Summary

In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

Published: December 20, 2017
doi:

Summary

Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von “Orphan” Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

Abstract

Die Nutzung der personalisierten Medizin zur Behandlung von seltener monogenen Krankheiten wie Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) wird durch komplexe klinische Versuch-Designs, hohe Kosten und geringen Patientenzahlen herausgefordert. Hunderte von mutierten Allelen sind in den meisten der LSDs verwickelt. Die Krankheiten sind in der Regel in 2 bis 3 verschiedene klinische Typen nach Schweregrad eingestuft. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung des Genotyps helfen, vorherzusagen, klinische Ergebnisse und Patientenversorgung zu informieren. Daher haben wir einen einfache Zelle Kultur Assay basierend auf HEK293H Zellen heterologously Ausdruck über die Mutationen identifiziert Fabry und Pompe-Krankheit entwickelt. Eine ähnliche Test wurde vor kurzem als präklinischen Prüfung zugänglich Mutationen für pharmakologische Chaperon Therapy (PCT) im Fabry-Krankheit zu identifizieren eingeführt. Dieses Manuskript beschreibt eine geänderte Zelle-Kultur-Probe, die ermöglicht schnelle phänotypische Beurteilung der allelischen Varianten Fabry und Pompe-Krankheit, geeignete Patienten für PCT zu identifizieren und möglicherweise Hilfe bei der Entwicklung von neuartigen Pharmacochaperones.

Introduction

Es gibt über ein Dutzend Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) im Zusammenhang mit Glucosidase Dysfunktion durch primäre Genmutationen. Fabry (OMIM #301500) und Morbus Pompe (OMIM #232300), mehr als 500 und 200 Missense-Mutationen,1,2,3 gemeldet wurden, beziehungsweise, was etwa 60 % des gesamten Mutation Grafen entspricht. Sind noch zahlreiche neue Genvarianten identifiziert, von denen viele haben unbekannte Bedeutung. Umfangreiche biochemische Untersuchungen ergeben, dass bestimmte Genotypen nicht zu einer vollständigen Verlustfunktion des GLA -Gens führen (OMIM * 300644) in Fabry-Krankheit, aber dazu führen, dass das entsprechende Enzym zum Scheitern verurteilt, einen thermodynamisch favorisierten klappbaren Zustand4 erreichen . Dadurch wird ER Retention und vorzeitigen Abbau des ansonsten funktional Enzyms. Ähnliche Schlussfolgerungen wurden in anderen LSDs einschließlich Pompe-Krankheit5gezogen. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung Enzymvarianten erleichtern klinische Interpretation der Mutationen zum Zeitpunkt der Diagnose6, was darauf hindeutet, dass LSD Progression ein individueller Prozess ist, basierend auf der Art der Mutation. Die herkömmliche Einteilung in verschiedene klinische Typen in der Regel 2 bis 3 sollte daher überprüft werden, um klinische Beratung und therapeutische Entscheidungen zu straffen.

Enzym-Ersatz-Therapie (ERT) ist für beide Krankheiten verfügbar. ERT, hat jedoch nur begrenzte Wirksamkeit im betroffenen Gewebe/Organe wie das Gehirn und Skelettmuskulatur. Darüber hinaus kann ERT eine immunogen Reaktion auslösen, die die therapeutischen Vorteile gefährdet. Pharmakologische Chaperonen (PCs) sind eine attraktive Behandlungsalternative für Patienten mit so genannten reagieren Mutationen. PCs dienen als molekulare Gerüst für korrekte Proteinfaltung und Stabilisierung, die wiederum endoplasmatische Retikulum (ER) Aufbewahrung und ER verbundenen Abbau des Enzyms verhindert. Darüber hinaus PCs können oral verabreicht werden und sind möglicherweise in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke. Daher möglicherweise PCT eine praktikable Option für die Behandlung von Patienten mit bestimmten Genotypen. Für eine umfassende Überprüfung auf PC-Anwendung in LSDs beziehen sich auf die ausgezeichnete Bewertung von Parenti7.

Die Entdeckung von Hunderten von krankmachenden mutierten Allele fordert prä-klinischen Drogentests und erfordert eine einfache, schnelle und hoch standardisierte Bewertung zugänglich Patienten für eine personalisierte Medizin-Ansatz. Bei der Beurteilung der schädlichen Auswirkungen von LSD-Gen-Mutationen und Kandidat Mutationen zu zugänglich Patienten für PCT Vorhersagen zu testen, war ein hoch standardisierten Überexpression System in HEK293H Zellen, die für schnelle und zuverlässige Enzym Aktivitätsmessung ermöglicht entwickelt. Ähnliche Überexpression Systeme für Fabry und Pompe-Krankheit mit COS-78,9,10,11, HeLa Zellen12oder HEK293 beschriebenen13 ,14,15,16 Zellen für die gen-Glucosidase.

Eine sehr ähnliche Methode wurde sogar als “Methode zur Reaktion auf die pharmakologische Chaperon Behandlung von Krankheiten Vorhersagen” patentiert17 zeigt die Relevanz einer Zelle Kultur System integrierbar in die klinische Praxis.

Protocol

1. Vorbereitung der Mutant pcDNA3.1/GLA und pcDNA3.1/GAA Konstrukte Hinweis: Die Klonen Strategien für die GLA und GAA Codierung Sequenzen (Cds) wurden berichtet früher15,18. Site-verwiesene Mutagenese mit Site-verwiesene Mutagenese Verwendung der Verweis Sequenzen NM_000169.2 und NM_000152.4 als Vorlagen für die Mutagenese GLA und GAA Gene. Haben Sie eine …

Representative Results

Die Mutagenese-VerfahrenZur Bewertung der Effizienz der GLA -gen Mutagenese wurden Mutationen in einer der folgenden Kategorien eingestuft. Dieser Ansatz um Mutationen zu erzeugen ergab, dass etwa 66,5 % der GLA Mutationen im ersten Versuch erhalten wurden. Weitere 25 % konnte nach einem leicht modifizierten zweiten PCR abgerufen werden. Kategorie 1: Die Mutagenese PCR wirksam war beim erst…

Discussion

Die hierin beschriebene Protokoll liefert robuste Ergebnisse für Enzym Schadensfeststellung in erbliche lysosomale Krankheiten des Stoffwechsels. Diese Handschrift ist eine Änderung des Protokolls früheren15veröffentlicht. Die wichtigsten Änderungen betreffen Stringenz (d. h., in den Prozess der mutierten Vektor Konstrukt Vorbereitung), Standardisierung von der Zelle Kultur Protokoll (d.h., HEK293H Zelle Wartungs- und Transfektion Bedingungen) und die hohe Anzahl der experim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Mandy Loebert und Tina Czajka für hervorragende technische Unterstützung zu bestätigen. Wir danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) für Sprache bearbeiten.

Materials

Material
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
CASY
Cell Counter + Analyser System
Model TT
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
Name Company Catalog Number Comments
Software
Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
Abbreviations
frw = forward; rev = reverse
n.a. = not applicable

References

  1. Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
  2. Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase&#34. J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
  3. Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
  4. Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
  5. Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
  6. Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
  7. Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
  8. Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
  9. Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
  10. Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
  11. Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
  12. Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
  13. Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
  14. . Available from: https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017)
  15. Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
  16. Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
  17. Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
  18. Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
  19. Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
  20. Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  21. Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
  22. Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
  23. Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
  24. Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
  25. Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
  26. Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).

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Lukas, J., Knospe, A., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

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