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Medicine

In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

doi: 10.3791/56550 Published: December 20, 2017

Summary

Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von "Orphan" Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

Abstract

Die Nutzung der personalisierten Medizin zur Behandlung von seltener monogenen Krankheiten wie Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) wird durch komplexe klinische Versuch-Designs, hohe Kosten und geringen Patientenzahlen herausgefordert. Hunderte von mutierten Allelen sind in den meisten der LSDs verwickelt. Die Krankheiten sind in der Regel in 2 bis 3 verschiedene klinische Typen nach Schweregrad eingestuft. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung des Genotyps helfen, vorherzusagen, klinische Ergebnisse und Patientenversorgung zu informieren. Daher haben wir einen einfache Zelle Kultur Assay basierend auf HEK293H Zellen heterologously Ausdruck über die Mutationen identifiziert Fabry und Pompe-Krankheit entwickelt. Eine ähnliche Test wurde vor kurzem als präklinischen Prüfung zugänglich Mutationen für pharmakologische Chaperon Therapy (PCT) im Fabry-Krankheit zu identifizieren eingeführt. Dieses Manuskript beschreibt eine geänderte Zelle-Kultur-Probe, die ermöglicht schnelle phänotypische Beurteilung der allelischen Varianten Fabry und Pompe-Krankheit, geeignete Patienten für PCT zu identifizieren und möglicherweise Hilfe bei der Entwicklung von neuartigen Pharmacochaperones.

Introduction

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Es gibt über ein Dutzend Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) im Zusammenhang mit Glucosidase Dysfunktion durch primäre Genmutationen. Fabry (OMIM #301500) und Morbus Pompe (OMIM #232300), mehr als 500 und 200 Missense-Mutationen,1,2,3 gemeldet wurden, beziehungsweise, was etwa 60 % des gesamten Mutation Grafen entspricht. Sind noch zahlreiche neue Genvarianten identifiziert, von denen viele haben unbekannte Bedeutung. Umfangreiche biochemische Untersuchungen ergeben, dass bestimmte Genotypen nicht zu einer vollständigen Verlustfunktion des GLA -Gens führen (OMIM * 300644) in Fabry-Krankheit, aber dazu führen, dass das entsprechende Enzym zum Scheitern verurteilt, einen thermodynamisch favorisierten klappbaren Zustand4 erreichen . Dadurch wird ER Retention und vorzeitigen Abbau des ansonsten funktional Enzyms. Ähnliche Schlussfolgerungen wurden in anderen LSDs einschließlich Pompe-Krankheit5gezogen. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung Enzymvarianten erleichtern klinische Interpretation der Mutationen zum Zeitpunkt der Diagnose6, was darauf hindeutet, dass LSD Progression ein individueller Prozess ist, basierend auf der Art der Mutation. Die herkömmliche Einteilung in verschiedene klinische Typen in der Regel 2 bis 3 sollte daher überprüft werden, um klinische Beratung und therapeutische Entscheidungen zu straffen.

Enzym-Ersatz-Therapie (ERT) ist für beide Krankheiten verfügbar. ERT, hat jedoch nur begrenzte Wirksamkeit im betroffenen Gewebe/Organe wie das Gehirn und Skelettmuskulatur. Darüber hinaus kann ERT eine immunogen Reaktion auslösen, die die therapeutischen Vorteile gefährdet. Pharmakologische Chaperonen (PCs) sind eine attraktive Behandlungsalternative für Patienten mit so genannten reagieren Mutationen. PCs dienen als molekulare Gerüst für korrekte Proteinfaltung und Stabilisierung, die wiederum endoplasmatische Retikulum (ER) Aufbewahrung und ER verbundenen Abbau des Enzyms verhindert. Darüber hinaus PCs können oral verabreicht werden und sind möglicherweise in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke. Daher möglicherweise PCT eine praktikable Option für die Behandlung von Patienten mit bestimmten Genotypen. Für eine umfassende Überprüfung auf PC-Anwendung in LSDs beziehen sich auf die ausgezeichnete Bewertung von Parenti7.

