Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي

doi: 10.3791/56550 Published: December 20, 2017

Summary

وهناك طلب لجعل ما قبل السريرية الاختبار لفئة رواية اليتيمة "المخدرات يسمى مرافقين الدوائي استنساخه وسريعة وفعالة. وضعنا مقايسة على أساس الثقافة خلية بسيطة وموحدة شديدة وتنوعاً على الشاشة للمرضى المؤهلين، فضلا عن العقاقير وصي الدوائي الرواية.

Abstract

استخدام الأدوية المخصصة لعلاج الأمراض مونوجينيك النادرة مثل اضطرابات التخزين الليزوزومية (النساء) هو تحدي التصاميم المحاكمة السريرية المعقدة وتكاليف عالية، وانخفاض عدد المرضى. مئات الآليلات متحولة متورطة في معظم النساء. الأمراض التي تصنف عادة إلى 2 إلى 3 أنواع سريرية مختلفة حسب شدتها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يساعد التوصيف الجزيئي للنمط الوراثي التنبؤ بالنتائج السريرية وأبلغ العناية بالمرضى. ولذلك، قمنا بتطوير مقايسة ثقافة خلية بسيطة تستند إلى خلايا HEK293H هيتيرولوجوسلي الإفراط معربا عن الطفرات تم تحديدها في مرض فابري وبومبي. قد أدخلت مؤخرا مقايسة مماثلة كاختبار الإكلينيكية التعرف على الطفرات قابلة للعلاج وصي الدوائية (PCT) في مرض فابري. ويصف هذه المخطوطة مقايسة ثقافة خلية معدلة التي تمكن من تقييم المظهرية السريع للمتغيرات الجينية في مرض فابري وبومبي لتحديد المرضى المؤهلون للمعاهدة وقد تساعد في تطوير فارماكوتشابيرونيس الرواية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هناك أكثر من اثنتي عشرة التخزين الليزوزومية اضطرابات (النساء) تتصل بالخلل جليكوسيداسي نتيجة للطفرات الجينية الأولية. فابري (OMIM #301500) ومرض بومبي (OMIM #232300)، أكثر من 500 و 200 من الطفرات مغلطه وأبلغ1،2،3 ، على التوالي، التي تتطابق مع حوالي 60 في المائة العدد الإجمالي طفرة. لا يزال يجري تحديد العديد من المتغيرات الجينات الجديدة، والكثير منها معروف أهمية. كشفت دراسات مستفيضة البيوكيميائية أن بعض الأنماط الجينية لا تؤدي إلى فقدان-من-وظيفة كاملة من الجينات GLA (OMIM * 300644) في مرض فابري، بل تسبب الإنزيم المقابلة إلى فشل في الوصول إلى حالة قابلة لطي [ثرمودنميكلي] يفضل4 . هذه النتائج في استبقاء ER وتدهور سابق لأوانه إنزيم الفنية خلاف ذلك. قد تم استخلاص استنتاجات مماثلة في سائر النساء بما في ذلك مرض بومبي5. وعلاوة على ذلك، يمكن تسهيل التوصيف الجزيئي للمتغيرات إنزيم التفسير السريري للطفرات في وقت التشخيص6، مما يوحي بأن تطور LSD عملية فردية استناداً إلى طبيعة الطفرة. ولذلك، ينبغي إعادة تقييم التصنيف التقليدية إلى أنواع سريرية مختلفة عادة ما بين 2 إلى 3 بغية تبسيط المشورة الطبية والقرارات العلاجية.

