Summary

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

Published: November 03, 2017
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Summary

このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。

Abstract

マウス胚を用いた造血研究の制限は、主に胚の子宮内開発のための操作で追加の不便です。ノックアウト (KO) マウスの遺伝データが説得力のある、すべて遺伝子 KO マウスを必要に応じて生成するは現実的ではありません。さらに、生体内で実行する KO マウスから得られたデータを統合するレスキュー実験不便です。これらの制限を克服するために、大動脈性腺発生 (AGM) 培養は、造血幹細胞 (HSC) の開発を検討する適切なシステムとして開発されました。特にレスキュー実験の KO マウスの造血の障害を回復に使えます。適切な化学物質をメディアに追加すると、障害信号を再開することができます。 または調整された細道を禁じることができます。このメソッドの使用は、多くの実験は HSC の開発の重要な調整装置を識別するために実行することができます、HSC など関連する遺伝子の発現 mRNA および蛋白質レベル、コロニー形成能力および再構成能力。この一連の実験は哺乳類における HSC 開発に欠かせない根本的なメカニズムを定義するのに役立つでしょう。

Introduction

造血幹細胞 (造血)、組織固有成体幹細胞多能性赤芽球、骨髄性を含むリンパ球様細胞と自己更新する能力を持っています。最近の研究は、初期の HSCs が背側大動脈1,2 の腹側の壁で造血転移 (EHT) 血管内皮を介して hemogenic 内皮 (彼) と呼ばれる特殊な血管内皮人口に生じた示されています。 ,3,4。マウス胚における E12.5 に胚 (E) 10.5 から大動脈生殖巣中の (AGM) 地域に結成され、一度 HSCs が拡張のため胎児の肝臓に移行、最終的に個人の生活の中で成人の造血を維持するために骨髄を植民地化5,6。 これは、長年にわたって研究されている、HSC の出現と発展の基になるメカニズムの不完全な理解まま。

体外受精やゼブラフィッシュ胚の開発と違ってマウス胚の子宮内開発研究を行う決定的な造血の胚形成の間にはるかに不便。ノックアウト (KO) マウスを用いた遺伝子実験が一般に利用が特定の KO マウスの不足はまた造血研究分野での使用を制限します。さらに、レスキューを実験する生体内では、KO マウスで簡単には実行されません。1996 年以来、AGM 培養は、フィールド7の開拓者によって造血研究開発されています。この文化システムの助けを借りて、AGM 部腹側の組織は、背側の組織は、反対の効果8,9を発揮しながら、HSC の活動を促進するために識別されています。AGM 植文化システムは、セロトニン、Mpl、SCF、BMP、および HSC 開発1011,12,13,におけるヘッジホッグのロールを判断に適用されています。14します。 重要なことは、また変異胚13,15造血欠陥を救助するために使用人気のある方法です。

Protocol

動物科目を含むすべてのプロシージャは、中国科学院動物研究所の北京、中国の倫理審査委員会によって承認されている。 1 材料準備 定置滅菌、0.65 μ m フィルター紫外線光線の紫外線の下で生産 4 h 用クリーン ベンチ内でランプをレイと 2 h マークの後にフィルターを裏返して。 。 注: UV ライトを使用して、適切な保護を着用します。 滅菌オート?…

Representative Results

最近の出版物は、血管内皮細胞由来セロトニン AGM13pro のアポトーシスを阻害することによって造血の生存を促進する報告しました。HSC におけるセロトニンの促進効果を確認、フルオキセチンが含まれていた。選択的セロトニン再取り込み阻害剤 (SSRI)、としてフルオキセチンは、末梢組織16,17,<sup c…

Discussion

骨髄で成熟した造血が照射受信者の血システムを再作成することができますが知られています。異なり、これらの機能の HSCs マウス胚の AGM で新興の HSCs は熟女ではありません。直接移植結果このような私 (VE cad+ CD45 CD41+) と II 型 (VE cad+ CD45+) 前 HSCs が再構成能力20を所有していません。AGM 植文化システム、AGM 地域における初期の HSC…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Suwei Gao は、図の準備のヘルプを感謝いたします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (81530004、31425016) および科学省と中国の技術 (2016YFA0100500) からの助成金によって支えられました。J. l. が、実験を行い; 原稿を起草F. l. は、原稿を編集します。著者は両方とも読み、最終原稿を承認します。

Materials

durapore 0.65 µm filters Millipore R5BA63787 AGM explant culture
M5300 long-term culture medium Stem Cell Technologies 5300 AGM explant culture
Trizol  Tiangen 5829 RNA extration
M-MLV reverse transcriptase Promega 90694 reverse transcription
SYBR Green Qiagen A6002 quantatitive real-time PCR
protease inhibitor Roche 55622 Protein extration
collagenase Sigma C2674 digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium Stem Cell Technologies 3434 CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates Costar 3473 CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd Long-term transplantation
phosphate buffered saline Life Technologines 8115284 AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution HyClone SV30010 AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7 eBioscience 25-0454-80 Long-term transplantation
anti-CD45-FITC eBioscience 11-0451-81 Long-term transplantation
UV lamp Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD 039-14402 power: 30W
stainless steel mesh AS ONE SHANGHAI Corporation 2-9817-10  aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone Sigma H0396 selectively diluted into M5300 medium

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

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Cite This Article
Lv, J., Liu, F. Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (129), e56557, doi:10.3791/56557 (2017).

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