Die Entdeckung von Hunderten von krankmachenden mutierten Allele fordert prä-klinischen Drogentests und erfordert eine einfache, schnelle und hoch standardisierte Bewertung zugänglich Patienten für eine personalisierte Medizin-Ansatz. Bei der Beurteilung der schädlichen Auswirkungen von LSD-Gen-Mutationen und Kandidat Mutationen zu zugänglich Patienten für PCT Vorhersagen zu testen, war ein hoch standardisierten Überexpression System in HEK293H Zellen, die für schnelle und zuverlässige Enzym Aktivitätsmessung ermöglicht entwickelt. Ähnliche Überexpression Systeme für Fabry und Pompe-Krankheit mit COS-78,9,10,11, HeLa Zellen12oder HEK293 beschriebenen13 ,14,15,16 Zellen für die gen-Glucosidase.

Eine sehr ähnliche Methode wurde sogar als "Methode zur Reaktion auf die pharmakologische Chaperon Behandlung von Krankheiten Vorhersagen" patentiert17 zeigt die Relevanz einer Zelle Kultur System integrierbar in die klinische Praxis.

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Protocol

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1. Vorbereitung der Mutant pcDNA3.1/GLA und pcDNA3.1/GAA Konstrukte

Hinweis: Die Klonen Strategien für die GLA und GAA Codierung Sequenzen (Cds) wurden berichtet früher15,18.

  1. Site-verwiesene Mutagenese mit Site-verwiesene Mutagenese
    1. Verwendung der Verweis Sequenzen NM_000169.2 und NM_000152.4 als Vorlagen für die Mutagenese GLA und GAA Gene. Haben Sie eine Reihe von hochreines Salz frei Primer (25-37-Mers) synthetisiert von einem kommerziellen Anbieter mit Sense und Antisense Primer tragen eine der jeweiligen Sequenz Änderungen zentral auf ihre Länge die Mutation einzeln vorstellen. Nutzen Sie die kostenlose Grundierung-Design-Tool, um Primer Design19zu unterstützen.
    2. Verwenden Sie für das Reaktionsgemisch die Standardbedingungen für die Reaktionslösung und PCR-Bedingungen des Herstellers.
      1. Mix 5 µL 10-fach Puffer Reaktion, 10 ng der Doppelstrang-Vorlage Plasmid DNA (pcDNA3.1/GLA oder pcDNA3.1/GAA), 125 ng jeder Grundierung, 1 µL der bereitgestellten dNTP-Gemisch, 3 µL DMSO Reagenz in einem entsprechenden Volumen von entionisiertem Wasser (endgültige Reaktionsvolumen : 50 ΜL). Zu guter Letzt 2,5 U der DNA-Polymerase und Mischen von Pipettieren rauf und runter. Als Negativkontrolle eine keine-Primer-Probe mitnehmen.
    3. Starten Sie die PCR mit dem folgenden Programm: Schritt 1: 95 ° C für 1 min, Schritt 2: 95 ° C für 50 s, Schritt 3: 60 ° C für 50 s, Schritt 4: 68 ° C 8 min, wiederholen Sie Schritt 2 bis 4 18mal und Schritt 5: 68 ° C für 10 Minuten.
      1. Nach PCR, fügen Sie 1 µL Dpnich Restriktionsenzym (10 U/µL) und inkubieren Sie weiter die Reaktion Phiole bei 37 ° C für 1 h.
  2. Transformation und Screening für den gewünschten Klon
    1. Eine aliquote ultracompetent Zellen im Einklang mit den Empfehlungen des Herstellers zu verwandeln. Einsatz-SOC-Medium (Tryptone 2 % (w/V) Hefe 0,5 % (w/V) NaCl 10 mM KCl 2,5 mM zu extrahieren, Sterilisation bei 121 ° C, und fügen Sie steril filtriert Lösungen von MgCl2 und Glukose bis Endkonzentrationen von 10 und 20 mM bzw.) anstelle des Herstellers Medium. Nach dem Eingriff Platte 250 µL Sample Mutagenese auf eine LB Platte enthält 100 µg/mL Ampicillin und Inkubation bei 37 ° C für 18 h.
    2. Versichern, dass die Anzahl der Transformanten ist > 10 und die Reaktion liefert mindestens dreimal so viele Kolonien als der keine-Primer Kontrollreaktion, z.B.mit einer leuchtenden Platte Koloniezahlbestimmung zu erleichtern. Dann wählen Sie 3 Kolonien und bereiten Sie 3 mL über Nacht Kulturen in Brühe LB-Medium.
    3. Am nächsten Tag, Plasmid-Vorbereitung mit einem standard-Kit durchführen und analysieren die gesamte Sequenz mit T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) und BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) Primer über standard Sanger-Sequenzierung.
    4. Verwenden Sie ein geeigneter Molekularbiologie-Tool, um die Sequenz zu analysieren. Wenn die gewünschte Mutation erkannt wird und keine weitere Anomalie im Vergleich zu NM_000169.2 (α-Galaktosidase A) Sequenz oder NM_000152.4 (saure α-Glucosidase) ist zu sehen, wählen Sie den Klon zur Transfektion-Grade Plasmid Reinigung.
    5. Bestimmen Sie die Reinheit der DNA durch Messung der Absorption in einem Spektrophotometer.
      Hinweis: Lassen Sie nur Vorbereitungen, die eine Plasmid-Reinheit mit einem 260/280 Extinktion Verhältnis von ergeben > 1,8 für Zelle Kultur Experimente.