العلاج باستبدال إنزيم (ERT) متاح لكلا المرضين. بيد أن فريق خبراء الاستعراض، قد محدودة فعالية في الأنسجة/الأجهزة المتأثرة مثل الدماغ والعضلات. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على فريق خبراء الاستعراض استجابة مكسبه يهدد فوائدها العلاجية. المحرمين الدوائية (أجهزة كمبيوتر) بديل جذابة علاج للمرضى المصابين بما يسمى الطفرات استجابة. أجهزة الكمبيوتر بمثابة سقالة جزيئية لطي البروتين الصحيح وتحقيق الاستقرار الذي يمنع بدوره الاحتفاظ هيولى (ER) وتدهور الإنزيم المرتبطة ER. وعلاوة على ذلك، أجهزة الكمبيوتر يمكن أن تدار شفويا، ويحتمل أن تكون قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ. ولذلك، قد تكون المعاهدة خياراً قابلاً للتطبيق أكثر لعلاج المرضى الذين يعانون من بعض الأنماط الجينية. لاستعراض مستفيض في تطبيق الكمبيوتر في النساء، الرجوع إلى استعراض ممتازة بارينتي7.

اكتشاف مئات أمراض التي تسبب الآليلات متحولة التحديات اختبار المخدرات قبل الإكلينيكية ويستلزم إجراء تقييم بسيطة وسريعة وعالية موحدة للمرضى قابلة للأخذ بنهج طب شخصية. من أجل تقييم الآثار الضارة للطفرات الجينية LSD واختبار الطفرات المرشح للتنبؤ المرضى قابلة للبراءات، كان نظام تعبير المفرط موحدة عالية في خلايا HEK293H التي تسمح بقياس نشاط الإنزيم سريعة وموثوق بها البلدان المتقدمة النمو. نظم التعبير المفرط مماثلة قد وصفت سابقا لمرض فابري وبومبي باستخدام أما كوس-78،9،،من1011أو خلايا هيلا12أو HEK29313 14، ،،من1516 الخلايا للجينات جليكوسيداسي.

طريقة مشابهة جداً، حتى تم تسجيل براءة اختراع "وسيلة للتنبؤ باستجابة للعلاج الدوائي والوصيفة من الأمراض"17 تشير إلى أهمية خلية ثقافة نظام قادر على إدماجها في الممارسة السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-إعداد المسخ الثوابت pcDNA3.1/GLA و pcDNA3.1/جا

ملاحظة: استراتيجيات الاستنساخ ل GLA و جا الترميز تسلسل (cds) قد تم الإبلاغ عنها سابقا15،18.

