In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe
Summary
Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von “Orphan” Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.
Abstract
Die Nutzung der personalisierten Medizin zur Behandlung von seltener monogenen Krankheiten wie Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) wird durch komplexe klinische Versuch-Designs, hohe Kosten und geringen Patientenzahlen herausgefordert. Hunderte von mutierten Allelen sind in den meisten der LSDs verwickelt. Die Krankheiten sind in der Regel in 2 bis 3 verschiedene klinische Typen nach Schweregrad eingestuft. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung des Genotyps helfen, vorherzusagen, klinische Ergebnisse und Patientenversorgung zu informieren. Daher haben wir einen einfache Zelle Kultur Assay basierend auf HEK293H Zellen heterologously Ausdruck über die Mutationen identifiziert Fabry und Pompe-Krankheit entwickelt. Eine ähnliche Test wurde vor kurzem als präklinischen Prüfung zugänglich Mutationen für pharmakologische Chaperon Therapy (PCT) im Fabry-Krankheit zu identifizieren eingeführt. Dieses Manuskript beschreibt eine geänderte Zelle-Kultur-Probe, die ermöglicht schnelle phänotypische Beurteilung der allelischen Varianten Fabry und Pompe-Krankheit, geeignete Patienten für PCT zu identifizieren und möglicherweise Hilfe bei der Entwicklung von neuartigen Pharmacochaperones.
Introduction
Es gibt über ein Dutzend Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) im Zusammenhang mit Glucosidase Dysfunktion durch primäre Genmutationen. Fabry (OMIM #301500) und Morbus Pompe (OMIM #232300), mehr als 500 und 200 Missense-Mutationen,1,2,3 gemeldet wurden, beziehungsweise, was etwa 60 % des gesamten Mutation Grafen entspricht. Sind noch zahlreiche neue Genvarianten identifiziert, von denen viele haben unbekannte Bedeutung. Umfangreiche biochemische Untersuchungen ergeben, dass bestimmte Genotypen nicht zu einer vollständigen Verlustfunktion des GLA -Gens führen (OMIM * 300644) in Fabry-Krankheit, aber dazu führen, dass das entsprechende Enzym zum Scheitern verurteilt, einen thermodynamisch favorisierten klappbaren Zustand4 erreichen . Dadurch wird ER Retention und vorzeitigen Abbau des ansonsten funktional Enzyms. Ähnliche Schlussfolgerungen wurden in anderen LSDs einschließlich Pompe-Krankheit5gezogen. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung Enzymvarianten erleichtern klinische Interpretation der Mutationen zum Zeitpunkt der Diagnose6, was darauf hindeutet, dass LSD Progression ein individueller Prozess ist, basierend auf der Art der Mutation. Die herkömmliche Einteilung in verschiedene klinische Typen in der Regel 2 bis 3 sollte daher überprüft werden, um klinische Beratung und therapeutische Entscheidungen zu straffen.
Enzym-Ersatz-Therapie (ERT) ist für beide Krankheiten verfügbar. ERT, hat jedoch nur begrenzte Wirksamkeit im betroffenen Gewebe/Organe wie das Gehirn und Skelettmuskulatur. Darüber hinaus kann ERT eine immunogen Reaktion auslösen, die die therapeutischen Vorteile gefährdet. Pharmakologische Chaperonen (PCs) sind eine attraktive Behandlungsalternative für Patienten mit so genannten reagieren Mutationen. PCs dienen als molekulare Gerüst für korrekte Proteinfaltung und Stabilisierung, die wiederum endoplasmatische Retikulum (ER) Aufbewahrung und ER verbundenen Abbau des Enzyms verhindert. Darüber hinaus PCs können oral verabreicht werden und sind möglicherweise in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke. Daher möglicherweise PCT eine praktikable Option für die Behandlung von Patienten mit bestimmten Genotypen. Für eine umfassende Überprüfung auf PC-Anwendung in LSDs beziehen sich auf die ausgezeichnete Bewertung von Parenti7.
Die Entdeckung von Hunderten von krankmachenden mutierten Allele fordert prä-klinischen Drogentests und erfordert eine einfache, schnelle und hoch standardisierte Bewertung zugänglich Patienten für eine personalisierte Medizin-Ansatz. Bei der Beurteilung der schädlichen Auswirkungen von LSD-Gen-Mutationen und Kandidat Mutationen zu zugänglich Patienten für PCT Vorhersagen zu testen, war ein hoch standardisierten Überexpression System in HEK293H Zellen, die für schnelle und zuverlässige Enzym Aktivitätsmessung ermöglicht entwickelt. Ähnliche Überexpression Systeme für Fabry und Pompe-Krankheit mit COS-78,9,10,11, HeLa Zellen12oder HEK293 beschriebenen13 ,14,15,16 Zellen für die gen-Glucosidase.
Eine sehr ähnliche Methode wurde sogar als “Methode zur Reaktion auf die pharmakologische Chaperon Behandlung von Krankheiten Vorhersagen” patentiert17 zeigt die Relevanz einer Zelle Kultur System integrierbar in die klinische Praxis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hierin beschriebene Protokoll liefert robuste Ergebnisse für Enzym Schadensfeststellung in erbliche lysosomale Krankheiten des Stoffwechsels. Diese Handschrift ist eine Änderung des Protokolls früheren15veröffentlicht. Die wichtigsten Änderungen betreffen Stringenz (d. h., in den Prozess der mutierten Vektor Konstrukt Vorbereitung), Standardisierung von der Zelle Kultur Protokoll (d.h., HEK293H Zelle Wartungs- und Transfektion Bedingungen) und die hohe Anzahl der experim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Mandy Loebert und Tina Czajka für hervorragende technische Unterstützung zu bestätigen. Wir danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) für Sprache bearbeiten.
Materials
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
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