2. Anbau von HEK293H Zellen

  1. Halten Sie HEK293H Zellen in hohe Glukose (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Halten Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C unter einer 5 % CO2 Atmosphäre Waterjacket.
  2. Pflegen Sie die Zellen, die eine Dichte von 80-90 %.
  3. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie einmal mit Phosphat Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + und Mg2 gepufferte +.
  4. Durchgang durch das Hinzufügen von 0,05 % Trypsin-EDTA und 5 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.
  5. Die Zellen 01:15 in frisches Medium und Samen in einem neuen T75 Kolben, die permanente Kultur beizubehalten aufgeteilt. Verwenden Sie Zellen nicht mit mehr als 25 Passagen.

(3) pcDNA3.1/GLA und pcDNA3.1/GAA Plasmid Transfection und Behandlung von HEK293H

  1. 24 h vor der Transfektion waschen die HEK293H Zellen in einem T75 Zelle Kultur Kolben einmal mit PBS mit Ca2 +, Mg2 +. Ernte der Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA als oben angegeben und 1,5 x 105 Samenzellen in die Hohlräume einer 24 gut Kultur-Platte mit 500 µL DMEM Medium ergänzt mit 10 % FBS ohne Antibiotika.
  2. Führen Sie ein Protokoll der Transfektion laut Handbuch des Herstellers. In der Regel verwenden Sie eine Mischung aus 1 µg Plasmid-DNA und 2,5 µL Transfection Reagens in 100 µL serumfreien DMEM. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie und verleihen Sie den Zellen in einer drop-wise Weise danach.
  3. Die Transfektion Reagenz nach einem Zeitraum von 4 h bei 37 °C/5% CO2 -haltigem Medium entfernen und hinzufügen 500 µL frische DMEM mit 10 % FBS / 1 % Penicillin/Streptomycin.
    Hinweis: Bei diesem Schritt 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochlorid (DGJ) oder 1-Deoxynojirimycin-Hydrochlorid (DNJ) möglicherweise hinzugefügt dem Kulturmedium wo bestimmt (eine wässrige Stammlösung von 10 mM zu verwenden, um eine Endkonzentration von 20 µM zu erhalten DGJ und DNJ ). Frisch DGJ oder DNJ wurde 42 h nach Plasmid Transfektion hinzugefügt.

4. Handy-Ernte und α-Galaktosidase A oder saure α-Glucosidase Aktivitätsmessung

  1. Zellernte
    1. Am Tag der Ernte entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie sorgfältig die Zellen 2 Mal mit PBS mit Ca2 + und Mg2 +.
      Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, weil DGJ und DNJ potente Inhibitoren der α-Galaktosidase und α-Glucosidase sind und gebliebene würde den Test ungültig.
    2. Fügen Sie 200 µL deionisiertes Wasser direkt auf die Zellen. Spülen Sie die Zellen aus der Platte und auf eine 1,5 mL Reaktionsgefäß übertragen.
  2. Homogenisierung durch Einfrieren und Auftauen
    1. Setzen Sie die Proben in einem geeigneten Schaum Rack und Wirbel für 5 s, um die Lyse effizienter zu gestalten. Setzen Sie die Proben abwechselnd in flüssigem Stickstoff für 10 s und in einem Wasserbad von Raumtemperatur bis das Auftauen war komplett (5 min).
    2. Wiederholen Sie diesen Vorgang 5 Mal und dann drehen Sie die Proben 5 min bei 10.000 x g.
Bewahren Sie den Überstand und Pipette in ein neues Reaktionsgefäß.
  • Protein-Konzentrationsbestimmung mit Bicinchoninic Säure (BCA) assay
    1. Zubereiten einer frischen Röhre für jede Probe mit 40 µL entionisiertem H2O und 10 µL der Probe. Lösung durch Vortexen kurz mischen und 10 µL in einen Hohlraum einer 96-well-Platte (jede Probe in dreifacher Ausfertigung) zu übertragen. Verdünnen Sie eine Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung 2 mg/mL entionisiertem H2O wie folgt zu einer Standardkurve: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
    2. Starten die Reaktion durch Zugabe von 200 µL des BCA Reagenz (Reagenz A und Reagenz B gemischt im Verhältnis 50: 1) und inkubieren Sie für 1 h im Dunkeln bei 37 ° C unter leichte Erregung auf einem Orbitalschüttler (300 u/min). Messung der Extinktion bei 560 nm in einem Teller-Reader.
      Hinweis: Die Proben enthalten in der Regel zwischen 1 und 1,5 µg Protein pro Mikroliter.
  • Enzym-Aktivitätsmessung mit künstlichen 4-Methylumbelliferyl-Substraten (4-Becher)
    1. Verdünnen Sie die berechnete Menge von jeder Probe und Pipettieren in frischen 1,5 mL Reaktionsgefäße auf 0,05 (für α-Galaktosidase A) oder (für saure α-Glucosidase) 0,5 µg Protein/µL Lösungen zu erhalten. Wirbel auch die Proben für 5 s wieder und Pipettieren 10 µL dieser Verdünnung in einem 96 Platte (jede Probe in zweifacher Ausfertigung).
    2. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 20 µL der jeweiligen Substrat-Lösung:
      Für α-Galaktosidase A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-Galactopyranoside (4-MU-gal) in 0,06 M Phosphatpuffer Citrat, pH 4,7.
      Für saure α-Glucosidase: 2 mM 4-Methylumbelliferyl α-D-Glucopyranoside (4-MU-Glu) in 0,025 M Natriumacetat, pH 4.0.
    3. Inkubieren Sie die Enzymreaktionen für 1 h im Dunkeln bei 37 ° C unter leichte Erregung auf einem Orbitalschüttler (300 u/min). Beenden Sie die Reaktion durch die Zugabe von 200 µL von 1,0 M, pH 10,5 eingestellte Glycin-NaOH Puffer.
    4. Bereiten Sie eine Standardkurve des 4-Methylumbelliferone (4-MU) aus einem 0,01 mg/mL bestand wie folgt:
      100 µL H2O / Nein 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; H2O / 100 µL 4-MU, Pipettieren 10 µL jeder Verdünnung in den 96 Brunnen Platte (in Duplikate) und jedes gut 200 µL des Puffers 1,0 M Glycin-NaOH hinzufügen, um die Lautstärke oder pH.
    5. Maßnahme der Enzym-Aktivität in einem Fluoreszenz-Reader ausgestattet mit dem entsprechenden Filter-Set und analysieren die Daten mit Hilfe der entsprechenden Software für die Fluoreszenz-Lesegerät.
      Hinweis: Beide 4-Tasse-Substrate werden auf 4-MU während der Belichtung zu α-Galaktosidase A oder saure α-Glucosidase reduziert. Veröffentlicht 4-MU ist ein Fluorochrom, die bei 360 und 465 nm als die Anregung und Emission Wellenlängen bzw. gemessen werden kann mit einer Mikrotestplatte Fluoreszenz-Reader.
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    Representative Results

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    Die Mutagenese-Verfahren
    Zur Bewertung der Effizienz der GLA -gen Mutagenese wurden Mutationen in einer der folgenden Kategorien eingestuft. Dieser Ansatz um Mutationen zu erzeugen ergab, dass etwa 66,5 % der GLA Mutationen im ersten Versuch erhalten wurden. Weitere 25 % konnte nach einem leicht modifizierten zweiten PCR abgerufen werden.

    Kategorie 1: Die Mutagenese PCR wirksam war beim ersten Versuch.