  1. توجه موقع الطفرات استخدام الطفرات توجه الموقع
    1. استخدام المرجع تسلسل NM_000169.2 و NM_000152.4 كقوالب للطفرات الجينات GLA و أكاديمية ، على التوالي. لديك مجموعة من الإشعال درجة نقاء عالية مجانية الملح (25-37-الصرف) توليفها من قبل موفر تجارية، مع الإشعال الإحساس و antisense يحمل واحدة من التعديلات كل تسلسل المركزية على طول الأخذ بشكل فردي الطفرة. استخدام أداة تصميم التمهيدي مجانية لدعم تصميم التمهيدي19.
    2. الخليط رد فعل، استخدام الشروط القياسية لحل رد فعل وظروف PCR توفيرها من قبل الشركة المصنعة.
      1. مزيج 5 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت، 10 نانوغرام من قالب مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بلازميد الحمض النووي (pcDNA3.1/GLA أو pcDNA3.1/جا)، 125 نانوغرام لكل التمهيدي، 1 ميليلتر من خليط دنتب المقدمة، 3 ميليلتر من كاشف [دمس] في وحدة تخزين مناسبة للمياه (حجم الرد النهائي : 50 ميليلتر). وأخيراً، إضافة 2.5 "يو دنا" بوليميريز ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. كعنصر تحكم سلبية، تحمل على طول عينة لا التمهيدي.
    3. بدء تشغيل الاسترداد استخدام البرنامج التالي: الخطوة 1:95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، الخطوة 2:95 درجة مئوية لمدة 50 ثانية، الخطوة 3:60 درجة مئوية لمدة 50 s, الخطوة 4:68 درجة مئوية لمدة 8 دقائق، كرر الخطوة 2-4 18 مرة، والخطوة 5:68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      1. بكر، بعد إضافة 1 ميليلتر من Dpnأنا إنزيم التقييد (يو 10/ميليلتر) وكذلك احتضان القنينة رد الفعل عند 37 درجة مئوية ح 1.
  2. التحول والفرز لاستنساخ المطلوب
    1. تحويل قاسمة للخلايا أولتراكومبيتينت وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. استخدام شركة نفط الجنوب متوسطة (تريبتوني 2% (w/v)، الخميرة استخراج 0.5% (w/v)، كلوريد الصوديوم 10 مم، بوكل 2.5 ملم، وتعقيم في 121 درجة مئوية ثم قم بإضافة الحلول العقيمة التي تمت تصفيتها مجكل2 والسكر حتى التركيزات النهائية 10 و 20 مم، على التوالي) بدلاً من الشركة المصنعة المتوسطة. بعد هذا الإجراء، لوحة 250 ميليلتر من الطفرات عينة على رطل لوحة تحتوي على 100 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل واحتضان في 37 درجة مئوية ح 18.
    2. أؤكد أن عدد ترانسفورمانتس > 10 ورد فعل غلة على الأقل ثلاثة إضعاف هذا العدد المستعمرات كمراقبة التمهيدي لا رد فعل، مثلاً، استخدام لوحة مضيئة لتسهيل عد مستعمرة. ثم اختيار 3 مستعمرات وإعداد 3 مل الثقافات بين عشية وضحاها في متوسطة مرق رطل.
    3. في اليوم التالي، القيام بإعداد بلازميد مع مجموعة قياسية وتحليل تسلسل كامل باستخدام T7 (5ʹ-ﻷعمالهم تاك GAC TCA كبار المستشارين التقنيين العلامة زز-3ʹ) وترتيب الإشعال بغر (5ʹ-العلامة AAG الائتلاف كاج TCG AGG-3ʹ) عبر سانجر القياسية.
