יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום”בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.
השימוש של רפואה אישית לטיפול במחלות monogenic נדירים כמו הפרעות באנזימים (LSDs) קוראים תיגר על ידי מורכבים עיצובים הניסיון הקליני, עלויות גבוהות ומספרים המטופל נמוך מאות אללים mutant הם מעורבים ברוב LSDs. המחלות מסווגים בדרך כלל 2-3 סוגים קליניים שונים בהתאם לחומרת. יתר על כן, אפיון מולקולרי גנוטיפ יכול לעזור לחזות את התוצאות הקליניות ולהודיע בחולה. לכן, פיתחנו assay התרבות של תאים פשוטים המבוסס על תאים HEK293H heterologously ביטוי יתר של מוטציות. שזוהו מחלת פברי, פומפה. לאחרונה כבר הציג assay דומה כמבחן פרה כדי לזהות מוטציות קלה עבור טיפול המלווה תרופתי (PCT) מחלת פברי. כתב יד זה מתאר assay תרבות של התא המתוקן אשר מאפשר הערכה פנוטיפי מהירה של גרסאות allelic מחלת פברי, פומפה לזהות חולים זכאי עבור PCT, עשויים לסייע בפיתוח של pharmacochaperones רומן.
ישנם מעל תריסר באנזימים הפרעות (LSDs) הקשורים בתפקוד glycosidase בעקבות מוטציות העיקרי. פברי (OMIM #301500), מחלת הפומפה (OMIM #232300), יותר מ 500 ו 200 מוטציות missense1,2,3 דווחו, בהתאמה, אשר תואמת כ- 60% של הרוזן מוטציה הכולל. אינספור גרסאות חדשות של ג’ין עדיין להיות מזוהים, שרבים מהם יש נודע משמעות. מחקרים מקיפים הביוכימי חשף כי מסוימים אחרים ואינן להוביל להשלים אובדן-של-פונקציה של הגן GLA (OMIM * 300644) במחלת פברי, אבל לגרום האנזים המתאימים להיכשל להגיע למצב מתקפלים למה המועדף4 . התוצאה שמירה ER והשפלה מוקדמת של האנזים תפקודית אחרת. מסקנות דומות נמשכו ב אחרים LSDs כולל מחלת פומפה5. יתר על כן, אפיון מולקולרי של גרסאות יכול להקל על פרשנות קליני של מוטציות בזמנו של אבחון6, רומז התקדמות LSD הוא תהליך אישי המבוסס על טיב המוטציה. לכן, הסיווג המקובלת בדרך כלל 2-3 סוגים שונים קליני צריך להיות מחדש על מנת לייעל קליניים ייעוץ והחלטות טיפוליות.
טיפול בתחליפי האנזים (ERT) זמין עבור שתי המחלות. ERT, עם זאת, מוגבל יעילות המושפעת רקמות איברים כגון המוח ואת שרירי השלד. יתר על כן, ERT יכול להפיק תשובה immunogenic זה מסכנת את היתרונות הטיפוליים. מלווים תרופתי (אישיים) הם חלופה אטרקטיבית הטיפול בחולים עם מוטציות מגיבים כביכול. מחשבים משמשים לפיגום מולקולרית עבור קיפול חלבונים נכונה וייצוב המונע בתורו (ER) רשתית תוך-פלזמית השמירה והשפלה הקשורים במיון של האנזים. יתר על כן, מחשבים שניתן אוראלית, שעשוי להיות מסוגלים לחצות את מחסום הדם מוח. לכן, ייתכן PCT אפשרות מעשית יותר לטיפול בחולים עם מסוימים אחרים. עבור סקירה מקיפה על יישום מחשב ב- LSDs, להפנות הסקירה מצוינת על-ידי Parenti7.
הגילוי של מחלה הגורמת אללים mutant מאות אתגרים בדיקות סמים ניסויים פרה-קליניים, מחייבת הערכה פשוטה, מהירה, מתוקננת מאוד מהחולים קלה לגישה רפואה אישית. כדי להעריך את השפעות מזיקות של LSD מוטציות גנטיות, לבחון את המועמד מוטציות לחזות חולים קלה עבור PCT, הייתה מערכת סטנדרטית מאוד ביטוי יתר בתאים HEK293H המאפשרת למדידה פעילות האנזים מהירה ואמינה פיתח. ביטוי יתר מערכות דומות שתוארו קודם לכן עבור מחלת פברי, פומפה באמצעות COS-78,9,10,11, הלה תאים12, או HEK29313 ,14,15,16 תאים עבור הגן glycosidase.
שיטה דומה מאוד אפילו פטנט כשיטה”לחזות את התגובה לטיפול תרופתי מלווה במחלות”17 המציין את הרלוונטיות של תא תרבות בעלת יכולת להיות משולב לתוך הקלינית.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק תוצאות חזקים להערכת הנזק האנזים במחלות lysosomal תורשתי של חילוף החומרים. כתב יד זה הוא שתיקון בפרוטוקול שפורסם מוקדם יותר15. השינויים המכריעים לערב לכתחילה (קרי, בתהליך הכנת הבונה וקטור מוטציה), סטנדרטיזציה של פרוטוקול התרבות התא (קרי, תחזו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להכיר Loebert מנדי, טינה Czajka לתמיכה טכנית מצוינת. אנו מודים פלורה לואו (הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ’וסטס, ארה ב) על שפת עריכה עזרה.
Material | |||
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
Abbreviations | |||
frw = forward; rev = reverse | |||
n.a. = not applicable |