    Kategorie 2: Erste Mutagenese PCR fehlgeschlagen (keine Kolonien auf der Platte, keine eingefügten Mutation); Wiederholung mit der gleichen Primer festgelegt durch die Erhöhung der Anlasstemperatur bis zu 68 ° C wirksam war.

    Kategorie 3: Musste mehr Anstrengungen unternommen werden, um den gewünschten Klon ergeben (z.B., in der Regel eine oder mehrere neue Sätze Zündkapseln entworfen wurden).

    Α-Galaktosidase A und saure α-Glucosidase Enzym Aktivitätsmessung
    Enzym-Aktivität der verschiedenen mutierten Enzyme verzeichnete nach vorherige Inkubation der Transient transfizierten Zellen das Vorhandensein oder Fehlen eines PCs. Tabelle 1 bezieht sich auf die Ergebnisse für 3 α-Galaktosidase A und 3 saure α-Glucosidase-Mutationen. Daten werden als Absolute Werte (1) für die Substrat-Umsatz angezeigt (Nmol 4-MU * mg Protein-1* h-1) und (2) relative Werte normiert auf das Wildtyp-Enzym. Beide Ausdrücke sind hilfreich, da insgesamt Substrat Umsatz die Effizienz der Reaktion zeigt und die Empfindlichkeit des Systems, während die normalisierte Werte wichtig geben können auf die Wahrscheinlichkeit der Bösartigkeit der Mutation auf der einen Seite Hinweise und die Effizienz der eingesetzten PC-Behandlung auf der anderen Seite. Für die experimentelle Phase wurde die Arbeitsabläufe, die in Abbildung 1 dargestellten eingerichtet, die geplant einer 60 h Inkubationszeit mit der Verbindung (aus technischen Gründen, z.B. schnelle HEK293H Zellwachstum eingeführten Bedingungen). Obwohl es festgestellt hat, dass 10 µM war die ungefähre maximale erreichbare Plasmakonzentration DGJ14, das aktuelle Protokoll verwendet 20 µM als eine angemessene Konzentration für ein Screening für PC Reaktionsfähigkeit unterstützt zahlreiche früheren Arbeiten4,20,21,22,23. Darüber hinaus hat postuliert worden, dass höhere Plasmaspiegel24erreichbar.

    Figure 1
    Abbildung 1 : Ablauf der Arbeiten der in-vitro- Enzym-Aktivität messen. (A) die Zeitachse des Experiments zeigt eine 90 h Zelle Kultur Anstrengung mit relativ wenig hands-on-Zeit zu den angegebenen Zeitpunkten erforderlich. (B) repräsentative Plasmid-Vektoren-pcDNA3.1 mit Wildtyp-Cds von GLA und GAA werden angezeigt. GLA und GAA Wildtyp-Plasmide und Plasmide einschließlich der jeweiligen eingefügten Mutation des Interesses wurden verwendet, um vorübergehend transfizieren HEK293H Zellen überzogen in 24-well-Format. Nach einer Zeit um die Zellen der jeweiligen Genprodukte zu synthetisieren und ermöglichen Enzym Verarbeitung, lysosomalen Transport und PC Action zu ermöglichen die Zellen lysiert wurden und in einem Fluoreszenz-Platte-Reader gemessen und mit der entsprechenden Software analysiert. C: Zelle Morphologie und Wachstum-Status der HEK293H Zellen werden gezeigt, über den zeitlichen Verlauf des Experiments. Skalieren von Balken = 100 µm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

    in-vitro-Enzym-Aktivität
    GLA Native 20 ΜM DGJ
    Mutation (AA) Nmol 4-Becher-gal/mg/h (Mittelwert) % bedeutet (±SD, N) Nmol 4-Becher-gal/mg/h (Mittelwert) % bedeutet (±SD, N) Bedeutung
    p.A143T 2384.7 29.2 (±2.6, 5) 4223.0 52,0 (±4.4, 5) ***
    p.A156V 379,2 4.3 (±. 8, 5) 1437.5 16,3 (±1.3, 5) ****
    p.R301Q 777.4 8,8 (±1.1, 5) 3002.6 44,2 (±3.6, 5) ****
    GAA Native 20 ΜM DNJ
    Mutation (AA) Nmol 4-Becher-Glu/mg/h (Mittelwert) % bedeutet (±SD, N) Nmol 4-Becher-Glu/mg/h (Mittelwert) % bedeutet (±SD, N) Bedeutung
    p.Y455F 41,1 5.4 (±. 4, 5) 246,6 31,4 (±2.8, 5) ***
    p.P545L 65,7 6.6 (±. 4, 5) 166,5 16.7 (±1.5, 5) **
    p.L552P 0.0 0.0 (±. 2, 5) 104,3 10.4 (±1.4, 5) ***

    Tabelle 1: Enzym-Aktivität der α-Galaktosidase A und saure α-Glucosidase. Die Tabelle zeigt repräsentative Ergebnisse für 3 α-Galaktosidase A und 3 saure α-Glucosidase-Mutanten mit und ohne PCs DGJ oder DNJ. Absolute Enzym Aktivitätsdaten wurde für endogenen Enzymaktivität der HEK293H Zellen korrigiert. Um endogenen Enzymaktivität zu bewerten, wurden die Zellen mit einem pcDNA3.1 leere Vektor transfected. Die Werte wurden 97,5 Nmol 4-MU * mg Protein-1* h-1 für α-Galaktosidase A und 41.6 Nmol 4-MU * mg Protein-1* h-1 für saure α-Glucosidase, beziehungsweise; Enzym-Aktivität-Werte wurden mit Wildtyp-Enzym aus entsprechenden Untersuchungen, die die Abweichungen der relativen Werte zwischen den verschiedenen Mutanten erklärt normalisiert.Nach 5 unabhängige Zelle Kultur Experimenten (N = 5), jeweils in technischen Duplikate durchgeführt, die Standardabweichung durfte nicht sein > 15 % des Mittelwerts. Verhältnis T-Tests wurden zur Berechnung der Differenz zwischen unbehandelten und behandelten PC Enzym.
    * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005, *** p < 0,001

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    Discussion

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    Die hierin beschriebene Protokoll liefert robuste Ergebnisse für Enzym Schadensfeststellung in erbliche lysosomale Krankheiten des Stoffwechsels. Diese Handschrift ist eine Änderung des Protokolls früheren15veröffentlicht. Die wichtigsten Änderungen betreffen Stringenz (d. h., in den Prozess der mutierten Vektor Konstrukt Vorbereitung), Standardisierung von der Zelle Kultur Protokoll (d.h., HEK293H Zelle Wartungs- und Transfektion Bedingungen) und die hohe Anzahl der experimentellen Wiederholungen (mindestens 5), die hoch auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beigetragen. Insgesamt wurden beide Zielgene für Mutagenese leicht zugänglich und eine Vielzahl von Mutationen kann parallel montiert werden. Eine relativ hohe Signal-/Rauschverhältnis erreichte man bedenkt, dass körpereigene Enzym-Aktivität in den HEK293H Zellen eine vernachlässigbare 1/50 (α-Galaktosidase A) und 1/20 (saure α-Glucosidase) des stark exprimierten Wildtyp-Gens. So gibt es eine hervorragende Auflösung zwischen Wildtyp und Mutanten Enzym. Es sei darauf hingewiesen, dass eine unterschiedliche Anzahl von Gesamt-Protein für die Aktivität Assay der beiden Enzyme angewendet wurde (0,5 und 5 µg bzw.), denn saure α-Glucosidase Aktivität eine Größenordnung niedriger als die von α-Galaktosidase A war.

    Wie bereits erwähnt, sind Assay Parameter oft umstritten, da viele Labore haben ihre eigenen Tests untersuchen lysosomale Glycosidases entwickelt. Die Systeme können in Zelltyp, Plasmid-Vektor-Design, Anbaubedingungen und Zeitraum der Arzneimittelexposition nur um ein paar der zahlreichen Parameter zu nennen unterscheiden. Eine kürzlich veröffentlichte Metaanalyse für Morbus Fabry gezeigt, dass die Enzym-Aktivität Aufnahmen (mit und ohne PC) transfizierten Zellen Modelle (z.B.HEK293, COS-7) wurde weitgehend im Einklang mit den Ergebnissen von Patienten gewonnenen Zellen ( vor allem Lymphozyten oder Fibroblasten) in Bezug auf die Frage, ob eine Mutation ist empfänglich für den PC-24. Frühere Meldungen aus dem direkten Vergleich Patienten gewonnenen Zellen und Transfektion Modelle gezeigt, dass Überexpression Systeme die Situation in Patientenzellen widerspiegeln, ohne Kompromisse bei der Schlussfolgerung13,14. Es kann daher festzustellen, dass, unabhängig von bestimmten Protokolls, die Ergebnisse von verschiedenen Autoren wurde nicht geändert, durch die verschiedenen zellulären Systemen, obwohl Responder Definitionen unterschiedlich sein können. Die derzeitige Definition für eine entsprechende Mutation ist 20 % relative Enzym-Aktivität zu erhöhen und absolute Enzym-Aktivität Erhöhung um 5 % im Vergleich zum Wildtyp-Enzym nach Inkubation mit 20 µM DGJ für 60 h. Eine umfassende Datenbank, FabryCEP, ermöglicht den Vergleich der Ergebnisse von experimentellen Ansätzen für Hunderte von α-Galaktosidase Mutanten25.

    Ob diese Kriterien ausreichend klinische Vorteile der DGJ und DNJ Vorhersagen sind unklar, da das Niveau der Tätigkeit erforderlichen Symptomen der Krankheit zu verhindern umstritten ist. Eine frühere Studie vorgeschlagen, dass 10 bis 15 % der Restaktivität für das System ordnungsgemäß26ausreichen könnte. Jedoch wurde in einem kürzlich veröffentlichten Bericht aus einer klinischen Studie der Phase 2 für DGJ eine Erhöhung der Aktivität von 1 % als potenziell vorteilhaft für den Patienten als Grundlinie Tätigkeit weniger als 1 % der normalen27war. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass Patienten, die voraussichtlich auf PCs durch die Responder-Definition von ≥20 % relative Zunahme und ≥3 % absolute Erhöhung der Wildtyp α-Galaktosidase eine Aktivität in den HEK293H Zellen nach Inkubation mit 10 µM reagieren eigentlich DGJ abgeleitet klinischer Nutzen Krankheit Stabilisierung oder sogar Verbesserung von Nieren- und kardiale Parameter28. DGJ bereits von der FDA und der Europäischen Kommission als eine Monotherapie für Morbus Fabry genehmigt hat, erscheint natürlich PCs wie DNJ und die Ableitung N-Butyl-DNJ in Morbus Pompe, anders zu sein. Ein Monotherapeutical Ansatz mit DNJ wurde während einer klinischen Studie der Phase II aufgrund der schweren Nebenwirkungen bei einigen Patienten29beendet. PC-Behandlung in Kombination mit genehmigten ERT zeigten jedoch deutlich bessere Ergebnisse in Bezug auf Krankheit Substrat (Glykogen) Reduktion im Vergleich zu den ERT Monotherapie30.

    Wir empfehlen, dass der vorgestellte Ansatz auf andere LSDs und anderen PCs wie Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff und GM1-Gangliosidose verlängert werden kann, aber dies möglicherweise nicht in bestimmten Fällen funktioniert, wenn zum Beispiel das Signal/Rauschverhältnis des Systems ausreicht. Darauf sollte geachtet werden, eine geeignete Zelle Störung Methode zur Enzym-Aktivität Entschlossenheit, eine Zelle lysate Vorbereitung auswählen, da der Zusatz von Reinigungsmitteln in der Lyse Puffer Membrane-springen Enzyme wie Glucocerebrosidase in hindeuten könnten Gaucher-Krankheit während ähnliche Mengen von Waschmittel andere Enzyme schädigen können. Für α-Galaktosidase A sollte eine Anwendung von Ultraschall-basierte Zelle Störung Methode vermieden werden.

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    Disclosures

    Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

    Acknowledgments

    Die Autoren möchten Mandy Loebert und Tina Czajka für hervorragende technische Unterstützung zu bestätigen. Wir danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) für Sprache bearbeiten.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Cardiff University. http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
    2. Meiji Pharmaceutical University. http://fabry-database.org (2017).
    3. Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
    4. Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
    5. Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
    6. Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
    7. Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
    8. Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
    9. Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
    10. Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
    11. Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
    12. Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
    13. Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
    14. Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
    15. Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
    16. Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
    17. https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
    18. Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
    19. http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
    20. Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
    21. Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
    22. Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
    23. Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
    24. Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
    25. Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
    26. Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
    27. Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
    28. Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
    29. Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
    30. Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
    <em>In-vitro-</em> Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe
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    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).More

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

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