    4. استخدم أداة مناسبة في مجال بيولوجيا الجزيئية لتحليل التسلسل. عندما يتم الكشف عن الطفرة المنشودة ولا كذلك تسلسل الشذوذ بالمقارنة مع NM_000169.2 (α-جالاكتوسيداسي A) أو NM_000152.4 (حمض α-glucosidase) وينظر، حدد الاستنساخ لتنقية بلازميد تعداء-الصف.
    5. تحديد نقاء الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص في جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: تسمح فقط الأعمال التحضيرية التي تعطي درجة نقاء بلازميد مع نسبة امتصاص 260/280 من > 1.8 لخلية ثقافة التجارب.

2-زراعة الخلايا HEK293H

  1. الحفاظ على خلايا HEK293H في ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام/لتر) Dulbecco´s التعديل النسر المتوسطة (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1%. إبقاء الخلايا واتيرجاكيت حاضنة في 37 درجة مئوية تحت جو2 CO 5%.
  2. زراعة الخلايا لكثافة 80-90%.
  3. نضح المتوسطة ويغسل مرة واحدة باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون Ca2 + و Mg2 +.
  4. مرور عن طريق إضافة 0.05% يدتا التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
  5. تقسيم الخلايا 01:15 في المتوسط الطازجة والبذور قارورة T75 جديدة للحفاظ على ثقافة دائمة. لا تستخدم الخلايا مع أكثر من 25 من الممرات.

3-pcDNA3.1/GLA و pcDNA3.1/جا تعداء بلازميد والعلاج HEK293H

  1. 24 ساعة قبل تعداء، يغسل خلايا HEK293H قارورة ثقافة الخليوي T75 مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مع Ca2 +, Mg2 +. حصاد الخلايا مع 0.05% يدتا التربسين كما ورد أعلاه والبذور 1.5 × 105 خلايا في التجاويف للثقافة جيدا 24 لوحة باستخدام 500 ميليلتر دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS دون المضادات الحيوية.
  2. تنفيذ بروتوكول تعداء وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة. عادة، استخدام خليط من 1 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي و 2.5 ميليلتر من تعداء الكاشف في 100 ميليلتر من دميم خالية من المصل. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإضافة إلى الخلايا بطريقة دروبويسي بعد ذلك.
  3. إزالة المتوسطة المحتوية على الكاشف تعداء بعد فترة من ح 4 في 37 °C/5% CO2 وإضافة 500 ميليلتر من دميم الطازجة مع 10% FBS/1% البنسلين/ستربتوميسين.
    ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، هيدروكلوريد 1-ديوكسيجالاكتونوجيريميسين (DGJ) أو هيدروكلوريد 1-ديوكسينوجيريميسين (دنج) يمكن أن تضاف إلى المتوسطة الثقافة حيث يقصد بها (استخدام حلاً مخزون مائي من 10 ملم من أجل الحصول على تركيز نهائي من 20 ميكرومتر DGJ ودنج ). تمت إضافة جديدة DGJ أو دنج ح 42 بعد تعداء بلازميد.

4-الخلية الحصاد و α-جالاكتوسيداسي A أو قياس نشاط حمض α-glucosidase

  1. الحصاد الخلية
    1. في يوم الحصاد، إزالة الخلايا من الحاضنة ونضح المتوسطة. أغسل بعناية الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني مع Ca2 + و Mg2 +.
      ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة لأن DGJ ودنج مثبطات قوية من α-جالاكتوسيداسي و α-جلوكوسيداسي، على التوالي، وسوف يبطل أي بقايا الاختبار.
    2. إضافة 200 ميليلتر من المياه مباشرة فوق الخلايا. شطف الخلايا من اللوحة وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل.
  2. تجانس بالتجميد والذوبان
    1. وضع العينات في الرف الرغوة المناسبة ودوامه 5 s جعل تحلل أكثر كفاءة. وضع العينات التي تعقد بالتناوب في النتروجين السائل لمدة 10 ق وفي حمام مائي في درجة حرارة الغرفة حتى ذوبان الجليد الكامل (5 دقائق).
    2. كرر هذا الإجراء 5 مرات وثم تدور هذه العينات لمدة 5 دقائق في 10,000 س ز.
الإبقاء على المادة طافية وماصة في أنبوب رد فعل جديد.
  • تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك
    1. إعداد أنبوب جديد لكل عينة تحتوي على 40 ميكروليتر منزوع ح2س وإضافة 10 ميكروليتر من عينة. مزيج الحل قبل فورتيكسينج بإيجاز ونقل 10 ميليلتر في تجويف صفيحة جيدا 96 (كل عينة في ثلاث نسخ). تمييع حل أسهم ألبومين المصل بقرى (BSA) 2 مغ/مل في منزوع ح2س كما يلي للحصول على منحنى قياسي: 50 ميليلتر ح2O/50 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ 60 ميليلتر ح2ميليلتر س/40 جيش صرب البوسنة؛ ميليلتر 70 ح2س/30 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ ميليلتر 80 ح2س/20 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ ميليلتر 90 ح2س/10 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ 100 ميليلتر ح2o.
    2. ابدأ الرد بإضافة 200 ميليلتر من اتفاق التعاون الأساسي كاشف (كاشف أ وكاشف ب المختلطة بنسبة 50: 1) واحتضانها ح 1 في الظلام في 37 درجة مئوية تحت الانفعالات طفيف في شاكر مداري (300 لفة في الدقيقة). قياس امتصاص في 560 نانومتر في قارئ لوحة.
      ملاحظة: تتضمن العينات عادة بين 1 والبروتين 1.5 ميكروغرام لكل ميليلتر.
  • قياس نشاط الإنزيم مع ركائز اصطناعية 4-ميثيلومبيليفيريل (4-القدح)
    1. إضعاف المبلغ المحسوب لكل عينة وبيبيت في أنابيب جديدة 1.5 مل رد فعل الحصول على 0.05 (لألف α-جالاكتوسيداسي) أو 0.5 (لحمض α-glucosidase) ميكروغرام/ميليلتر البروتين الحلول. كذلك لوحة العينات 5 s مرة أخرى وبيبيت 10 ميليلتر من هذا التخفيف إلى 96 دوامة (كل عينة في مكررة).
    2. ابدأ رد فعل بإضافة 20 ميليلتر من الحل الركيزة الخاصة بكل منها:
      ل α-جالاكتوسيداسي ج: 2 مم 4-ميثيلومبيليفيريل-α-د-جالاكتوبيرانوسيدي (4-مو-غال) 0.06 م الفوسفات سترات المخزن المؤقت، 4.7 درجة الحموضة.
      لحمض α-glucosidase: 2 مم 4-ميثيلومبيليفيريل α-د-جلوكوبيرانوسيدي (4-مو-غلو) في م 0.025 خلات الصوديوم، pH 4.0.
    3. احتضان ردود فعل الإنزيم ح 1 في الظلام في 37 درجة مئوية تحت الانفعالات طفيف في شاكر مداري (300 لفة في الدقيقة). إنهاء رد فعل بإضافة 200 ميليلتر 1.0 متر، الرقم الهيدروجيني 10.5 المعدلة جليكاين-هيدروكسيد الصوديوم العازلة.
    4. إعداد منحنى قياسي من 4-ميثيلومبيليفيروني (4-مو) من 0.01 ملغ/مل أسهم على النحو التالي:
      100 ميليلتر ح2س/لا مو 4؛ 80 ميليلتر ح2س/20 ميليلتر 4-مو؛ 60 ميليلتر ح2س/40 مو 4 ميليلتر؛ 40 ميكروليتر ح2س/60 ميليلتر 4-مو؛ 20 ميليلتر ح2س/80 مو 4 ميليلتر؛ لا ح2س/100 ميليلتر 4-مو، بيبيت 10 ميليلتر من كل تمييع في البئر 96 لوحة (في تكرارات) وإضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت جليكاين-هيدروكسيد الصوديوم 1.0 متر لكل بئر من أجل ضبط حجم ودرجة الحموضة.
    5. قياس نشاط الإنزيم في قارئ الأسفار مزودة بعامل التصفية المناسب تعيين وتحليل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لجهاز قارئ الأسفار.
      ملاحظة: كل ركائز 4-القدح تخفض إلى 4-مو خلال التعرض إلى α-جالاكتوسيداسي A أو حمض α-جلوكوسيداسي. 4-مو المفرج عنهم هو فلوروتشرومي، الذي يمكن أن يقاس في 360 و 465 شمال البحر الأبيض المتوسط كموجات الإثارة والانبعاثات، على التوالي، باستخدام قارئ الأسفار ميكروسكوبية.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    الإجراء الطفرات
    لتقييم الكفاءة للطفرات الجينية GLA ، صنفت الطفرات في واحدة من الفئات التالية. وكشف هذا النهج تولد الطفرات التي تم الحصول على حوالي 66.5 في المائة الطفرات GLA في المحاولة الأولى. ويمكن الحصول على زيادة 25 ٪ بعد بكر ثانية معدلة قليلاً.

    الفئة 1: الطفرات PCR كان فعالاً في المحاولة الأولى.

    الفئة 2: فشل أول الطفرات بكر (لا مستعمرات على اللوحة، لا طفرة المدرج)؛ تعيين تكرار استخدام نفس الدليل التمهيدي بزيادة درجة حرارة انلينغ يصل إلى 68 درجة مئوية كان فعالاً.

    الفئة 3: المزيد من الجهد قد يتعين القيام بها تسفر عن استنساخ المطلوبة (مثلاً، عادة واحد أو أكثر من مجموعات جديدة من كبسولة تفجير تم تصميمه).

    Α-جالاكتوسيداسي أ وقياس نشاط إنزيم حمض α-glucosidase
    وسجلت نشاط إنزيم من إنزيمات متحولة مختلفة بعد الحضانة السابقة عابر transfected الخلايا في وجود أو عدم وجود جهاز كمبيوتر. 1 الجدول يشير إلى النتائج 3 α-جالاكتوسيداسي A و 3 حمض α-glucosidase الطفرات. يتم عرض البيانات ك (1) القيم المطلقة لدوران الركازة (نمول 4-مو * مغ البروتين-1* ح-1) و كقيم (2) النسبي تطبيع للانزيم نوع البرية. كلا التعبيرين مفيدة، منذ دوران الركازة إجمالي يوضح كفاءة رد فعل وتلميحات حساسية النظام، بينما يمكن أن تعطي قيم طبيعية هامة لاحتمال الخبيثة الطفرة من ناحية كفاءة معالجة الكمبيوتر التطبيقية من ناحية أخرى. للمرحلة التجريبية، وأنشئت تدفق العمل المبينة في الشكل 1 ، التي من المقرر فترة حضانة ح 60 مع المجمع (نظراً لأسباب تقنية، مثل النمو السريع في الخلية HEK293H ظروف عرض). على الرغم من أنه قد قيل أن 10 ميكرون تركيز البلازما يمكن تحقيقها الحد الأقصى التقريبي ل DGJ14، يستخدم البروتوكول الحالي 20 ميكرومتر كتركيز معقول غرض فحص لاستجابة الكمبيوتر بتأييد العديد وفي وقت سابق يعمل4،،من2021،،من2223. وعلاوة على ذلك، وقد افترض أن أعلى مستويات البلازما ويمكن الوصول إلى24.

    Figure 1
    الشكل 1 : تدفق العمل في المختبر قياس نشاط الإنزيم. (أ) الجدول الزمني للتجربة يظهر جهدا ثقافة خلية ح 90 مع نسبيا القليل العملي-على-الوقت المطلوب في النقاط الزمنية المشار إليها. (ب) ترد pcDNA3.1 ناقلات بلازميد الممثل الذي يحتوي على الأقراص المضغوطة نوع البرية GLA و أكاديمية . استخدمت والبلازميدات نوع البرية GLA و كأع والبلازميدات بما في ذلك الطفرة المدرج كل الاهتمام لعابر ترانسفيكت الخلايا HEK293H مطلي بشكل جيد 24. بعد فترة السماح للخلايا لتجميع منتجات الجينات الخاصة بكل منها، والسماح لأنزيم التجهيز والنقل الليزوزومية وعمل جهاز الكمبيوتر، تم تفكيك الخلايا وقياسه في قارئ لوحة الأسفار وتحليلها باستخدام البرامج الخاصة بكل منها. C: وترد حالة التشكل والنمو خلية من الخلايا HEK293H طوال الوقت بالتجربة. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    نشاط إنزيم في المختبر
    GLA أصلي DGJ 20 ميكرومتر
    الطفرة (أإ) نمول 4-القدح-غال/mg/ح (متوسط) يعني % (±SD, N) نمول 4-القدح-غال/mg/ح (متوسط) يعني % (±SD, N) أهمية
    p.A143T 2384.7 29.2 (±2.6، 5) 4223.0 52.0 (±4.4، 5) ***
    p.A156V 379.2 4.3 (±. 8، 5) 1437.5 16.3 (±1.3، 5) ****
    p.R301Q 777.4 8.8 (إناثها، 5) 3002.6 44.2 (±3.6، 5) ****
    جا أصلي دنج 20 ميكرومتر
    الطفرة (أإ) نمول 4-القدح-غلو/mg/ح (متوسط) يعني % (±SD, N) نمول 4-القدح-غلو/mg/ح (متوسط) يعني % (±SD, N) أهمية
    p.Y455F 41.1 5.4 (±. 4، 5) 246.6 31.4 (±2.8، 5) ***
    p.P545L 65.7 6.6 (±. 4، 5) 166.5 16.7 (± 1.5، 5) **
    p.L552P 0.0 0.0 (±. 2, 5) 104.3 10.4 (±1.4، 5) ***

