Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

doi: 10.3791/56550 Published: December 20, 2017

Summary

C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.

Abstract

L'uso della medicina personalizzata per il trattamento di malattie monogeniche rare come disturbi connessi all'accumulo lisosomiale (LSD) è sfidato da disegni di trial clinici complessi, costi elevati e basso numero di pazienti. Centinaia di alleli mutanti è implicati nella maggior parte delle malattie da accumulo lisosomiale. Le malattie sono in genere classificate in 2 o 3 tipi clinici differenti secondo la severità. Inoltre, caratterizzazione molecolare del genotipo può aiutare a predire gli esiti clinici e informare la cura del paziente. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un saggio di cultura cellulare semplice basato su cellule HEK293H heterologously che sovraesprimono le mutazioni identificate nella malattia di Fabry e Pompe. Un dosaggio simile recentemente è stato introdotto come un test preclinico per identificare mutazioni favorevoli per la terapia Chaperone farmacologici (PCT) nella malattia di Fabry. Questo manoscritto descrive un'analisi di cultura cellulare modificato che consente la rapida valutazione fenotipica delle varianti alleliche nella malattia di Fabry e Pompe per identificare i pazienti eleggibili per PCT e può essere di aiuto nello sviluppo del romanzo pharmacochaperones.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ci sono oltre una dozzina i disordini da accumulo lisosomiale (LSD) legati alla disfunzione di glycosidase come conseguenza delle mutazioni di gene primario. In Fabry (OMIM #301500) e malattia di Pompe (OMIM #232300), più di 500 e 200 mutazioni di senso sbagliato sono stati segnalati1,2,3 , rispettivamente, che corrisponde a circa il 60% del conteggio totale mutazione. Numerose nuove varianti del gene ancora stanno identificandi, molte delle quali hanno ignoto significato. I vasti studi biochimici hanno rivelato che alcuni genotipi non conducono ad una completa perdita di funzione del gene GLA (OMIM * 300644) nella malattia di Fabry, ma causare l'enzima corrispondente a non riuscire a raggiungere uno stato termodinamicamente favorito pieghevole4 . Ciò provoca ritenzione di ER e degradazione prematura dell'enzima altrimenti funzionale. Simili conclusioni sono state tratte in altre malattie da accumulo lisosomiale, tra cui Pompe malattia5. Inoltre, caratterizzazione molecolare delle varianti di enzima può facilitare l'interpretazione clinica delle mutazioni al momento della diagnosi6, suggerendo che la progressione di LSD è un processo individuale sulla base della natura della mutazione. Di conseguenza, la classificazione convenzionale in diversi tipi clinici in genere 2 o 3 dovrebbe essere rivalutata al fine di ottimizzare la consulenza clinica e le decisioni terapeutiche.

Enzimatica sostitutiva (ERT) è disponibile per entrambe le malattie. ERT, tuttavia, ha limitato l'efficacia nei tessuti/organi colpiti come il cervello e muscolo scheletrico. Inoltre, ERT può suscitare una risposta immunogenica che compromette i suoi benefici terapeutici. Chaperoni farmacologici (pz) sono un'alternativa attraente di trattamento per i pazienti con mutazioni reattive cosiddette. Pz servire come un'impalcatura molecolare per la piegatura della proteina corretta e stabilizzazione che a sua volta impedisce la ritenzione del reticolo endoplasmatico (ER) ed ER-collegata di degradazione dell'enzima. Inoltre, il PC può essere somministrato per via orale e sono potenzialmente in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. Di conseguenza, PCT potrebbe essere un'opzione più praticabile per il trattamento di pazienti con determinati genotipi. Per un'ampia rassegna su applicazione PC nelle malattie da accumulo lisosomiale, consultare l'eccellente recensione di Parenti7.

La scoperta di centinaia di malattia che causa gli alleli del mutante sfida test anti-droga pre-clinica e richiede una valutazione semplice, veloce e altamente standardizzata dei pazienti suscettibili di un approccio di medicina personalizzata. Al fine di valutare gli effetti nocivi delle mutazioni di gene di LSD e di testare le mutazioni candidato per predire i pazienti suscettibili per PCT, è stato un sistema altamente standardizzati over-espressione in cellule di HEK293H che consente la misurazione dell'attività dell'enzima veloce e affidabile sviluppato. Sistemi simili di sovra-espressione precedentemente sono stati descritti per la malattia di Fabry e Pompe utilizzando COS-78,9,10,11, HeLa cellule12o HEK29313 ,14,15,16 celle per il gene di glicosidasi.

Un metodo molto simile è stato brevettato anche come un "metodo per predire la risposta al trattamento farmacologico Chaperone di malattie"17 che indica la pertinenza di una cella cultura sistema in grado di essere integrati nella pratica clinica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. preparazione di costrutti pcDNA3.1/GLA e pcDNA3.1/GAA mutante

Nota: Le strategie di clonazione per il GLA e GAA codifica di sequenze (cds) sono stati segnalati precedenti15,18.

  1. Mutagenesi sito-diretta mediante mutagenesi sito-diretta
    1. Uso il riferimento sequenze NM_000169.2 e NM_000152.4 come modelli per la mutagenesi dei geni GLA e GAA , rispettivamente. Avere un set di primer gratuito sale ad alta purezza (25-37-mers) sintetizzato da un provider commerciale, con gli iniettori di senso e antisenso che trasportano uno delle modifiche rispettiva sequenza centrale alla loro lunghezza di introdurre individualmente la mutazione. Utilizzare lo strumento di disegno di primer gratuito per sostenere il disegno di primer19.
    2. Per la miscela di reazione, utilizzare le condizioni standard per la soluzione di reazione e le condizioni PCR fornite dal produttore.
      1. Mix 5 µ l di tampone di reazione, 10 10x ng modello double-stranded del DNA del plasmide (pcDNA3.1/GLA o pcDNA3.1/GAA), 125 ng di ogni primer, 1 µ l della miscela dei dNTP fornito, 3 µ l di reagente di DMSO in un volume adeguato di acqua deionizzata (volume di reazione finale : 50 Μ L). Infine, aggiungere 2,5 U di DNA polimerasi e Miscelare pipettando su e giù. Come controllo negativo, portare con sé un campione no-primer.
    3. Avviare la PCR utilizzando il seguente programma: passo 1: 95 ° C per 1 min, passo 2: 95 ° C per 50 s, passo 3: 60 ° C per 50 s, passo 4: 68 ° C per 8 min, ripetere il passaggio 2-4 18 volte e passo 5: 68 ° C per 10 min.
      1. Dopo la PCR, aggiungere 1 µ l di Dpnho degli enzimi di limitazione (10 U / µ l) e ulteriormente Incubare la fiala di reazione a 37 ° C per 1 h.
  2. Trasformazione e lo Screening per il Clone desiderato
    1. Trasformare un'aliquota di cellule ultracompetent in conformità con le raccomandazioni del produttore. Utilizzo medio SOC (tryptone 2% (p/v), lievito estratto di 0,5% (p/v), 10mm di NaCl, KCl 2.5 mM, sterilizzare a 121 ° C e quindi aggiungere soluzioni sterili filtrato di MgCl2 e il glucosio fino a concentrazioni finali di 10 e 20 mM, rispettivamente) invece del produttore medio. Dopo la procedura, piastra 250 µ l della mutagenesi di esempio su un LB piastra contenente 100 ampicillina di µ g/mL e incubare a 37 ° C per 18 ore.
    2. Assicurare che il numero dei transformants è > 10 e la reazione produce almeno tre volte come molte colonie come la reazione di controllo no-primer, per esempio, usando un piatto luminoso per facilitare il conteggio di Colonia. Poi scegli 3 colonie e preparare 3ml culture durante la notte nel mezzo di libbra di brodo.
    3. Il giorno successivo, svolgere Miniprep con un kit standard e analizzare l'intera sequenza usando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) e BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primer tramite standard Sanger sequenziamento.
    4. Utilizzare uno strumento adatto biologia molecolare per analizzare la sequenza. Quando viene rilevata la mutazione desiderata e nessun ulteriore sequenza anomalia rispetto al NM_000169.2 (α-galattosidasi A) o NM_000152.4 (α-glucosidasi acida) è visto, selezionare il clone per la purificazione del plasmide di transfezione-grado.
    5. Determinare la purezza del DNA misurando l'assorbanza a uno spettrofotometro.
      Nota: Consenti solo i preparativi che producono una purezza del plasmide con un rapporto di assorbanza 260/280 di > 1.8 per cella esperimenti della coltura.

2. coltivazione di cellule HEK293H

  1. Mantenere le cellule HEK293H in alto glucosio (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina. Mantenere le cellule un incubatore a 37 ° C sotto un 5% CO2 ambiente di pluritubulare.
  2. Coltivare le cellule ad una densità di 80-90%.
  3. Il mezzo di aspirare e lavare una volta utilizzando fosfato tampone salino (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +.
  4. Passaggio con l'aggiunta di 0.05% tripsina-EDTA e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO2.
  5. Dividere le celle 01:15 in mezzo fresco e il seme in una nuova staffa T75 per mantenere la cultura permanente. Non usare celle con più di 25 passaggi.

3. pcDNA3.1/GLA e pcDNA3.1/GAA plasmide transfezione e trattamento di HEK293H

  1. 24 h prima la transfezione, lavare le cellule HEK293H in un matraccio di cultura T75 cella una volta con PBS con Ca2 +, Mg2 +. Raccogliere le cellule con 0,05% tripsina-EDTA come indicato sopra e cellule5 seme 1.5 x 10 nelle cavità di una piastra di coltura ben 24 utilizzando 500 µ l DMEM supplementato con 10% FBS senza antibiotici.
  2. Eseguire un protocollo di transfezione secondo il manuale del produttore. In genere, è possibile utilizzare una miscela di 1 µ g di DNA plasmidico e 2,5 µ l di reagente di transfezione in 100 µ l di DMEM privo di siero. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e aggiungere alle celle in modo sospensione da allora in poi.
  3. Rimuovere il supporto contenente il reagente di transfezione dopo un periodo di 4 h a 37 °C/5% CO2 e aggiungere 500 µ l di fresco DMEM con 10% FBS / 1% di penicillina/streptomicina.
    Nota: Durante questa fase, 1-Deoxygalactonojirimycin cloridrato (DGJ) o 1-Deoxynojirimycin cloridrato (DNJ) potrebbe essere aggiunto al terreno di coltura dove previsto (utilizzare una soluzione acquosa di stock di 10 mM per ottenere una concentrazione finale di 20 µM DGJ e DNJ ). Fresco DGJ o DNJ è stato aggiunto 42h dopo trasfezione di plasmide.

4. cellula raccolto e α-galattosidasi A o la misurazione dell'attività α-glucosidasi acida

  1. Colture di cellule
    1. Il giorno della raccolta, rimuovere le cellule dall'incubatrice ed aspirare il mezzo. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con PBS con Ca2 + e Mg2 +.
      Nota: Questo passaggio è fondamentale perché DGJ e DNJ sono potenti inibitori della α-galattosidasi e α-glucosidasi, rispettivamente, ed eventuali rimanenze invaliderebbe il test.
    2. Aggiungere 200 µ l di acqua deionizzata direttamente sopra le cellule. Sciacquare le cellule dalla piastra e trasferirli in una provetta di reazione da 1,5 mL.
  2. Omogeneizzazione di congelamento e scongelamento
    1. Mettere i campioni in un rack di schiuma appropriata e vortexare per 5 s per rendere più efficiente la lisi. Mettere i campioni alternati in azoto liquido per 10 s e in un bagno di acqua temperatura ambiente fino a quando lo scongelamento era completa (5 min).
    2. Ripetere questa procedura 5 volte e poi girare i campioni per 5 min a 10.000 x g.
Conservare il surnatante e pipetta in un nuovo tubo di reazione.
  • Determinazione di concentrazione nella proteina usando bicinconinico acido (BCA) analisi
    1. Preparare una nuova provetta per ciascun campione contenente 40 µ l di deionizzata H2O e aggiungere 10 µ l di campione. Mescolare la soluzione nel Vortex brevemente e trasferire 10 µ l in una cavità di una piastra ben 96 (ogni campione in triplice copia). Diluire una soluzione madre di albumina di siero bovino (BSA) 2 mg/mL in deionizzata di H2O come indicato di seguito per ottenere una curva standard: 50 µ l di H2O/50 BSA µ l; 60 µ l H2O/40 µ l BSA; µ L 70 H2O/30 µ l BSA; BSA a 80 µ l H2O/20 µ l; µ L 90 H2O/10 µ l BSA; 100 µ l di H2O.
    2. Iniziare la reazione aggiungendo 200 µ l di reagente BCA (Reagente A e il reagente B mescolati ad un rapporto di 50: 1) e incubare per 1 h al buio a 37 ° C sotto agitazione leggera su agitatore orbitale (300 giri/min). Misurare l'assorbanza a 560 nm in un lettore di piastra.
      Nota: I campioni contengono in genere tra 1 e 1,5 µ g di proteine per µ l.
  • Misurazione dell'attività enzimatica con substrati artificiali 4-Methylumbelliferyl (4-MUG)
    1. Diluire la quantità calcolata di ogni campione e dispensare nelle provette di reazione fresco 1,5 mL per ottenere 0,5 (per α-glucosidasi acida) o 0.05 (per α-galattosidasi A) µ g proteine / µ l soluzioni. Vortice i campioni per 5 s nuovo e dispensare 10 µ l di questa diluizione in un 96 ben piatto (ogni campione in duplicato).
    2. Iniziare la reazione aggiungendo 20 µ l di soluzione substrato rispettivi:
      Per α-galattosidasi r: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galattopiranoside (4-MU-gal) in tampone citrato di 0,06 M fosfato, pH 4,7.
      Per α-glucosidasi acida: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) in acetato di sodio 0,025 M, pH 4,0.
    3. Incubare le reazioni enzimatiche per 1 h al buio a 37 ° C sotto agitazione leggera su agitatore orbitale (300 giri/min). Terminare la reazione con l'aggiunta di 200 µ l di 1,0 M, tampone a pH 10,5 regolato glicina-NaOH.
    4. Preparare una curva standard di 4-methylumbelliferone (4-MU) da uno stock di 0,01 mg/mL come segue:
      100 µ l di H2O / no 4-MU; 80 µ l di H2O / 20 µ l 4-MU; 60 µ l H2O / 40 µ l 4-MU; 40 µ l di H2O / 60 µ l 4-MU; 20 µ l H2O / 80 µ l 4-MU; No di H2O / 100 µ l 4-MU, dispensare 10 µ l di ciascuna diluizione nel pozzo 96 piastra (in duplicato) e aggiungere 200 µ l di buffer di glicina-NaOH 1,0 M in ciascun pozzetto al fine di regolare il volume e il pH.
    5. Misura l'attività dell'enzima in un lettore di fluorescenza con il set di filtri appropriati e analizzare i dati utilizzando il software appropriato per la periferica del lettore di fluorescenza.
      Nota: Entrambi i substrati 4-MUG sono ridotti a 4-MU durante l'esposizione al α-galattosidasi A o α-glucosidasi acida. Rilasciato 4-MU è un fluorocromo, che può essere misurato a 360 e 465 nm come lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenza.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    La procedura di mutagenesi
    Per valutare l'efficienza di mutagenesi gene GLA , le mutazioni sono state classificate in una delle categorie seguenti. Questo approccio per generare mutazioni ha rivelato che circa il 66,5% delle mutazioni GLA sono stati ottenuti nel primo tentativo. Un ulteriore 25% potrebbe essere ottenuto dopo una PCR seconda leggermente modificata.

    Categoria 1: La mutagenesi PCR era efficace al primo tentativo.

    Categoria 2: Prima mutagenesi PCR non è riuscito (senza colonie sulla piastra, nessuna mutazione inserita); ripetizione utilizzando il primer stesso impostata aumentando la temperatura di ricottura fino a 68 ° C era efficace.

    Categoria 3: Uno sforzo maggiore doveva essere intrapresa per produrre il clone desiderato (ad esempio, in genere uno o più nuovi set di primers sono stati progettati).

    Α-galattosidasi A e misurazione dell'attività dell'enzima α-glucosidasi acida
    L'attività enzimatica degli enzimi mutanti differenti è stato registrato dopo precedente incubazione delle cellule transitoriamente transfected in presenza o in assenza di un PC. Tabella 1 si riferisce ai risultati per 3 mutazioni di α-glucosidasi acida e 3 α-galattosidasi A. I dati vengono visualizzati come (1) valori assoluti per il fatturato di substrato (nmol 4-MU * mg proteina-1* h-1) e come (2) relativi valori normalizzati per l'enzima wild-type. Entrambe le espressioni sono utili, poiché il fatturato totale substrato illustra l'efficienza della reazione e la sensibilità del sistema, mentre i valori normalizzati possono dare importanti suggerimenti per la probabilità di malignità della mutazione da un lato e il efficienza del trattamento PC applicato d'altra parte. Per la fase sperimentale, il flusso di lavoro descritto in Figura 1 è stato istituito, quale previsto un periodo di incubazione di 60 h con il composto (a causa di motivi tecnici, ad esempio veloce crescita delle cellule del HEK293H sotto l'introdotto condizioni). Anche se è stato dichiarato che 10 µM era la concentrazione approssimativa plasmatica massima realizzabile per DGJ14, l'attuale protocollo utilizza 20 µM come una concentrazione ragionevole ai fini di uno screening per la reattività del PC come supportato da numerose all'inizio lavora4,20,21,22,23. Inoltre, è stato postulato che i livelli elevati del plasma possono essere raggiunto24.

    Figure 1
    Figura 1 : Work flow della in vitro misurazione dell'attività enzimatica. (A) la timeline dell'esperimento mostra uno sforzo di cultura cellulare 90 h con relativamente poco hands-on-tempo richiesto presso i punti di tempo indicato. (B) pcDNA3.1 di vettori rappresentativi plasmide contenente il CD di tipo selvaggio di GLA e GAA sono mostrati. GLA e GAA plasmidi wild-type e plasmidi compreso la mutazione inserita rispettiva di interesse sono stati usati a transitoriamente transfect HEK293H cellule placcate in 24 ben formato. Dopo un periodo per permettere alle cellule di sintetizzare i prodotti del gene rispettivi e consentire per enzima elaborazione, trasporto lisosomiale e azione di PC, le cellule sono state lisate e misurata in un lettore di fluorescenza e analizzati utilizzando il rispettivo software. C: cellula stato morfologia e la crescita delle cellule del HEK293H sono mostrati durante il corso di tempo dell'esperimento. Scala bar = 100 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    in vitro l'attività dell'enzima
    GLA nativo 20 ΜM DGJ
    mutazione (AA) nmol 4-MUG-gal/mg/h (media) % media (± DS, N) nmol 4-MUG-gal/mg/h (media) % media (± DS, N) significato
    p.A143T 2384.7 29.2 (±2.6, 5) 4223.0 52.0 (±4.4, 5) ***
    p.A156V 379.2 4.3 (±. 8, 5) 1437.5 16.3 (±1.3, 5) ****
    p.R301Q 777.4 8.8 (±1.1, 5) 3002.6 44.2 (± 3.6, 5) ****
    GAA nativo DNJ 20 ΜM
    mutazione (AA) nmol 4-MUG-glu/mg/h (media) % media (± DS, N) nmol 4-MUG-glu/mg/h (media) % media (± DS, N) significato
    p.Y455F 41,1 5.4 (±. 4, 5) 246,6 31,4 (±2.8, 5) ***
    p.P545L 65,7 6.6 (±. 4, 5) 166,5 16,7 (± 1.5, 5) **
    p.L552P 0.0 0.0 (±. 2, 5) 104,3 10.4 (±1.4, 5) ***

    Tabella 1: l'attività enzimatica di α-glucosidasi acida e di α-galattosidasi A. La tabella mostra i risultati rappresentativi per 3 α-galattosidasi A e 3 α-glucosidasi acida mutanti con e senza il pz DGJ o DNJ. Dati relativi all'attività enzimatica assoluto sono stato corretto per l'attività enzimatica endogena delle cellule HEK293H. Per valutare l'attività dell'enzima endogeno, le cellule transfected con un vettore vuoto di pcDNA3.1. I valori erano 97,5 nmol 4-MU * mg proteina-1* h-1 α-galattosidasi A e 41,6 nmol 4-MU * mg proteina-1* h-1 per α-glucosidasi acida, rispettivamente; i valori di attività dell'enzima sono stati normalizzati al enzima wild-type da esperimenti corrispondenti, che spiega le deviazioni dei valori relativi tra i diversi mutanti.Dopo 5 esperimenti della coltura cellulare indipendente (N = 5), ciascuno effettuata in tecnici duplicati, la deviazione standard non è stato permesso essere > 15% della media. Rapporto T-test sono stati utilizzati per calcolare la differenza tra enzima non trattato e trattati con PC.
    * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,005, * * * p < 0.001

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Il protocollo descritto nel presente documento fornisce risultati affidabili per la valutazione dei danni degli enzimi in malattie lisosomiali ereditarie del metabolismo. Questo manoscritto è che un emendamento al protocollo pubblicato precedenti15. Le modifiche più cruciale coinvolgono stringenza (cioè, nel processo di preparazione del costrutto di mutante vettoriale), standardizzazione del protocollo di cultura di cellule (cioè, condizioni di manutenzione e di transfezione delle cellule HEK293H) e l'alta numero di ripetizioni sperimentale (almeno 5), che ha fortemente contribuito alla riproducibilità dei risultati. Complessivamente, entrambi i geni bersaglio sono stati facilmente accessibili per mutagenesi e una molteplicità di mutazioni possa essere assemblata in parallelo. Un rapporto segnale/rumore relativamente alto è stato realizzato considerando che l'attività enzimatica endogena all'interno delle cellule di HEK293H era un trascurabile 1/50 (α-galattosidasi A) e 1/20 (α-glucosidasi acida) del gene sovraespressa wild-type. Così, c'è un'eccellente risoluzione tra wild type e mutanti dell'enzima. Dovrebbe essere notato che una diversa quantità di proteine totali è stata applicata per l'analisi di attività di entrambi gli enzimi (0,5 e 5 µ g, rispettivamente), perché l'attività α-glucosidasi acida era un ordine di grandezza inferiore a quello di α-galattosidasi A.

    Come detto sopra, parametri di analisi sono spesso controversi, poiché molti laboratori hanno sviluppato i propri saggi per indagare lysosomal glicosidasi. I sistemi possono differire nel tipo di cellula, disegno vettore plasmidico, condizioni di coltivazione e periodo di esposizione della droga solo per citarne alcuni dei numerosi parametri. Una metanalisi recentemente pubblicata per la malattia di Fabry ha dimostrato che le registrazioni di attività enzimatica (con e senza PC) dei modelli di cellulari trasfettate (ad es., HEK293, COS-7) era in gran parte in conformità con i risultati ottenuti da cellule derivanti dal paziente ( per lo più linfociti o fibroblasti) per quanto riguarda la domanda, se una mutazione è reattiva al PC24. I rapporti precedenti confrontare direttamente le cellule derivate dal paziente e modelli di transfezione dimostrato che sovra-espressione sistemi riflettono la situazione in cellule di pazienti senza compromettere le conclusione13,14. Si può pertanto concludere che, indipendentemente dal protocollo particolare, i risultati ottenuti dai diversi autori non è stato modificato da diversi sistemi cellulari, anche se le definizioni di risponditore possono essere divergenti. La definizione corrente per una mutazione risponda è aumento di attività enzimatica relativa 20% e 5% aumento di attività enzimatica assoluta rispetto all'enzima wild-type dopo incubazione con 20 µM DGJ per 60 h. Un database completo, FabryCEP, consente il confronto dei risultati ottenuti da differenti approcci sperimentali per centinaia di α-galattosidasi mutanti25.

    Se questi criteri sono sufficienti per prevedere i benefici clinici di DGJ e DNJ rimane poco chiaro, poiché il livello di attività necessarie per impedire la malattia sintomatica è controverso. Uno studio precedente ha suggerito che 10-15% di attività residua potrebbe essere sufficiente per il sistema funzionare correttamente26. Tuttavia, in un rapporto pubblicato di recente da uno studio clinico di fase 2 per DGJ, un aumento di 1% di attività è stato ritenuto potenzialmente benefico per il paziente, quando l'attività basale era meno dell'1% del normale27. Risultati clinici recenti indicano che pazienti preveduti per rispondere ai PC nella definizione di risponditore di ≥ 20% aumento relativo e ≥ 3% aumento assoluto di tipo selvaggio α-galattosidasi un'attività in cellule HEK293H dopo incubazione con 10 µM DGJ effettivamente derivato beneficio clinico con stabilizzazione di malattia o addirittura miglioramento di parametri renali e cardiache28. Considerando che DGJ è già stato approvato dalla FDA e la Commissione europea come monoterapia per la malattia di Fabry, il corso di PC come DNJ e il derivato N-butilico-DNJ nella malattia di Pompe sembra essere diverso. Un approccio monotherapeutical con DNJ è stato terminato durante uno studio clinico di fase II a causa di eventi avversi gravi in alcuni dei pazienti29. Tuttavia, trattamento di PC in combinazione con ERT approvato ha mostrato risultati significativamente migliori per quanto riguarda la riduzione del substrato (glicogeno) di malattia rispetto alla monoterapia con ERT30.

    Suggeriamo che l'approccio presentato può essere esteso ad altre malattie da accumulo lisosomiale e altri PC come Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff e gangliosidosi GM1, ma questo potrebbe non funzionare in casi specifici, dove ad esempio il rapporto segnale/rumore del sistema è insufficiente. Cura dovrebbe essere presa per selezionare un metodo di rottura cellulare adeguata per preparare un lysate delle cellule per la determinazione dell'attività enzimatica, perché l'aggiunta di detergenti nel buffer di lisi potrebbe essere indicativo di enzimi di membrana-limita come glucocerebrosidasi nei Malattia di Gaucher mentre simili quantità di detersivo può danneggiare altri enzimi. Per α-galattosidasi A, un metodo di rottura cellulare basato su sonicazione dovrebbe essere evitato.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

    Acknowledgments

    Gli autori desidera ringraziare Mandy Loebert e Tina Czajka per supporto tecnico eccellente. Ringraziamo Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) per la lingua modifica Guida.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Cardiff University. http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
    2. Meiji Pharmaceutical University. http://fabry-database.org (2017).
    3. Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
    4. Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
    5. Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
    6. Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
    7. Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
    8. Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
    9. Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
    10. Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
    11. Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
    12. Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
    13. Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
    14. Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
    15. Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
    16. Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
    17. https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
    18. Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
    19. http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
    20. Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
    21. Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
    22. Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
    23. Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
    24. Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
    25. Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
    26. Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
    27. Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
    28. Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
    29. Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
    30. Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
    <em>In Vitro</em> Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).More

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter