na trama do perfil uma vez mais.
Nota: Representa a distância do eixo x ao longo da linha e o eixo y representa a intensidade do pixel. Portanto, cada valor de perfil gráfico reflete o valor de escala de cinza médio em cada profundidade em toda a largura da coluna. - Valores de perfil de trama aberta como arquivos de texto na planilha, normalizar e Plotar como gráficos (ver Figura 5).
Nota: É aconselhável usar a densidade relativa de zinco sináptica para comparação das medições quantitativas como os resultados podem ser confundidos pela variação na intensidade de coloração geral como resultado de diferentes tempos de reação, stainability do tecido, bem como outros variáveis. - Calcular a densidade relativa de zinco realizando uma média de vagão dos valores de perfil de trama para suavizar os dados.
Nota: Isso é realizado, em média, por exemplo, todos os pixels de 20 ou 30 sucessivas (1 pixel = 2,5 µm) em profundidade e então normalizando a intensidade máxima para cada amostra. Portanto, cada valor de perfil de gráfico média reflete o valor de escala de cinza médio a essa profundidade (escala de cinza valores variam de 0 a 255). Um método de normalização diferentes pode ser usado pelo primeiro adquirente matéria branca (WM) valores de densidade óptica de regiões da amostra incluem a substância branca subjacente nas áreas de interesse. Idealmente, escolha várias regiões que estão tão levemente coradas quanto possível para obter uma média de valor WM. Valores de densidade óptica média dividem-se em seguida por valores médios de WM para obter valores normalizado de WM. - Determinar quer dizer valores de densidade óptica em camadas específicas de regiões de interesse para comparações quantitativas.
Nota: por exemplo, o valor de densidade óptica mínima média na camada IV de áreas corticais visuais do furão são determinados pela abrangendo a região menos manchada por ± 5 pixels. - Calcular densidade óptica média valores nas camadas supragranular e infragranular de áreas corticais visuais de furão, inserindo a região mais escura manchada por ± 5 pixels para determinar o valor médio máximo.
- Certifique-se que significam valores de densidade óptica é obtidos dentro de camadas particulares.
Nota: É imperativo para verificar os limites dessas camadas nas imagens de contraste invertido, comparando-os com as fotomicrografias originais, bem como a seção de CO adjacente. Isto garante que um não intrometer-se em camadas adjacentes.
Figura 5: distribuição Laminar de zinco sináptica em diferente visual cortical áreas no furão adulto. Fotomicrografias representativas das colunas através de todas as camadas corticais com perfis de densidade óptica normalizado correspondente em um adulto. Densidade baixa de zinco sináptica na camada IV de adultas áreas 17 e 18 é indicada pela calha na trama do perfil. Em cada perfil do enredo ovais preenchidas na bandeja da camada IV indicam os valores usados para determinar o valor de intensidade média mínima de pixel. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
As principais etapas envolvidas neste protocolo para manchar as seções do cérebro para zinco sináptica são apresentadas em um fluxograma na Figura 1. O protocolo pode ser dividido em três fases: 1) perfusão e coleção de tecido, preparação 2) tecido de coloração e histoquímica de zinco 3). Resumidamente, durante a primeira fase do protocolo, o animal é anestesiado e injetados IP com a dose adequada de Selenito de sódio. Após um período de tempo suficiente (idealmente 60-90 min), o animal é posteriormente eutanásia, perfundidos com solução de NaCl 0,9%, seguida por uma solução de paraformaldeído 4%. A cabeça é decapitada e o cérebro é rapidamente retirado do crânio. O cérebro então é permitido penetrar um paraformaldeído 4% mais 30% de solução de sacarose como crioprotetor. Na segunda fase do protocolo, seções congeladas são cortadas em um micrótomo deslizante em 40 µm em tampão fosfato salino (PBS) e separadas em série numerada. É importante montar seções em slides subbed ovo imediatamente após o corte, deixando as seções para secar durante a noite para obter melhores resultados. Gelatina subbed slides não são recomendados, como o sulfato de potássio de cromo normalmente usado na solução subbing cross-reacts com o lactato prateado, conduzindo assim a coloração de qualidade inferior. Seções são depois incubadas durante 15 min em álcool absoluto e deixadas para secar à temperatura ambiente. Este passo é seguido por uma breve submersão das seções montadas em 1% solução de gelatina preparada antes do tempo e deixa-se secar durante a noite para obter melhores resultados. Na última fase do protocolo (histoquímica de zinco), a solução do desenvolvedor é preparada de acordo com as etapas descritas na seção de métodos, e slides são colocados em uma bandeja de plástico ou de vidro submergida na solução. O desenvolvimento da mancha geralmente leva em qualquer lugar entre 2-3 h, mas uma inspeção visual rigorosa é necessária para evitar a overstaining as seções. Quando é alcançada a intensidade adequada, slides devem ser removidos, colocados em uma cremalheira de slide e lavadas em água morna por 5-10 min remover o depósito de prata exterior. As seções em seguida podem ser secadas em temperatura ambiente, limpo e coverslipped. Um esquema das etapas específicas necessárias para completar a fase de histoquímica de zinco do protocolo é mostrado na Figura 2.
Este protocolo usa histoquímica de zinco sináptica para revelar o areal e laminar variação nos níveis de coloração entre áreas corticais visuais no cérebro furão. Este protocolo pode ser adaptado para uso em outras espécies, bem como em outras regiões do cérebro. Por exemplo, pesquisadores estudando outros córtices sensoriais tais como o córtex somatossensorial, auditivo ou frontal do furão ou qualquer outro sistema de modelo iria beneficiar muito de usar essa mancha histochemical. A principal vantagem desta técnica é que ele fornece transições claras entre as áreas para facilitar a identificação de areal em adultos bem como diferenciar confiavelmente áreas corticais em animais jovens como roedores, doninhas, gatos e macacos.
A figura 3a mostra um exemplo de um zinco seção manchada que desenvolvemos inadvertidamente por muito tempo e, portanto, foi overstained no processo. Tecido overstained é caracterizado por uma cor marrom muito escura, uma falta de variação laminar e fortemente manchada matéria branca. No entanto, as seções manchadas de zinco do cérebro às vezes podem ser understained como mostrado na Figura 3b. Seções understained às vezes podem ocorrer se o animal não sobreviveu para uma quantidade suficiente de tempo (pelo menos 60 min), o que impede todo o selenite injetado de viajar para o cérebro. Understaining de tecido também pode ocorrer se o selenite não foi administrado corretamente e, portanto, não viajou para o cérebro.
A distribuição heterogênea de zinco sináptica coloração em múltiplas áreas corticais visuais em um adulto furão é mostrada em uma seção de semi tangencial representante na figura 4a. As setas apontam para os limites de areal. Em áreas 17 e 18, a intensidade de coloração do zinco sináptica é geralmente alta em camadas I, II, III e V e baixo na camada IV (camada de thalamorecipient) e moderada na camada VI. A presença de uma transição claramente identificável entre áreas 17 e 18 é evidente na figura 4a. Camada IV intensidade de coloração na área 18 aumenta ligeiramente e a camada V diminui de intensidade variável. Figura 4b é uma seção adjacente manchada para citocromo oxidase (CO) que ilustra locais semelhantes de areal limites àqueles que observamos com a mancha de zinco. Regiões de áreas 17 e 18 que têm altos níveis de zinco geralmente parecem ter níveis baixos de CO de coloração.
A distribuição do zinco sináptica em áreas 19 e 21 é qualitativamente semelhante em que ambas as áreas têm menos laminar variação do que em áreas 17 e 18. Camada IV das áreas 19 e 21 é claramente diferente da camada IV em áreas 17 e 18 que moderadamente está manchado. As camadas supragranular e infragranular da área 19 são de intensidade semelhante, mas a camada V manchas ligeiramente mais escura. Área 21 tem uma distribuição de zinco sináptica comparável àquela área 19. No entanto, camada VI da área 21 é caracterizada por níveis de zinco sináptica maiores do que a camada IV de área 19. Camadas VI e IV de Suprasylvian (Ssy) parecem ser moderadamente manchada e são de intensidade comparável, enquanto camada V é caracterizada por níveis mais elevados de zinco sináptica e as camadas de supragranular são marcadas por um padrão de flutuação dos níveis de zinco sináptica.
Avaliação quantitativa da distribuição de zinco sináptica em regiões cerebrais diferentes, com diferentes tratamentos, ou em diferentes idades, pode ser realizada, se assim o desejar. Por exemplo, um pode querer avaliar mudanças na distribuição de zinco sináptica em adultos, ou durante todo o desenvolvimento no primário visual, auditivo e córtices somatossensorial em qualquer sistema de modelo. Usando a análise densitométricos, anteriormente mostramos que a distribuição do zinco sináptica em múltiplas áreas visuais (17, 18, 19, 21 e Suprasylvian) do cérebro em desenvolvimento furão, diminuir significativamente de cinco a seis semanas de idade17. Aqui descrevemos as etapas necessárias para avaliar as diferenças na distribuição de zinco sináptica em amostras representativas tomadas de um furão adulto para ilustrar o processo. Estas etapas podem ser seguidas para controlar as alterações na distribuição de zinco sináptica no córtex visual furão juvenil, bem como em outras regiões qualquer espécie ou cérebro. A Figura 5 mostra fotomicrografias colunares representativas das seções do cérebro de um adulto transformadas para histoquímica de zinco, juntamente com os seus perfis de parcela complementar de densidade óptica normalizadas. Normalizado de parcelas de valores de densidade óptica foram geradas para refletir as alterações de acordo com a profundidade cortical. Assim, cada valor de perfil gráfico reflete o valor de escala de cinza médio em profundidades corticais consecutivos. Por exemplo, áreas 17 e 18 são caracterizadas por um declínio perceptível em zinco coloração na camada IV (representado pelo cocho), que é evidente a partir de seus perfis de enredo. Quer dizer valores mínimos de densidade óptica em áreas 17 e 18 são indicadas pelas ovais pretas preenchidos. O zinco baixo coloração observada na camada IV de contrastes áreas 17 e 18, com o único um mergulho sutil em zinco níveis nas áreas, 19, 21 e Ssy. Coletivamente, áreas 19, 21 e Ssy são qualitativamente diferentes do que áreas 17 e 18 níveis de zinco ao longo de todas as camadas é mais homogêneo do que em áreas 17 e 18. Além disso, a camada V das áreas 17 e 18 e supragranular camadas normalmente mancham mais intensamente do que VI de camada.
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Discussion
O estudo atual emprega uma técnica histochemical baseada em uma versão modificada do Danscher método (1982)10, pelo qual localização de zinco sináptica pode ser detectada e visualizada no cérebro. Esse método funciona, essencialmente, injetando o animal com o Selenito de sódio quelante de zinco (ND2SeO3) (15 mg/kg). Após a injeção, o selenite viaja para o cérebro e vincula a zinco grátis que está localizado a vesículas pré-sináptica de zinco que contém neurônios. Íons de zinco ligado a moléculas dentro de vesículas sinápticas precipitado e podem ser visualizadas posteriormente através do desenvolvimento físico2,11. Prata de sulfureto do Timm original método de coloração foi destinada a detectar e visualizar um número de metais pesados tais como Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni e Zn em tecidos biológicos22. O agente quelante usado para este método é o sulfureto de sódio. Portanto, um grande problema com o uso de método de sulfureto do Timm é a falta de especificidade como qualquer metal que pode ser transformado em um sulfureto de metal poderia certamente ser amplificada pelo desenvolvimento físico de prata. No entanto, a versão modificada do método Danscher que é usado no estudo atual é específica para zinco e não outros metais pesados. Existem várias diferenças entre o método de 1982 do Danscher e o presente método que descrevemos neste estudo. Método do Danscher usa o tecido cerebral não fixada fresco enquanto usamos tecido congelado. Danscher também usa glutaraldeído para a perfusão, enquanto nós usamos paraformaldeído como este é mais compatível com imuno-histoquímica e outros marcadores histológicos que nós rotineiramente manchar para nosso laboratório. Danscher também usa procedimentos poststaining como toluidina azul (1%), que não realizamos em nosso método.
Uma limitação da técnica presente é a imprevisibilidade associada com tolerância de Selenito de sódio por animais. Nós achamos que depois de administrar o Selenito de sódio, às vezes os animais não sobrevivem mais de 30 minutos. Esta situação coloca um problema que não permite o tempo suficiente para o selenite que viajam para o cérebro, e subsequente desenvolvimento de seções do cérebro geralmente resulta em tecido irregular mancha. Outra limitação potencial está relacionada com a boa administração da injeção intraperitoneal de Selenito de sódio. Um deve puxar a pele acima da cavidade abdominal inferior e insira o lado do bisel de agulha para cima em um ângulo de 15 a 20 graus, penetrando apenas a parede abdominal. A agulha deve ser puxada para trás ligeiramente para garantir que os órgãos abdominais não tem sido penetrados e material não tem sido aspirado. A agulha deve ser descartada e substituída se isso ocorrer.
Para garantir a reprodutibilidade e coloração resultados de alta qualidade, recomendamos as seguintes medidas de precaução. Uma gestão eficaz do Selenito de sódio para o tempo de sobrevivência animal e maximização do animal (60 a 90 min é o ideal) antes de eutanásia, são críticos para garantir tempo suficiente é dado para o selenite que viajam para o cérebro. Encontramos esse períodos mais curtos de sobrevivência (30 minutos ou menos) normalmente levam a coloração do tecido irregular. Da mesma forma, seções de montagem para ovo subbed slides imediatamente após o bloco de corte é um passo crítico. Embora recentemente cortada seções congeladas em PBS para um número de dias é recomendável contra como íons zinco lixiviará para fora na solução. Durante a preparação da solução de desenvolvedor, é fundamental para garantir que o tampão citrato é do pH correto (4.0) como esta reação é bastante sensível a pequenas mudanças no pH. Da mesma forma, quando a solução de hidroquinona de aquecimento é imperativo para manter a temperatura abaixo de 60 ° C, como ainda mais aquecimento irá oxidar a solução e inibir a mancha. Da mesma forma, submergir brevemente as seções de slides montados em gelatina é fundamental como previne a deposição de específico de prata na superfície da seção. No entanto, as seções não devem ser deixadas na solução de gelatina mais de 10 s como isso fará com que murchar levando a coloração do tecido irregular. Inspeção visual periódica das seções enquanto solução de desenvolvedor é aconselhável desde que deixou as seções por muito tempo podem levar a overstaining. Esta mancha é bastante sensível, temperatura por seções tendem a desenvolver mais rapidamente quando a temperatura ambiente é quente e mais lentamente quando a temperatura é mais legal. Por último, um pode querer agitar suavemente os slides no rack slide durante a etapa de lavagem em água morna para facilitar a remoção da gelatina e depósito prateado residual das lâminas de. No entanto, agitação excessiva e descuidada das seções enquanto enxaguar slides com água morna pode causar seções para deslizar fora os slides e devem ser evitados. Também é fundamental para garantir que um controle apropriado é usado para medições densitométricos para fazer comparações quantitativas. Um potencialmente poderia usar uma região levemente manchada ou não mancha como um controle interno. Em nosso material, nós usamos a matéria branca como um controle para normalizar os valores de densidade óptica em diferentes áreas corticais visuais durante todo o desenvolvimento. Achamos que a matéria branca valores são comparáveis através de diferentes idades e o adulto17. Portanto, dado que a matéria branca valores não mudam em função da idade, matéria branca serve como um controle válido para análise densitométricos.
A principal vantagem deste método é que é uma mancha histochemical simples e confiável, cuja distribuição pode ser usada, como outros marcadores histoquímicos, distinguir regiões do cérebro. No entanto, o uso desse método histoquímico pode não ser adequado para estudar a determinadas populações de célula (aqueles que faltam o zinco), ou em animais muito jovens como zinco sináptico níveis são inicialmente Baixos no nascimento, como mostrado no desenvolvimento de rato somatossensorial e córtex visual gato5 ,20. Outra vantagem deste protocolo é que ele pode ser usado em conjunto com os experimentos de injeção do traçador neuroanatômica. Em nosso laboratório, normalmente nós injetamos um marcador neuronal bidirecional para o córtex visual primário de furões juvenis para o estudo do desenvolvimento alterações no padrão de conectividade entre várias áreas do córtex visual. Portanto, animais precisam não ser unicamente usados para histoquímica de zinco se os animais podem ser explorados por um estudo experimental diferente. A vantagem principal do método descrito é que pode ser adaptado para uso em outras espécies e em outras regiões do cérebro. Embora nós demonstramos esse método usando o tecido cerebral de furão, pode haver diferenças sutis em alguns dos passos quando estudando o tecido do cérebro de macacos, gatos ou roedores. Outros usaram com sucesso este método histoquímico de zinco para ilustrar as diferenças de coloração, o padrão no macaco adulto córtex visual8, desenvolvendo e adulto gato córtex visual5, desenvolvendo rato córtex somatossensorial9 , 20, rato adulto córtex somatossensorial6,21e adulto Parma wallaby córtex visual7.
Aqui descrevem as etapas básicas do protocolo e sublinhado parâmetros importantes que devem ser controladas para atingir consistentemente coloração de zinco de alta qualidade. Um pode querer avaliar alterações nos níveis de zinco sináptica em outros córtices sensoriais ou motoras ou estruturas subcorticais em outros animais modelo. As informações quantitativas que densitométricos umnálise fornece neste método pode ser vantajoso para seguir o desenvolvimento cortical ao longo do tempo e possivelmente revelando diferentes perfis do desenvolvimento dos níveis de zinco sináptica entre regiões diferentes do cérebro (como mostramos anteriormente17). Uma consideração importante é a questão do desenvolvimento e da idade correspondente dos animais para estudar. Sináptica zinco histoquímica revela claramente identificáveis áreas corticais visuais em furões e pode servir como um guia útil em estudos de organização cortical e função.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações do centro nacional para recursos de pesquisa (2G12RR03060-26A1); O Instituto Nacional sobre saúde de minoria e disparidades de saúde (8G12MD007603-27) dos institutos nacionais de saúde; Profissional pessoal Congresso-City University de Nova York (CUNY-PSC); e faculdade Research Grant (FRG II) Universidade Americana de Sharjah. Agradecemos Vidyasagar Sriramoju por nos apresentar para esses métodos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
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