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Medicine

생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

doi: 10.3791/56550 Published: December 20, 2017

Summary

전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

Abstract

Lysosomal 저장 장애 (LSDs) 같은 희귀 monogenic 질병을 치료 하는 맞춤된 의학의 사용은 복잡 한 임상 시험 디자인, 높은 비용 및 낮은 환자 수에 의해 도전을 했습니다. 수백 개의 돌연변이 체 대립 유전자는 LSDs의 대부분에 연루 됩니다. 질병은 일반적으로 심각도 따라 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 분류 됩니다. 또한, 유전자 형의 분자 특성 임상 결과 예측 하 고 환자 치료를 알릴 수 있습니다. 따라서, 우리는 heterologously-Fabry Pompe 질병에서 확인 된 돌연변이 표현 하는 HEK293H 세포에 따라 간단한 셀 문화 분석 결과를 개발 했다. 유사한 분석 결과 최근 Fabry 질병에 의무가 돌연변이 약리 보호자 치료 (에서 PCT)에 대 한 식별 하기 위해 전 임상 시험으로 도입 되었습니다. 이 원고는 PCT에 대 한 적격 환자 식별 Fabry Pompe 질병 유전자 이체의 신속한 phenotypic 평가 하 고 새로운 pharmacochaperones의 개발에 도움이 있습니다 개정된 셀 문화 분석 결과를 설명 합니다.

Introduction

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12 lysosomal 저장 장애 (LSDs) 기본 유전자 변이 결과로 glycosidase 장애에 관련 된 이상 있다. Fabry (OMIM #301500) 병과 Pompe (OMIM #232300),1,2,3 보고 되었습니다, 이상의 500와 200 missense 돌연변이에 각각,는 총 변이 수의 약 60%에 해당 합니다. 수많은 새로운 유전자 이체는 아직도 확인 되 고, 많은 알 수 없는 의미. 광범위 한 생 화 확 적인 연구 공개 완전 한 손실-의-함수에 GLA 유전자의 특정 genotypes 지도 하지 않는다 (OMIM * 300644) Fabry 질병에 발생 하지만 열역학으로 호의 보인 접는 상태가4 실패 해당 효소 . ER 보존과 달리 기능적인 효소의 조 저하 발생합니다. 유사한 결론 Pompe 질병5를 포함 하 여 다른 LSDs에 그려 왔다. 또한, 효소 이체의 분자 특성 진단6, LSD 진행은 돌연변이의 특성에 따라 개별 과정 제안 시 변이의 임상 해석을 촉진 수 있습니다. 따라서, 임상 상담 및 치료 결정을 합리화 하기 위해서는 일반적으로 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 기존의 분류를 재평가 해야 합니다.

효소 대체 요법 (ERT)는 두 질병 수 있습니다. 그러나, ERT, 두뇌와 골격 근육 등 영향을 받는 조직/장기에서 효능을 제한 했다. 또한, ERT의 치료 혜택을 위태롭게 하는 면역성 응답을 유도 수 있습니다. 약리학 보호자 (Pc)는 소위 응답 돌연변이 가진 환자에 대 한 매력적인 치료 대안 이다. Pc는 올바른 단백질 폴딩 및 차례로 바인딩과 그물 (응급실) 보존 및 응급실 관련 효소의 저하를 방지 하는 안정화에 대 한 분자 비 계 역할을 합니다. 또한, Pc 구두로 관리 될 수 있습니다 그리고 잠재적으로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 따라서, PCT에 특정 genotypes 가진 환자를 치료를 위한 더 실행 가능한 옵션이 있을 수 있습니다. LSDs 응용 프로그램 PC에 광범위 한 검토를 위해 Parenti7에 의해 우수한 검토를 참조 하십시오.

질병을 일으키는 돌연변이 체 대립 유전자의 수백의 발견 전 임상 약물 테스트에 도전 하 고 맞춤된 의학 접근에 대 한 의무가 환자가의 간단 하 고 빠른, 매우 표준화 된 평가 필요로. LSD 유전자 돌연변이의 해로운 효과 평가 하 고 예측 PCT에 대 한 의무가 환자 후보 돌연변이 테스트, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 효소 활동 측정 허용 하는 HEK293H 세포에 매우 표준화 초과 식 시스템은 개발. 유사한 이상 식 시스템 이전 COS-78,,910,11, HeLa 세포12또는 HEK293 Fabry Pompe 질병에 대 한 설명 되었습니다13 ,14,,1516 셀 glycosidase 유전자에 대 한.

아주 유사한 방법도 약리 보호자 질병의 치료에 대 한 응답을 예측 하는 "방법"으로 특허 되었습니다17 셀의 관련성을 나타내는 문화 시스템 임상 연습으로 통합 되 고.

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Protocol

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1. 준비의 돌연변이 pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 구문

참고: GLAGAA 코딩 시퀀스 (cd)에 대 한 복제 전략 보고 이전15,18되었습니다.

  1. 사이트 감독 Mutagenesis 사이트 지시 된 Mutagenesis를 사용 하 여
    1. 참조를 사용 하 여 시퀀스 NM_000169.2 및 NM_000152.4 mutagenesis GLAGAA 유전자의에 대 한 템플릿으로 각각. 고 순도 소금 무료 뇌관 (25-37-mers) 개별적으로 돌연변이 소개 하는 그들의 길이 중앙 각각 시퀀스 수정 중 하나를 들고와 antisense 뇌관으로 상업적인 공급자에 의해 합성의 세트가 있다. 무료 뇌관 설계 도구를 사용 하 여 뇌관 디자인19를 지원 하기 위해.
    2. 반응 혼합물 반응 솔루션에 대 한 표준 조건 및 제조업체에서 제공 하는 PCR 상태를 사용 하 여.
      1. 믹스 5 µ L 반응 버퍼, 10 x 10의 더블-좌초 템플릿 플라스 미드 DNA (pcDNA3.1/GLA 또는 pcDNA3.1/GAA)의 ng 125 각 뇌관의, 제공된 dNTP 혼합물의 1 µ L, 이온된 수 (최종 반응 볼륨의 적절 한 볼륨 시 약 DMSO의 3 µ L : 50 Μ L). 마지막으로, 2.5 U의 DNA 중 합 효소를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 부정적인 통제로 아니 뇌관 샘플 따라 수행.
    3. 다음 프로그램을 사용 하 여 PCR을 시작: 1 분 1: 95 ° C 단계, 단계 2: 95 ° C 50에 대 한 s, 단계 3시 60분 ° C 50에 대 한 s, 8 분 4: 68 ° C 단계, 18 번, 2-4 단계를 반복 하 고 단계 5: 68 ° C 10 분.
      1. Dpn의 1 µ L 추가 PCR, 다음 나 제한 효소 (10 U / µ L)와 추가 1 시간 동안 37 ° C에서 반응 유리병을 품 어.
  2. 변환 및 원하는 클론을 위한 심사
    1. 제조업체의 권장 사항 따라 ultracompetent 셀의 약 수를 변환 합니다. 사용 SOC 매체 (0.5% (w/v), NaCl 10 m m, KCl 2.5 m m를 추출, 121 ° c, 소독 및 살 균 필터링 솔루션 MgCl2 , 10 및 20 m m의 최종 농도까지 포도 당을 각각 추가 tryptone 2% (w/v), 효 모) 제조업체의 대신 중간입니다. 절차 후 샘플 mutagenesis는 파운드에의 플레이트 250 µ L 플레이트 포함 100 µ g/mL 암 피 실린 고 18 h 37 ° C에서 품 어.
    2. Transformants의 수는 보장 > 10 반응 생성 적어도 3 배 많은 식민지는 no-뇌관 제어 반응으로, 예를 들면, 식민지 계산을 촉진 하기 위하여 발광 격판덮개를 사용 하 여. 3 식민지를 선택 그리고 파운드 국물 매체에서 하룻밤 문화 3 mL를 준비 합니다.
    3. 다음 날, 플라스 미드 준비 표준 키트와 함께 수행 하 고 t 7을 사용 하 여 전체 시퀀스 분석 (5ʹ-TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GG-3ʹ) BGHr (5ʹ 태그 아 그 GCA CAG TCG AGG-3ʹ) 뇌관 통해 표준 생어 시퀀싱 및.
    4. 분자 생물학 적당 한 도구를 사용 하 여 시퀀스를 분석 하. 원하는 돌연변이 검출 될 때 없고 더 이상 NM_000169.2 (α-galactosidase A)에 비해 시퀀스 또는 NM_000152.4 (산 성 α-glucosidase) 본, transfection 급 플라스 미드 정화에 대 한 복제를 선택 합니다.
    5. 분 광 광도 계에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다.
      참고: 허용의 260/280 흡 광도 비율 플라스 미드 순도 항복 준비만 > 셀 1.8 문화 실험.

2입니다. HEK293H 셀의 재배

  1. 높은 포도 당 (4.5 g/L) Dulbecco´s 수정이 글 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충에 HEK293H 세포를 유지 합니다. 셀 유지 한 5% CO2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터 water-jacket.
  2. 80-90%의 밀도를 세포 배양.
  3. 매체를 발음 하 고 인산 염을 사용 하 여 버퍼링 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +염 분 (PBS) 일단 씻어.
  4. 0.05%를 추가 하 여 통로 트립 신-EDTA와 37 ° C, 5% CO25 분 동안 품 어.
  5. 영구 문화를 유지 하기 위해 새로운 T75 플라스 크로 신선한 매체와 씨앗에 셀 1시 15분을 분할 한다. 25 이상 통행으로 셀을 사용 하지 마십시오.

3. pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 플라스 미드 Transfection 그리고 HEK293H의 치료

  1. transfection, 전에 24 시간 캘리포니아2 +, Mg2 +PBS 한번 T75 셀 문화 플라스 크에서 HEK293H 셀 세척. 위에 명시 된 트립 신-EDTA 0.05% 셀과 10% 보충 500 µ L DMEM 매체를 사용 하 여 24 잘 문화 판의 구멍에 씨앗 1.5 x 105 셀 수확 FBS 항생제 없이.
  2. 제조업체의 설명서에 따라 transfection 프로토콜 수행 합니다. 일반적으로 혈 청 무료 DMEM의 100 µ L에 플라스 미드 DNA의 1 µ g의 transfection 시 약 2.5 µ L의 혼합물을 사용 합니다. 실 온에서 20 분 동안 incubate 고 그 후 drop-wise 방식으로 셀에 추가 합니다.
  3. 37 °C/5% CO2 에서 4 h 기간 transfection 시 약을 포함 하는 매체를 제거 하 고 추가 10% 신선한 DMEM의 500 µ L FBS / 1% 페니실린/스.
    참고:이 단계 1-Deoxygalactonojirimycin 염 산 염 (DGJ) 또는 1-Deoxynojirimycin 염 산 염 (DNJ) 추가할 수 있습니다 문화 매체에 의도 하는 곳 (20 µ M의 최종 농도 얻기 위해 10 mM의 수성 재고 솔루션을 사용 DGJ 및 DNJ ). 신선한 DGJ 또는 DNJ 플라스 미드 transfection 후 42 시간을 추가 되었습니다.

4. 세포 수확 및 α-galactosidase A 또는 산 성 α-glucosidase 활동 측정

  1. 셀 수확
    1. 수확의 날, 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 매체를 발음 합니다. 조심 스럽게 셀 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +PBS로 2 회 세척.
      참고:이 단계는 DGJ 및 DNJ는 α-galactosidase와 α-glucosidase의 강력한 억제제 각각, 어떤 남은 시험을 무효화 시키는 때문에 중요 한.
    2. 셀 위에 직접 이온된 수의 200 µ L를 추가 합니다. 접시에서 셀 린스를 1.5 mL 반응 관에 그들을 전송 합니다.
  2. 중지 및 재개 하 여 균질 화
    1. 적절 한 거품 랙 5 소용돌이에 샘플을 넣어 s는 세포 보다 효율적으로 만들기를. 액체 질소 10에 번갈아 샘플 넣어 s 및 실내 온도 물 목욕까지 완료 (5 분)는 녹고.
    2. 5 번이이 절차를 반복 하 고 스핀에 10000 x g 5 분에 대 한 샘플.
상쾌한 및 새로운 반응 관에 피 펫을 유지 합니다.
  • 단백질 농도 결심 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여
    1. 이온된 H2O의 40 µ L을 포함 하는 각 샘플에 대 한 신선한 튜브를 준비 하 고 샘플의 10 µ L를 추가 합니다. 짧게 vortexing에 의해 솔루션을 믹스와 10 µ L 96 잘 접시 (3 중에서 각 샘플)의 캐비티에 전송. 이온 H2O 다음과 같이 표준 곡선을 얻기 위해 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 재고 솔루션을 희석: 50 µ H L2O/50 µ L BSA; 60 µ L H2O/40 µ L BSA; 70 µ L H2O/30 µ L BSA; 80 µ L H2O/20 µ L BSA; 90 µ L H2O/10 µ L BSA; 100 µ L H2o.
    2. BCA 시 약의 200 µ L을 추가 하 여 반응을 시작 (시 약 A와 B 시 50: 1 비율로 혼합) 및 궤도 통 (300 rpm)에 약간의 동요에서 37 ° C에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어. 560에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm.
      참고: 샘플은 일반적으로 1 µ L 당 1.5 µ g 단백질 사이의 포함 되어 있습니다.
  • 인공 4-Methylumbelliferyl 기판 (4-얼굴)와 효소 활동 측정
    1. 0.05 (대 한 α-galactosidase A) 또는 (산 성 α-glucosidase)에서 0.5 µ g 단백질 / µ L 솔루션을 얻기 위해 신선한 1.5 mL 반응 관에 각 샘플의 피펫으로 계산 된 금액을 희석. 와 동 5 다시 s를 피펫으로 10 µ L를 96으로이 희석의 샘플 잘 플레이트 (중복에서 각 샘플).
    2. 반응이 각각 기판 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 시작:
      Α-galactosidase a: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-뮤-gal) 0.06 M 인산 염 구 연산 염 버퍼, pH 4.7에서에서에 대 한.
      산 성 α-glucosidase에 대 한: 2 mM 4 methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-뮤-glu) 0.025 M 아세트산 나트륨, pH 4.0에서에서.
    3. 궤도 통 (300 rpm)에 약간의 동요에서 37 ° C에서 어둠 속에서 1 시간에 대 한 효소 반응을 품 어. 1.0 M, pH 10.5 조정된 글리신-NaOH 버퍼의 200 µ L의 추가 의해 반응 종료.
    4. 다음과 같이 표준 곡선 4-methylumbelliferone (4-MU) 0.01 mg/mL 주식에서의 준비:
      100 µ L H2O / 아니 4-무; 80 µ L H2O / 20 µ L 4-무; 60 µ L H2O / 40 µ L 4-무; 40 µ L H2O / 60 µ L 4-무; 20 µ L H2O / 80 µ L 4-무; 아니 H2O / 100 µ L 4-뮤, 피펫으로 10 µ L 96 잘으로 각 희석의 (중복)에 접시와 볼륨 및 pH를 조정 하기 위하여 각 잘 하 1.0 M 글리신-NaOH 버퍼의 200 µ L를 추가.
    5. 측정 형광 판독기에 효소 활동 적절 한 필터 집합 있고 형광 판독기 장치에 대 한 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
      참고: 두 4-얼굴 기판 α-galactosidase A 또는 산 성 α-glucosidase 동안 4-무로 감소 된다. 출시 4-무 측정 될 수 있는 360와 465 nm에서 여기 및 방출 파장으로 각각 microplate 형광 판독기를 사용 하는 형광 색소 이다.
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    Representative Results

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    Mutagenesis 절차
    GLA 유전자 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 돌연변이 다음 범주 중 하나로 분류 되었다. 이 방법은 돌연변이 생성 하는 GLA 돌연변이의 66.5%에 대 한 첫 번째 시도에서 가져온 밝혔다. 약간 수정 된 두 번째 PCR 후 추가 25%를 얻을 수 있습니다.

    카테고리 1:는 mutagenesis PCR 첫 번째 시도에서 효과적 이었습니다.

    카테고리 2: 첫 번째 mutagenesis PCR 실패 (접시, 아니 삽입된 돌연변이에 식민지); 어 닐 링 온도 증가 시켜 같은 뇌관을 사용 하 여 반복 설정 68 ° C 효과적 이었습니다.

    카테고리 3: 더 많은 노력을 원하는 복제를 수행 했다 (예를 들어, 일반적으로 하나 이상의 새로운 집합이 뇌관 설계 되었다).

    Α-galactosidase A와 산 성 α-glucosidase 효소 활동 측정
    다른 돌연변이 효소의 효소 활동은 PC의 유무에 뚜렷이 transfected 세포의 이전 부 화 후 기록 되었다. 표 1 은 3 α-galactosidase A와 3 산 α-glucosidase 돌연변이 대 한 결과를 나타냅니다. 데이터 기판 매출에 대 한 절대 값 (1)로 표시 됩니다 (nmol 4-뮤 * mg 단백질-1* h-1) 및 야생 유형 효소로 표준화 (2) 상대 값으로. 두 식이 유용, 총 기판 매출에서는 반응의 효율성 때문에 정규화 된 값은 중요 한 줄 수 있는 하는 동안 시스템의 감도 한 손으로 돌연변이의 악성의 가능성에 대 한 힌트와 반면에 적용 된 PC 치료의 효율성. 실험 단계에 대 한 작업 흐름을 그림 1 에 묘사 된 설정 했다는 예정 (기술적인 이유로 인해, 도입 조건 예: 빠른 HEK293H 셀 성장) 화합물과 60 h 잠복기. 10 µ M는 DGJ14에 대 한 대략적인 최대 달성 플라즈마 농도, 현재 프로토콜 사용 하 여 20 µ M 심사의 목적을 위해 적당 한 농도 PC 응답 지 원하는 그것은 명시 하고있다 비록 수많은 이전에4,20,21,,2223작동합니다. 또한, 그것은 더 높은 플라스마 수준24도달할 수 postulated 되었습니다.

    Figure 1
    그림 1 : 작업의 흐름은 생체 외에서 효소 활동 측정. (A) 실험의 타임 라인 상대적으로 작은 손-온-소요시간 표시 시간 지점에서 90 h 셀 문화 노력을 보여줍니다. (B) 대표 플라스 미드 벡터 pcDNA3.1 GLAGAA 의 야생 타입 cd를 포함 하는 표시 됩니다. GLAGAA 야생 타입 플라스 미드와 관심의 각각 삽입된 돌연변이 포함 하는 플라스 미드 정도 HEK293H 셀 24 잘 형태로 도금 transfect에 사용 되었다. 각각 유전자 제품을 합성 하 고 효소 처리, lysosomal 전송 및 PC 작업에 대 한 수를 셀 수 있도록 기간 후 세포는 해당 소프트웨어를 사용 하 여 분석 그리고 형광 플레이트 리더에서 측정 lysed 했다. C: HEK293H 세포의 셀 형태학 및 성장 상태 실험의 시간 과정 전반에 걸쳐 표시 됩니다. 스케일 바 100 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    생체 외 효소 활동
    GLA 네이티브 20 Μ M DGJ
    돌연변이 (AA) nmol 4-낯 짝-여자/mg/h (평균) % 평균 (±SD, N) nmol 4-낯 짝-여자/mg/h (평균) % 평균 (±SD, N) 의미
    p.A143T 2384.7 29.2 (±2.6, 5) 4223.0 52.0 (±4.4, 5) ***
    p.A156V 379.2 4.3 (±. 8, 5) 1437.5 16.3 (±1.3, 5) ****
    p.R301Q 777.4 8.8 (±1.1, 5) 3002.6 44.2 (±3.6, 5) ****
    GAA 네이티브 20 Μ M DNJ
    돌연변이 (AA) nmol 4-얼굴-glu/mg/h (평균) % 평균 (±SD, N) nmol 4-얼굴-glu/mg/h (평균) % 평균 (±SD, N) 의미
    p.Y455F 41.1 5.4 (±. 4, 5) 246.6 31.4 (±2.8, 5) ***
    p.P545L 65.7 6.6 (±. 4, 5) 166.5 16.7 (± 1.5, 5) **
    p.L552P 0.0 0.0 (±. 2, 5) 104.3 10.4 (±1.4, 5) ***

    표 1: α-galactosidase A와 산 성 α-glucosidase의 효소 활동. 테이블 3 α-galactosidase A와 3 산 α-glucosidase 돌연변이 Pc DGJ 또는 DNJ 없이 대 한 대표적인 결과 보여 줍니다. 절대 효소 활동 데이터는 HEK293H 세포의 생 효소 활동에 대 한 수정 되었습니다. 내 생 효소 활동을 평가 하는 셀 pcDNA3.1 빈 벡터와 페 했다. 값은 97.5 nmol 4-뮤 * mg 단백질-1* h-1 α-galactosidase A와 41.6 nmol 4-뮤 * mg 단백질-1* h-1 산 성 α-glucosidase, 각각; 효소 활동 값 다른 돌연변이 사이 상대 값의 편차를 설명 하는 해당 실험에서 야생 타입 효소로 정규화 되었다.5 독립적인 세포 배양 실험 후 (N = 5), 각 기술 중복 실시, 표준 편차는 있을 수 없습니다 >의 평균 15%. 비율 T-테스트 치료 및 PC 처리 효소 사이의 차이 계산 하기 위해 사용 되었다.
    * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.005, * * * p < 0.001

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    Discussion

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    여기에 설명 된 프로토콜 대사의 유전 lysosomal 질병의 효소 손상 평가 대 한 강력한 결과 제공 합니다. 이 원고는 프로토콜 개정 출판 이전15입니다. 가장 중요 한 수정 포함 엄중 (, 돌연변이 벡터 구축 준비 과정), 세포 문화 프로토콜 (, HEK293H 셀 유지 보수 및 transfection 조건), 그리고 높은의 표준화 결과의 재현성에 매우 공헌한 실험 반복 (적어도 5)의 수입니다. 전부, 두 대상 유전자 mutagenesis에 쉽게 접근할 수 있으며 돌연변이의 다양성을 동시에 조립 될 수 있다. 상대적으로 높은 신호/잡음 비율 HEK293H 세포 내의 생 효소 활동은 무시할 수 1/50 (α-galactosidase A)과 지나치게 표현된 야생 유형 유전자의 1/20 (산 성 α-glucosidase) 고려 달성 했다. 따라서, 야생 유형 및 돌연변이 효소 사이 우수한 해상도가입니다. 총 단백질의 다른 금액 두 효소의 활동 분석 결과 대 한 적용은 주목 해야 한다 (0.5와 5 µ g, 각각), 산 성 α-glucosidase 활동 때문에 α-galactosidase a 보다 낮은 크기 순서

    위에서 말한 바와 같이, 많은 실험실 lysosomal glycosidases를 조사 하는 그들의 자신의 분석 실험 개발 이후 분석 결과 매개 변수는 논쟁, 자주. 시스템 셀 유형, 플라스 미드 벡터 디자인, 재배 조건, 및 약물 노출 기간의 수많은 매개 변수의 몇 가지 이름을 달라질 수 있습니다. 최근 발표 된 메타 분석 Fabry 질병에 대 한 시연 transfected 세포 모델 (예를 들어, HEK293, COS-7)의 효소 활동 기록 (와 PC 없이) 환자 파생 셀 (에서 얻은 결과 따라 크게 했다 주로 세포 또는 섬유 아 세포), 질문 관련 여부는 돌연변이에 반응입니다 PC24. 이전 보고서 환자 파생 세포 transfection 모델과 직접 비교 시연 오버 식 시스템 결론13,14손상 없이 환자의 세포에 상황을 반영. 그것은 결론 수 있습니다 따라서 수는, 특정 프로토콜에 다른 저자에 의해 얻은 결과 변경 되지 않았습니다 다른 셀룰라 시스템에 의해 응답자 정의 분기 될 수 있지만. 응답 돌연변이 대 한 현재 정의 20% 상대 효소 활동 증가 60 h 20 µ M DGJ 가진 외피 후 야생 타입 효소에 비해 5% 절대 효소 활동 증가. 포괄적인 데이터베이스, FabryCEP, α-galactosidase 돌연변이25의 수백을 위한 다른 실험적인 방법에 의해 얻은 결과의 비교를 허용 합니다.

    이러한 기준은 DGJ 및 DNJ의 임상 혜택을 예측 하기에 충분 한 여부 논란이 증상 질병을 방지 하는 데 필요한 활동의 수준 이므로, 불분명 남아 있습니다. 전 연구 제안 잔여 활동의 10 ~ 15%26제대로 작동 하려면 시스템에 대 한 충분 한 될 수 있습니다. 그러나, DGJ에 대 한 2 단계 임상 연구에서 최근에 게시 된 보고서에서 1% 활동 증가 것은 잠재적으로 도움이 환자에 대 한 초기 활동 때 정상적인27의 1% 미만. 최근 임상 결과 환자 예측 대응 Pc에 응답자의 정의 ≥20% 상대 증가 및 야생 유형 α-galactosidase의 ≥3% 절대 증가 의해 HEK293H 세포에 활동 10 µ M 가진 외피 후에 DGJ 실제로 파생 된 제안 질병 안정화 또는 신장 및 심장 매개 변수28여도 개선 임상 혜택. DGJ 이미 monotherapy Fabry 질병으로 FDA와 유럽 위원회에 의해 승인 되었습니다, 반면 DNJ Pompe 질병에서 파생 N-부 틸-DNJ 등 Pc의 과정 다른 것 처럼 보인다. DNJ monotherapeutical 접근 환자29의 일부에 심각한 불리 한 사건으로 단계 II 임상 시험 기간 동안 종료 되었습니다. 그러나, 승인 된 ERT와 함께에서 PC 치료 ERT monotherapy30에 비해 질병 기판 (glycogen) 감소에 관하여 크게 향상 된 결과 보여주었다.

    제시 방법은 다른 LSDs Gaucher, Krabbe, 테이-삭스/Sandhoff, GM1 gangliosidosis 등 다른 Pc를 확장할 수 있습니다 하지만이 특정 경우에, 어디 예를 들어 시스템의 신호/잡음 비율 만으로는 작동 하지 않을 수 것이 좋습니다. 세포의 용 해 버퍼에 세제의 추가에 glucocerebrosidase 같은 막 도약 효소의 나타낼 수 있기 때문에 세포 lysate 효소 활동 결정에 대 한 준비를 적당 한 셀 중단 메서드를 선택 하기 위해 주의 기울여야 한다 비슷한 양의 세제 동안 gaucher 질환 다른 효소를 해칠 수 있습니다. Α-galactosidase a 쥡니다 기반 셀 중단 메서드는 피해 야 한다.

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    Disclosures

    저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

    Acknowledgments

    저자 맨디 Loebert 우수한 기술 지원을 티 나 Czajka를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 편집 도움말 언어에 대 한 식물 루 오 (하버드의과 대학, 보스톤, 메사추세츠, 미국) 감사 합니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    <em>생체 외에서</em> Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정
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    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).More

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

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