    الجدول 1: نشاط إنزيم A α-جالاكتوسيداسي وحمض α-جلوكوسيداسي- ويبين الجدول نتائج تمثيلية ل 3 α-جالاكتوسيداسي A و 3 طفرات الحمض α-glucosidase مع وبدون أجهزة الكمبيوتر DGJ أو دنج. تم تصحيح البيانات نشاط إنزيم المطلق لنشاط إنزيم الذاتية من الخلايا HEK293H. لتقييم نشاط إنزيم الذاتية، تم transfected الخلايا مع ناقل pcDNA3.1 فارغة. كانت القيم التي نمول 97.5 4-مو * مغ البروتين-1* ح-1 α-جالاكتوسيداسي A ونمول 41.6 4-مو * مغ البروتين-1* ح-1 لحمض α-جلوكوسيداسي، على التوالي؛ تم تطبيع قيم نشاط إنزيم لأنزيم البرية نوع من التجارب المناظرة، مما يفسر انحرافات القيم النسبية بين طفرات مختلفة.بعد 5 تجارب الثقافة خلية مستقلة (N = 5)، كل منها أجريت في التكرارات التقنية، والانحراف المعياري لا يسمح بأن يكون > 15 في المائة المتوسط. واستخدمت نسبة تي-اختبارات لحساب الفرق بين إنزيم غير المعالجة والمعالجة بالكمبيوتر.
    * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.005، * * * ف < 0.001

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    يسلم البروتوكول المبينة في هذا التقرير نتائج قوية لتقييم الأضرار الإنزيم في أمراض وراثية الليزوزومية من الأيض. هذه المخطوطة إدخال تعديل على البروتوكول ونشرت قبل15. أهم التعديلات التي تنطوي على صرامة (أيعملية إعداد بناء ناقلات متحولة)، توحيد البروتوكول ثقافة الخلية (أي، ظروف الصيانة وتعداء الخلايا HEK293H)، والارتفاع عدد التكرار التجريبي (على الأقل 5)، مما أسهم في إمكانية تكرار نتائج نتائج عالية. بالإجمال، كلا الجينات المستهدفة قد تم الوصول إليها بسهولة للطفرات ويمكن تجميع عدد وافر طفرات بالتوازي. وتحقق نسبة إشارة/ضوضاء عالية نسبيا النظر إلى أن نشاط إنزيم الذاتية داخل الخلايا HEK293H تافهة 1/50 (α-جالاكتوسيداسي A) و 1/20 (حمض α-glucosidase) الجينات المعلنة المفرط البرية نوع. وهكذا، هناك حل ممتاز بين نوع البرية وإنزيم المسخ. تجدر الإشارة إلى أن تطبق على كمية مختلفة من البروتين الكلي لتحليل نشاط الإنزيمات على حد سواء (0.5 و 5 ميكروغرام، على التوالي)، ونظرا لأن نشاط حمض α-glucosidase كان أمر من حجم أقل من ألف α-جالاكتوسيداسي

    وكما ذكر أعلاه، البارامترات المقايسة غالباً المثيرة للجدل، حيث وضعت العديد من المختبرات فحوصات خاصة بهم للتحقيق في جليكوسيداسيس الليزوزومية. يمكن أن تختلف النظم في نوع الخلية وتصميم ناقل بلازميد وظروف زراعة وفترة التعرض للمخدرات فقط لتسمية عدد قليل من المعلمات العديد. نشرت مؤخرا تحليل تلوي لمرض فابري أثبتت أن تسجيلات نشاط إنزيم (مع وبدون جهاز الكمبيوتر) نماذج الخلية transfected (مثلاً، HEK293، كوس-7) إلى حد كبير وفقا للنتائج التي تم الحصول عليها من الخلايا المشتقة من المريض ( معظم الخلايا الليمفاوية أو الليفية) فيما يتعلق بهذه المسألة، ما إذا كانت طفرة استجابة ل الكمبيوتر24. أظهرت تقارير سابقة مباشرة مقارنة نماذج تعداء الخلايا المستمدة من المريض وأن نظم التعبير المفرط تعكس الحالة في خلايا المريض دون المساس بال13،إبرام14. ولذلك يستنتج أنه، بغض النظر عن بروتوكول معين، لم يتم تغيير النتائج التي توصلت إليها مختلف المؤلفين من مختلف النظم الخلوية، على الرغم من أن تعريفات المستجيب يمكن أن تكون متباينة. التعريف الحالي لطفرة مجيبة هي زيادة نشاط إنزيم النسبي 20% وزيادة نشاط إنزيم المطلق 5% مقارنة بالانزيم نوع البرية بعد الحضانة مع 20 ميكرومتر DGJ ح 60. قاعدة بيانات شاملة، فابريسيب، يسمح بمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من مختلف النهج التجريبي لمئات من طفرات α-جالاكتوسيداسي25.

    ما إذا كانت هذه المعايير كافية للتنبؤ بالفوائد السريرية DGJ ودنج لا يزال غير واضح، نظراً لمستوى النشاط اللازمة للحيلولة دون أعراض مرض مثير للجدل. واقترحت دراسة السابقة أن 10 إلى 15% نشاط المتبقية قد تكون كافية للنظام للعمل بشكل صحيح من26. بيد في تقرير نشر مؤخرا من دراسة سريرية مرحلة 2 ل DGJ، زيادة بنسبة 1% نشاط يعتبر يحتمل أن تكون مفيدة للمريض، عندما كان النشاط الأساس أقل من 1% من العادي27. النتائج السريرية مؤخرا تشير إلى أن المرضى وتوقع الاستجابة لأجهزة الكمبيوتر بتعريف المستجيب إيه تو زيرو % زيادة نسبية وإيه ثري % زيادة مطلقة من نوع البرية α-جالاكتوسيداسي بنشاط في الخلايا HEK293H بعد الحضانة مع 10 ميكرون DGJ فعلا مشتقة الفوائد السريرية مع استقرار المرض أو حتى التحسين من المعلمات الكلي والقلب28. بينما DGJ الفعل وافقت عليه إدارة الأغذية والعقاقير، والمفوضية الأوروبية الأحادي لمرض فابري، يبدو الدورة من أجهزة الكمبيوتر مثل دنج ومشتقات N-بوتيل-دنج في مرض بومبي مختلفة. تم إنهاء نهج مونوثيرابيوتيكال مع دنج خلال "المرحلة الثانية من" تجارب سريرية بسبب أحداث سلبية شديدة الخطورة في بعض المرضى29. ومع ذلك، معاملة الكمبيوتر في تركيبة مع الحلقات المعتمدة أظهرت النتائج تحسنت بشكل ملحوظ فيما يتعلق بالحد من الركازة (الجليكوجين) المرض مقارنة ب الأحادي المكون من30.

    ونحن نقترح أنه يمكن توسيع النهج الذي قدم للنساء الأخرى وأجهزة الكمبيوتر الأخرى مثل أخواتها و Krabbe تاي-ساكس/ساندهوف GM1 جانجليوسيدوسيس، ولكن هذا قد لا تعمل في حالات محددة، حيث على سبيل المثال نسبة إشارة/ضجيج النظام غير كافية. وينبغي الحرص على تحديد أسلوب تعطيل خلية مناسبة لإعداد خلية ليستي لتحديد نشاط إنزيم، بسبب إضافة المنظفات في المخزن المؤقت لتحلل قد يكون دليلاً على إنزيمات الغشاء زمنياً مثل جلوكوسيريبروسيداسي في Gaucher المرض بينما قد يضر بكميات مماثلة من المنظفات الأخرى الإنزيمات. ألف α-جالاكتوسيداسي، وينبغي تجنب أسلوب تعطيل خلية على أساس sonication.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgments

    الكتاب تود أن تقر لوبيرت ماندي وتينا كزاجكا للدعم الفني الممتاز. نشكر لوه النباتات (كلية الطب في جامعة هارفارد، بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحرير تعليمات اللغة.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Cardiff University. http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
    2. Meiji Pharmaceutical University. http://fabry-database.org (2017).
    3. Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
    4. Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
    5. Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
    6. Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
    7. Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
    8. Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
    9. Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
    10. Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
    11. Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
    12. Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
    13. Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
    14. Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
    15. Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
    16. Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
    17. https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
    18. Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
    19. http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
    20. Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
    21. Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
    22. Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
    23. Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
    24. Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
    25. Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
    26. Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
    27. Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
    28. Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
    29. Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
    30. Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
    <em>في المختبر</em> قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).More

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter