전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 “고아” 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.
Lysosomal 저장 장애 (LSDs) 같은 희귀 monogenic 질병을 치료 하는 맞춤된 의학의 사용은 복잡 한 임상 시험 디자인, 높은 비용 및 낮은 환자 수에 의해 도전을 했습니다. 수백 개의 돌연변이 체 대립 유전자는 LSDs의 대부분에 연루 됩니다. 질병은 일반적으로 심각도 따라 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 분류 됩니다. 또한, 유전자 형의 분자 특성 임상 결과 예측 하 고 환자 치료를 알릴 수 있습니다. 따라서, 우리는 heterologously-Fabry Pompe 질병에서 확인 된 돌연변이 표현 하는 HEK293H 세포에 따라 간단한 셀 문화 분석 결과를 개발 했다. 유사한 분석 결과 최근 Fabry 질병에 의무가 돌연변이 약리 보호자 치료 (에서 PCT)에 대 한 식별 하기 위해 전 임상 시험으로 도입 되었습니다. 이 원고는 PCT에 대 한 적격 환자 식별 Fabry Pompe 질병 유전자 이체의 신속한 phenotypic 평가 하 고 새로운 pharmacochaperones의 개발에 도움이 있습니다 개정된 셀 문화 분석 결과를 설명 합니다.
12 lysosomal 저장 장애 (LSDs) 기본 유전자 변이 결과로 glycosidase 장애에 관련 된 이상 있다. Fabry (OMIM #301500) 병과 Pompe (OMIM #232300),1,2,3 보고 되었습니다, 이상의 500와 200 missense 돌연변이에 각각,는 총 변이 수의 약 60%에 해당 합니다. 수많은 새로운 유전자 이체는 아직도 확인 되 고, 많은 알 수 없는 의미. 광범위 한 생 화 확 적인 연구 공개 완전 한 손실-의-함수에 GLA 유전자의 특정 genotypes 지도 하지 않는다 (OMIM * 300644) Fabry 질병에 발생 하지만 열역학으로 호의 보인 접는 상태가4 실패 해당 효소 . ER 보존과 달리 기능적인 효소의 조 저하 발생합니다. 유사한 결론 Pompe 질병5를 포함 하 여 다른 LSDs에 그려 왔다. 또한, 효소 이체의 분자 특성 진단6, LSD 진행은 돌연변이의 특성에 따라 개별 과정 제안 시 변이의 임상 해석을 촉진 수 있습니다. 따라서, 임상 상담 및 치료 결정을 합리화 하기 위해서는 일반적으로 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 기존의 분류를 재평가 해야 합니다.
효소 대체 요법 (ERT)는 두 질병 수 있습니다. 그러나, ERT, 두뇌와 골격 근육 등 영향을 받는 조직/장기에서 효능을 제한 했다. 또한, ERT의 치료 혜택을 위태롭게 하는 면역성 응답을 유도 수 있습니다. 약리학 보호자 (Pc)는 소위 응답 돌연변이 가진 환자에 대 한 매력적인 치료 대안 이다. Pc는 올바른 단백질 폴딩 및 차례로 바인딩과 그물 (응급실) 보존 및 응급실 관련 효소의 저하를 방지 하는 안정화에 대 한 분자 비 계 역할을 합니다. 또한, Pc 구두로 관리 될 수 있습니다 그리고 잠재적으로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 따라서, PCT에 특정 genotypes 가진 환자를 치료를 위한 더 실행 가능한 옵션이 있을 수 있습니다. LSDs 응용 프로그램 PC에 광범위 한 검토를 위해 Parenti7에 의해 우수한 검토를 참조 하십시오.
질병을 일으키는 돌연변이 체 대립 유전자의 수백의 발견 전 임상 약물 테스트에 도전 하 고 맞춤된 의학 접근에 대 한 의무가 환자가의 간단 하 고 빠른, 매우 표준화 된 평가 필요로. LSD 유전자 돌연변이의 해로운 효과 평가 하 고 예측 PCT에 대 한 의무가 환자 후보 돌연변이 테스트, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 효소 활동 측정 허용 하는 HEK293H 세포에 매우 표준화 초과 식 시스템은 개발. 유사한 이상 식 시스템 이전 COS-78,,910,11, HeLa 세포12또는 HEK293 Fabry Pompe 질병에 대 한 설명 되었습니다13 ,14,,1516 셀 glycosidase 유전자에 대 한.
아주 유사한 방법도 약리 보호자 질병의 치료에 대 한 응답을 예측 하는 “방법”으로 특허 되었습니다17 셀의 관련성을 나타내는 문화 시스템 임상 연습으로 통합 되 고.
여기에 설명 된 프로토콜 대사의 유전 lysosomal 질병의 효소 손상 평가 대 한 강력한 결과 제공 합니다. 이 원고는 프로토콜 개정 출판 이전15입니다. 가장 중요 한 수정 포함 엄중 (즉, 돌연변이 벡터 구축 준비 과정), 세포 문화 프로토콜 (즉, HEK293H 셀 유지 보수 및 transfection 조건), 그리고 높은의 표준화 결과의 재현성에 매우 공헌한 실험 반복 (적어도 5)의 수입니다. ?…
The authors have nothing to disclose.
저자 맨디 Loebert 우수한 기술 지원을 티 나 Czajka를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 편집 도움말 언어에 대 한 식물 루 오 (하버드의과 대학, 보스톤, 메사추세츠, 미국) 감사 합니다.
Material | |||
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
Abbreviations | |||
frw = forward; rev = reverse | |||
n.a. = not applicable |